如何使用液相色谱
现在一般说的就是高效液相色谱（HPLC），原理如下文，但具体的操作就要看具体的仪器了，因为国内外的不同厂家生产的操作方案可能有所不同，而且你去面试要使用HPLC的话建议你最好先去找台能使用的熟悉下，毕竟这玩意的价格不是一般的。而有些普通的液相色谱就很简单了，只要你看懂了原理就能进行操作，没有什么特别的难度。
液相色谱法简介
气相色谱不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知标准作对照定性。当无纯物质对照时，定性鉴定就很困难，这时需借助质谱、红外和化学法等配合。另外大多数金属盐类和热稳定性差的物质还不能分析。此缺点可高效液相色谱法来克服。在经典液相色谱的基础上，引入了气相色谱的理论与技术，在70年代初建立了高效液相色谱分析法（以HPLC表示）。在常压下操作的液相色谱，分离一个样品往往长达几小时至几十小时，因此工作效率很低。人们曾对这种经典液相色谱法试用了柱前加压或柱后减压的办法来提高流速，以缩短分离时间，但是结果失败了。根据液相色谱理论，因为随着载液（流动相）流速的提高，板高则增大，所以柱效会显着降低。随着生产技术的提高，人们制成了细小（<10μm）而高效的填充物，从而使柱效大大提高。但是随着填充物粒度的减小，柱压降显着增大，为了得到合理的载液流速，使用了高压；输液泵，使流速达到1～10mL/min。从而使分析一个多组分样品只需几分钟到几十分钟时间。随着高效固定相、高压泵和高灵敏度检测器以及电子技术和计算机技术的应用，70年代以业逐步实现了液相色谱分析的高效、高速、高灵敏和自动化操作。因此人们常称它为高效液相色谱或现代液相色谱，以区别于经典液相色谱。高效液相色谱法的分类与经典液相色谱法一致。按固定相的聚集状态不同分为液固色谱法和液液色谱法。按分离原理不同分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱法四类。
高效液相色谱所用基本概念：
保留值等色谱分析有关术语，以及分配系数、分配比、塔板高度、分离度、选择性等方面均与气相色谱相一致；高效液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率理论也与气相色谱一致。因液相色谱以液体代替气相色谱中的气体作流动相，则速率议程H=A+B/?+C?。式中：纵向扩散项（分子扩散项）B/?对板高的影响与气相色谱不同，由于液相色谱中组分分子在流动相中的扩散系数Dm仅为气相色谱中的万分之一，因此纵向扩散项对板高的影响可以忽略不计。于是影响液相色谱的主要因素是传质项Cu。由图14—可知，气相色谱（GC）的流动相流速u增大时，板高H显着增大（即柱效显着降低），而液相色谱（LC）的流速增大时，板高增大不显着（即柱效降低不显着）。这说明高效液相色谱也有很高的分离效能，此外，气相色谱的载气权数种，其性质差别也不大，对分离效果影响也不大。而液相色谱的载液种类多，性质差别也大，对分离效果影响显着。因此流动相的选择很重要，并且在选择流动相对应注意以下几点：流动相对样品有适当的溶解度，但不与样品发生化学反应，也不与固定液互溶；流动相的纯度要高（至少分析纯）、粘度要小，以免带进杂质和组分在流动相中扩散系数下降；流动相应与所用检测器相匹配，不应对组分检测产生干扰作用。高效液相色谱不但具有高效、高速、高灵敏度的特点，还由于它的流动相（载液）种类比气相色谱的流动相（载气）多，因此可选用两种或多种不同比例的液体作流动相，从机时可提高选择性。