请问有谁知道核酸引物和探针PAGE纯化的步骤？？？
第20章 细胞基因分离鉴定和原位杂交
第一节 细胞DNA、RNA的分离鉴定技术
一、培养细胞基因组DNA的提取及鉴定
人和哺乳动物细胞基因组DNA的分离通常是在有EDTA、Sarkosye等一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚、氯仿抽提，经RNase处理和纯化来提取DNA，可用于细胞凋亡中对所引起DNA断裂、凝胶电泳呈现“梯形”条带的实验，在细胞凋亡章节中已介绍了有关DNA的提取和凝胶电泳鉴定，除此之外，提取纯化的DNA还可用于分析其结构，序列限制性内切酶片断长度多态性及其基因定位和克隆。
(一)DNA提取方法：
(1)取单层细胞，经无钙、镁PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞悬液经PBS洗2次,弃上清，取细胞沉淀。
(2)加入2ml细胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1%SDS)充分混匀，加入蛋白酶K至终浓度为0.5～1g/L、Sarkosye终浓度为0.5%，混匀裂解蛋白呈糊状。
(3)50℃水浴2小时，转入37℃水浴过夜，次日加入等体积的饱和酚，轻轻颠倒混匀，以防止DNA断裂，约3分钟。
12000r/min离心15分钟（室温）
(4)取水相，再加入等体积酚/氯仿(1:1),同样颠倒混匀，去除蛋白质
12000 r/min离心15分钟（室温）
(5)再重复步骤(4)，再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次
(6)取水相，再加入等体积氯仿，去除酚及蛋白质，颠倒混匀
12000 r/min离心15分钟（室温）
(7)取水相，加入2倍体积的预冷无水乙醇，沉淀DNA，混匀-20℃放置1小时
12000 r/min离心15分钟（室温）
(8)用70%乙醇洗涤一次，按上法离心将沉淀真空干燥10分钟。
(9)加入RNase A至终浓度100mg/L，37℃水浴消化1小时，消化污染的RNA。
(10)加入蛋白酶K至终浓度0.4g/L、Sarkosye至终浓度0.5%，混匀，50℃水浴2小时，加入Nace至终浓度10mmol/L。
(11)用等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。
(12)吸上清，加入氯仿/异戊醇(24:1)，按上法再抽一次。
(13)取水相，加入2倍体积预冷无水乙醇，-20℃ 1小时。
(14)取沉淀用70%乙醇洗一次，真空干燥10分钟后溶于少量TE中，4℃贮存。
(二)DNA纯度检测及含量计算
DNA浓度用紫外分光光度计测定，核酸的光吸收值位于波长260nm处，蛋白质则位于280nm，分别测定后，其OD260/OD280的比值应大于1.75.低于此值，说明DNA中仍残留较多的蛋白质，此时可用酚、氯仿继续抽提纯化。若比值大于1.9表明DNA链破坏，断裂严重，已成为小分子，因此操作应轻柔。
取少许DNA溶液，经紫外线扫描，吸收峰值位于波长260nm处，其纯度应为OD260/OD280=1.8
OD260值为1的溶液大约含50μg/mL DNA，故DNA的浓度(μg/mL)=OD260值×50mg/L×稀释倍数。
DNA总量(μg)=DNA浓度(μg/mL)×总体积(mL)
DNA分子量大小测定，可用含溴化乙锭的1%琼脂凝胶电泳法测定，根据加入标准品片断的电泳迁移距离计算样品片断分子量大小，此技术还可用作分离基因组DNA，进一步进行Southern吸印分析。
二、培养细胞总RNA的提取及鉴定
细胞中含有三类RNA即rRNA、mRNA和tRNA，其中mRNA传递蛋白质全部遗传信息是克隆表达功能性蛋白基因的最佳来源，是蛋白质合成的场所,有特殊意义,不同的细胞所表达某种蛋白的mRNA的种类和产量是不同的，为了提高细胞转录的mRNA的种类和产量，通常需加入诱导剂来对细胞进行刺激培养，如抗原、病毒、PHA、ConA、LPS等。