此外，液相色谱的馏分比气相色谱易于收集。便于为红外、核磁等方法确定化合物结构提供纯样品。由于高效液相色谱法具有以上特点，它适于分离、分析沸点高、热稳定性差、分子量大（大于400）的气相色谱法不能或不易分析的许多有机物和一些无机物，而这些物质占化合物总数的75～80%。因此它已广泛用于核酸、蛋白质、氨基酸、维生素、糖类、脂类、甾类化合物、激素、生物碱、稠环芳烃、高聚物、金属螯合物、金属有机化合物以及多种无机盐类的分离和分析。但是，高效液相色谱的固定相的分离效率、检测器的检测范围以及灵敏度等方面，目前还不如气相色谱法。此外对于气体和易挥发物质的分析方面也远不如气相色谱法，因此高效液相色谱法和气相色谱法配合使用可互相取长补短，相辅相成。
1.分离原理
凝胶色谱，又称空间排阻色谱。它是利用某些凝胶对混合物各组分因分子量不同，其阻滞作用也不同而进行分离、分析的方法。凝胶色谱的分离要理和其它色谱法不同，它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径要比分子筛大得多，一般为几百至几千埃。色谱柱内填充具有一定大小孔穴的凝胶。当样品进入色谱柱后，不同大小的样品分子（图14—2中以黑点表示）随流动相沿凝胶颗粒（图14—2中以空心圈表示）外部间隙和凝胶孔穴旁流过，体积在的分子因不能渗透到凝胶孔穴里而得到排阻，因此较为顺利地通过凝胶柱而较早地被流动相冲洗出来。中等体积的分子产生部分渗透作用，小分子可渗透到凝胶孔穴里去而受阻滞，因有一个平衡过程而较晚地被流动相冲洗出来。这样，试样组分基本上按分子大小受到不同阻滞而先后流出色谱柱，从而实现分离目的。光凝胶色谱采用水溶液作流动相进，称为过滤凝胶色谱（HFC），而用有机溶剂为流动相时，称为凝胶渗透色谱（GPC）。
2．固定相
凝胶色谱的固定相凝胶，是含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，是一种经过交联而具有立柱网状结构的多聚体。根据凝胶的交联程度和含水量的不同，分了软质、半硬质和硬质三种。软质凝胶（如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等）交联度低，膨胀度大，容量大，可压宿，不能用于高压（使用压力低于3.5kg/㎝2或更低），主要用于含水体系的常压凝胶色谱，半硬质凝胶（如苯乙烯一二乙烯基苯交联共聚凝胶），容量中等，渗透性较高，压力可用到70kg/㎝2。适用于非水溶剂流动相；硬质凝胶（如多孔硅胶、多也玻球等），膨胀度小，不可压缩，渗透性好，可耐高压，适于高流速下操作。
3．流动相
在凝胶色谱中，为提高分率效率，多采用低粘度、与样品折光指数相差大的流动相。常用的流动相有苯、甲苯、邻二氯苯、二氯甲烷、1，2一二氯乙烷、氯仿、水等。
相图中，红线是甲苯和苯混合溶液沸点时的液相组成部分，绿线是甲苯和苯混合溶液沸点时的气相组成部分。纵坐标是温度，横坐标是甲苯和苯的比例。
纯甲苯在气相和液相共存的点是tE点，也就是甲苯的沸点，温度高于tE全是气体，温度低于tE，全是液体。纯苯在相图右面对应的另一点。
(2) 由于UHMWPE分子量过高，需要注意所用PS标样上限分子量，可能需要在50度下进行测定，温度升高，提高保留时间，减小测量误差；
(3) GPC测定一般得到数均分子量，进行换算吧。
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2.甲苯属于烃,所有的烃都不溶于水（个别的微溶,如乙炔）
m/z = 92的峰，为分子离子峰。
m/z = 91的峰，为环庚三烯正离子的峰，这说明该物质含有 苯环-CH2- 结构。
再结合分子式C7H8（通常需要知道分子式才能通过质谱图来确定一个物质），即可判断该物质为甲苯。
m/z = 65的小峰，为环戊二烯正离子的峰，环戊二烯正离子是环庚三烯正离子裂解得到的。
m/z = 39的小峰，为环丙烯正离子的峰，也是环庚三烯正离子裂解得到的。
以上两点也是 C6H5-CH2- 结构苯环的特征峰。
质谱图来自物竞化学品数据库，源温度230℃，样品温度55℃，电子能量75eV。
苯环上电子云密度越大，越有利于亲电取代反应的进行，这就是活化了苯环；
同时，苯环是一个共轭体系，当受到外界电荷影响时，此共轭体系将以其自身的方式容纳此多余的正或负电荷，最终结果是苯环上与甲基相连的C的邻位和对位电子云密度升高值最大，因此下一个基团进入邻位和对位。
也可以从甲苯共振式的结构看出，在几种可能性中，只有取代基在邻对位时，存在最稳定结构。
PS：是与甲基直接相连的C原子电子云密度最高高，但这个C又不能反应，所以说活化了邻对位，邻对位电子云密度比较高
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苯（Benzene，）是一种碳氢化合物，也是最简单的芳烃。在常温下苯为一种无色、有甜味的透明液体，并具有强烈的芳香气味。苯可燃，有毒，也是一种致癌物质。苯是一种石油化工基本原料。苯的产量和生产技术水平是一个国家石油化工业发展水平的标志之一。甲苯则是苯的同系物，亦名“甲基苯”、“苯基甲烷”。
甲苯
甲苯是有机化合物，属芳香烃，结构简式为。甲苯是最简单、最重要的芳烃化合物之一。在空气中，甲苯只能不完全燃烧，火焰呈黄色，具有类似甲苯苯的芳香气味，沸点（常压）110.63℃，熔点-94.99℃。凝固点为-95℃，密度为0.866克／厘立方米。甲苯温度计正是利用了它的凝固点比水银低，可以在高寒地区使用；而它的沸点又比水的沸点高，可以测110.8℃以下的温度。因此从测温范围来看，它优于水银温度计和酒精温度计。另外甲苯比较便宜，故甲苯温度计比水银温度计也便宜。
甲苯在常温常压下是一种无色透明，清澈如水的液体，对光有很强的折射作用（折射率：1.4961）。甲苯几乎不溶于水(0.52克/升)，但可以和二硫化碳、酒精、乙醚以任意比例混溶，在氯仿、丙酮和大多数其他常用有机溶剂中也有很好的溶解性。甲苯的黏性为0.6毫帕斯，也就是说它的黏稠性弱于水。甲苯的热值为40.940千焦/千克，闪点为4 ℃，燃点为535 ℃。蒸气和空气形成爆炸性混合物，爆炸极限1.2%～7.0％（体积）。甲苯溶解溴后，在光照条件下，甲基上的氢原子被溴原子取代（与甲烷相似），而在铁作催化剂条件下，苯基上的氢原子被溴原子取代（与苯相似）；但甲苯分子中存在着甲基和苯基的相互影响，使得甲苯又具有不同于苯和甲烷的性质，如苯环上的取代反应（卤化、硝化等），甲苯比苯容易进行，甲苯分子中的甲基可以被酸性高锰酸钾溶液氧化。
在氧化反应中（如与酸性高锰酸钾溶液），甲苯能由苯甲醇、苯甲醛而最终被氧化为苯甲酸。甲苯主要能进行自由基取代、亲电子取代和自由基加成反应。亲核反应则较少发生。 在受热或光辐射条件下，甲苯可以和某些反应物(如溴）在甲基上进行自由基取代反应。 甲苯与硝酸发生取代反应生成三硝基甲苯(TNT)。