提取细胞总RNA的方法，常用强烈变性剂如盐酸胍溶液处理细胞，我们在细胞凋亡的bcl-2基因的RT-PCR法基因克隆中介绍了异硫氰酸胍一步法，但不纯，本文介绍用盐酸胍来裂解细胞可导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，可利于提取总RNA，也可从总RNA中提取mRNA，从而分析mRNA表达量，建立cDNA文库，以及对mRNA的调控和进行反义RNA研究。
变性液：7mol/L盐酸胍，25m mol/L棕檬酸钠pH7.0，0.5%Sarkosye，0.1mol/L β-巯基乙醇。
水平衡酚：在饱和酚中加入等体积DEPC处理的三蒸水(或新鲜无菌的三蒸水)混匀后去除水相，再重复处理二次即可。
所用玻璃、塑料制品、金属器材可用0.1% DEPC水浸泡过夜后消毒无菌，其中玻璃、金属器材也可用180℃干烤6小时，以去除被污染的RNA酶。
(一)总RNA的提取方法：
1、消化收集细胞方法同前。
2、向离心管中的细胞沉淀物中加1.5mL变性液，立即充分混匀。
3、加入1.5mL水平衡酚、0.15ml 2mol/L乙酸钠PH4.0、以及0.05mL氯仿，剧烈振荡混匀30秒后，立即置冰上放置15分钟，4℃ 12000r/min离心15分钟。
4、取水相，加入等体积酚/氯仿(1:1)混匀，剧烈振荡10分钟，4℃12000rpm离心15分钟。
5、取水相，加入等体积氯仿，剧烈振荡10分钟，再同上离心，再如此反复抽提一次后取水相，加入等体积的预冷的异丙醇(或异戊醇)混匀，低温放置20分钟，再同上离心。
6、取沉淀用70%预冷乙醇洗两次，干燥10分钟，溶于DEPC处理的三蒸水中以溶解RNA，分装,-20℃冻存。
(二)总RNA的鉴定及含量计算
1、RNA纯度及含量测定
取少量提取的RNA，经紫外线扫描，吸收峰位于波长260nm处，RNA纯度为OD260/OD280=1.8～2。
OD260值为1的RNA溶液约含有40μg/mL，故RNA浓度(μg/mL)=OD260值×40μg/mL×稀释倍数。
2、RNA分子量大小鉴定
2.1 配液：
(1)10×MOPS电泳缓冲液配制
将41.2g[2-(N-玛琳代)丙磺碱，2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MOPS]溶于800mL经DEPC处理的50mmol/L乙酸钠液中，用2mol/L NaoH调整pH至7.0，加入20mL经DEPC处理的0.5mol/L EDTA(pH8.0)，再加经DEPC处理的水至总体积为1000mL过滤除菌，避光室温保存。
(2)甲醛加样缓冲液：1mmol/L EDTApPH8.0、0.25%溴酚兰、0.25%二甲苯青FF、
50%甘油
2.2 操作步骤：
(1)制平板胶：1.2%琼脂糖煮沸，冷却至60℃，加入10×MOPS缓冲液及甲醛溶液，使三者的比例为3.5:1.1:1，或三者的终浓度分别为1.2%、1及10%，于室温放置30分钟或更长时间，使胶凝固。
(2)在无菌离心管中混合下列液体。
RNA(最多30μg) 4.5uL
10×MOPS电泳缓冲液 1.0uL
甲醛 3.5uL
65℃温育15分钟，水浴冷却、离心
(3)加入2ul DEPC处理的加样缓冲液上样，进行电泳，5V/cm电压，3小时直到溴酚兰至胶的中部，可用已知RNA标本作分子量标准品，如28srRNA或9S兔β-球蛋白mRNA。
(4)电泳完毕，取出凝胶，浸泡在溴化乙锭溶液中(终浓度0.5g/L)染色30～45分钟，紫外透射仪观察分子量大小。
第二节 核酸蛋白转移电泳及杂交
一、DNA Southern Blot及杂交
本技术可用于基因组DNA特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性内切酶长度多态性，对遗传性疾病的早期基因诊断、产前诊断或基因变异等方面的研究有应用价值，其过程包括：样品DNA内切酶水解、水解片断的琼脂糖凝胶电泳分离、分离后水解片断的转移(固定)、特异性DNA片断的分子杂交及放射自显影。
(一)样品DNA内切酶水解
限制性内切酶(RE)可裂解双链DNA，每种酶其特点是具有高度特异性的DNA裂解点和不同电离子强度的特殊反应条件。不同产品其反应条件不同，应根据说明书操作。单位(U)RE活性是在37℃ 1小时内能将1μg DNA所有特异性位点切断的酶用量。若用两种以上不同的内切酶，要注意RE的最适盐浓度，要由低向高逐级添加适量盐逐个进行DNA切割。
1、配液：10×限制性酶消化缓冲液