甲苯不溶于水，但溶于乙醇和苯的溶剂中。甲苯容易发生氯化，生成苯—氯甲烷或苯三氯甲烷，它们都是工业上很好的溶剂；它可以萃取溴水中的溴，但不能和溴水反应；它还容易硝化，生成对硝基甲苯或邻硝基甲苯，它们都是染料的原料；它还容易磺化，生成邻甲苯磺酸或对甲苯磺酸，它们是做染料或制糖精的原料；1份甲苯和3份硝酸硝化，可得到三硝基甲苯（俗名TNT）。甲苯的蒸汽与空气混合形成爆炸性物质，因此它可以制造梯思梯炸药。
烟草种植
甲苯是石油的次要成分之一。在煤焦油轻油（主要成分为苯）中，甲苯占15%~20%。我们周围环境中的甲苯主要来自重型卡车所排的尾气（因为甲苯是汽油的成分之一）。许多有机物在不完全燃烧后会产生少量甲苯，最常见的如：烟草。大气层内的甲苯和苯一样，在一段时间后会由空气中的氢氧自由基（OH*)完全分解。
甲苯与苯的性质很相似，是工业上应用很广的原料。但其蒸汽有毒，可以通过呼吸道对人体造成危害，使用和生产时要防止它进入呼吸器官。
甲苯主要由原油经石油化工过程而制成。作为溶剂它用于油类、树脂、天然橡胶、合成橡胶、煤焦油、沥青、醋酸纤维素，也作为溶剂用于纤维素油漆和清漆以及用为照相制版、墨水的溶剂。甲苯也是有机合成，特别是氯化苯酰、苯基、糖精、三硝基甲苯和许多染料等有机合成的主要原料。它也是飞机和汽车汽油的一种成分。
甲苯具有挥发性，在环境中比较不易发生反应。由于空气的运动使其广泛分布在环境中，并且通过雨和从水表面的蒸发使其在空气和水体之间不断地再循环，最终可能因生物的和微生物的氧化而被降解。对世界上很多城市空气中的平均浓度进行汇总，结果表明甲苯浓度通常为112.5～150毫克/立方米，这主要来自于汽油有关的排放（汽车废气、汽油加工），也来自于工业活动所造成的溶剂损失和排放。
甲苯是基本有机原料之一，大量由于提高辛烷值汽油组分和多种用途的溶剂。从甲苯中可以衍生出许多种化工原料，例如：苯、二甲苯、苯甲酸、甲苯二异氰酸脂、氯化甲苯、甲酚和对甲苯磺酸等。这些原料可进一步制造合成纤维、塑料、炸药和染料等。
甲苯也是重要的化工原料。危险特性：易燃，其蒸气与空气可形成爆炸性混合物。遇明火、高热极易燃烧爆炸。与氧化剂能发生强烈反应。流速过快，容易产生和积聚静电。其蒸气比空气重，能在较低处扩散到相当远的地方，遇明火会引着回燃。 甲苯又是燃料的重要成分。使用甲苯的工厂、加油站，汽车尾气是主要污染源。城市空气中的甲苯，主要来自于汽油有关的排放及工业活动造成的溶剂损失和排放。贮运过程中的意外事故是甲苯的又一个污染源。甲苯能被强氧化剂氧化。
甲苯为一级易燃物，其蒸气与空气的混合物具爆炸性。发生爆炸起火时，冒出黑烟，火焰沿地面扩散。进入起火现场，眼睛会流泪且与咽喉皆感刺痛、发痒，并可闻到特殊的芳香气味。
进入人体的甲苯，可迅速排出体外。甲苯易挥发，在环境中比较稳定，不易发生反应。由于空气的运动，使其广泛分布在环境中。水中的甲苯可迅速挥发至大气中。甲苯毒性小于苯，但刺激症状比苯严重，吸入会出现咽喉刺痛感、发痒和灼烧感；刺激眼黏膜，会引起流泪、发红、充血；溅在皮肤上局部会出现发红、刺痛及疱疹等。重度甲苯中毒后，或呈兴奋状：躁动不安，哭笑无常；或呈压抑状：嗜睡，木僵等，严重的会出现虚脱、昏迷。甲苯微溶于水，当倾倒入水中时，可漂浮在水面，或呈油状分布在水面，会引起鱼类及其他水生生物的死亡。受污染水体散发出苯系物特有刺鼻气味。