10×buffer O—无盐：100mmol/L Tris HCL pH7.4
1mg/mL BSA
100mmoL/L MgCL2
10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)
10×bnffer L—低盐：缓冲液O
0.5mol/L Nacl
10×bnffer H—高盐：缓冲液O
1.0mol/L Nacl
2、操作步骤：
(1)将DNA(0.2～1.0μg)溶液加入EP管中,并加入适量H2O总体积为18μL，混匀。
(2)加入2mL 10×限制酶缓冲液，根据厂家建议的盐浓度选择不同的缓冲液。
(3)加1～2U限制性内切酶充分混合。
(4)37℃温育适当时间，时间需先进行预试验，摸索所需消化的时间，通常用琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶解充分，各片断分子量从大到小分布均匀。
(5)加入0.5mol/L EDTA pH8.0使达到终浓度为10mmol/L终止反应。
(6)消化后的DNA直接进行琼脂糖电泳，方法同前，可用于分析或Southern Blot。
(二)Southern Blot及杂交。
将经电泳走在琼脂糖中的DNA变性、中和后，以毛细管作用在高盐缓冲液中转移至硝酸纤维膜上，再用放射性探针检测与之杂交的DNA。
1、配液：
(1)变性溶液：1.5mol/L Nacl 0.5mol/L NaoH
(2)中和溶液：200mL 20×SSC
100mL 1mol/L HCL
100mL 1mol/L Tris HCL pH8.0加水至500mL。
(3)20×SSC： 在800mlH2O中溶解175.3g Nacl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/L NaoH调pH至7.0加水至1000ml，高压消毒灭菌。
(4)预杂交液：12.5mL 1mol K3 PO4 pH7.4
125mL 20×SSC
25mL100×Denhardt'S溶液
5mL 5mg/mL鱼精DNA
250mL 100%去离子甲酰胺
82.5mL H2O(总体积为500mL)
(5)100×Denhardt'S液：10g聚蔗糖(Ficoll400)
10g聚乙烯吡咯烷硐
10g牛血清白蛋白(组分V)
加H2O至500ml
2、操作步骤(如图20-1)：
图20-1 Southern Blot装置图
(1)内切酶消化的DNA，总体积为50uL，加入10uL加样缓冲液进行12-24琼脂糖电泳。
(2)用溴化乙锭染色，紫外灯下观察并照像，在胶的旁边放一尺子。
(3)将电泳胶取出，用以下各溶液浸泡处理，同时轻轻摇动：
500mL 0.2mol/L HCL 10分钟，水洗若干次
500mL变性液中浸泡15分钟×2
500mL中和溶液浸泡30分钟。
(4)剪一张硝酸纤维素膜，每边小于胶3mm。
(5)剪3～5层滤纸，大小每边比硝酸纤维膜小7mm，再剪一张滤纸，比胶的宽度长30～40cm，在一盘中加入数百毫升20×SSC，盘上搭一块玻璃，滤纸可从玻璃双侧浸到盘中的溶液。
(6)逐层放置滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜，其上再铺滤纸及吸水纸，并加以重物，胶和硝酸纤维膜之间不可有气泡，转移24～36小时
(7)取出该膜，用圆珠笔标记方向，放入2×SSC中5分钟，用滤纸吸干,80℃烘烤2小时。
(8)将该转移膜放在塑料袋中，加入6～10mL预杂交液，排出气泡，封口，42℃ 3小时或过夜。
(9)将标记的DNA探针煮沸5分钟，立即冷却，加入杂交液中，浓度为5×105 CPM/ML。
(10)倒去预杂交液，加入含探针的杂交液封口，42℃ 6h或过夜。
(11)取出转移膜，按以下条件洗膜
1×SSC，0.1%SDS室温2×15分钟
0.25SSC，0.1%SDS,42℃ 2×15分钟，气中干燥。
(12)将杂交后的膜曝光于X光片，暗盒中放射自显影2～7天，-70℃。
(13)X片显影、定影，然后读片
结果分析：此杂交技术可以对基因结构进行分析。杂交阴性带的大小，分布规律及根据带条信号强度测量其含量。
二、RNA Northern Blot及杂交
此法是将RNA分子在变性琼脂糖凝胶中可相互分离，随后将RNA转移至硝酸纤维素滤膜上，用放射性标记的探针进行DNA-RNA杂交，此法是研究RNA(特别是mRNA)的主要方法之一，可测量RNA的含量和大小。
1、配液：Northern 预杂交液：12.5m 1mol/L K3PO4 pH7.4
125mL 20×SSC
25mL100×Danhardt's液
5mL 5mg/mL 鱼精DNA
250mL 100%去离子甲酰胺
加H2O 至500mL-20℃贮存
Northern 杂交液：500mL预杂交液加入标记探针及10%磷酸葡聚糖。
2、操作步骤：
(1)RNA变性电泳方法同前
(2)待溴酚兰走至胶的中部时，用水清洗胶数次，放置于500mL 10×SSC中浸泡45分钟，轻轻摇动。
(3)测量胶的大小，按下列顺序，从下向上为①横跨玻璃双侧的滤纸，双边可浸至20×SSC溶液；②胶；③硝酸纤维素滤膜；④亲和层吸纸；⑤吸水纸；⑥重物、转移4～6小时。
(4)取出滤膜80℃烘烤2小时。
(5)用6～10mL Northern预杂交液，42℃预杂交过夜。
(6)将已标记的探针煮沸，立即冷却，加入6～10mL Northern杂交液。
(7)去除预杂交液，加入含探针的杂交液，42℃，杂交过夜。
(8)按下列条件洗膜：1×SSC 0.1%SDS室温2×15分钟
0.25×SSC 0.1%SDS室温2×15分钟
(9)曝光于X光片暗盒中放射自显影1天。显影，定影，根据自显影条带的位置判定特定片断的位置和顺序，也可测含量。
三、蛋白Western Blot及分析
此项技术是一种蛋白质的固定和分析技术，是将已用聚丙烯酰胺凝胶或其它凝胶或电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维滤膜上，固定在滤膜上的蛋白质成分仍保留抗原活性及与其它大分子特异性结合的能力，所以能与特异性抗体或核酸结合，其程序Sonthern Blot相似，故称为Western Blot,第一抗体与膜上特异抗原结合后，再用标记的二抗(同位素或非同位素的酶)来检测，此方法可检测1ng抗原蛋白。
1、配液：
(1)转移电泳缓冲液：20mmol/L Tris HCL pH8.0
150mmol/L 甘氨酸
加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸于4L水中，加入1200mL
甲醇，加水至6L
(2)丽春红S溶液：0.5%丽春红S
1%乙酸
2、操作步骤（如图20-2）：
图20-2 Western Blot装置图
(1)用已制备好的SDS-PAGE分离的蛋白凝胶。
(2)用一张滤纸，剪成与胶同样大小，在转移电泳缓冲液中预湿，放在Scotch-Brit Pad上，在胶的阴性端放上滤纸，胶的表面用该缓冲液浸湿，排出所有气泡。
(3)在胶的阳极面放置同样大小浸湿的硝酸纤维素膜，排出气泡，再在滤膜的阳极端放置一张滤纸，排出气泡，再放一个Scotch-Brit Pad。
(4)将以上“三明治”样装置放入一个塑料支撑物中间，将支撑物放入电转移装置中，加入电转移缓冲液。
(5)接通电源：使胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电压为14V 4℃转移4小时或过夜。
(6)将滤膜放入丽春红S溶液中5分钟，蛋白染色水中脱色2分钟，照像，用印度墨水将分子量标准染色，在水中完全脱色。
(7)将滤膜放在塑料袋中，每3张加入5mL封闭缓冲液(1克速溶去脂奶粉溶于100ml PBS中)，封闭特异性抗体结合位点，室温1h，摇动，倒出封闭缓冲液。
(8)在封闭缓冲液中稀释第一抗体，加入后室温放置1小时，将滤膜转到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，摇动。
(9)在封闭缓冲液中稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，重复步骤8。
(10)将滤膜放在100mL新配制的DAB底物溶液中，大约2～3分钟就可显色，用水冲洗终止反应、照像。
结果分析：分析阳性(显色)条带的分子量大小，而且根据信号(颜色)强弱分析蛋白表达量。
第三节 细胞的原位杂交技术
原位杂交(ISH)是一种可在细胞涂片、组织切片以及分裂中期染色体带中检测DNA或RNA的技术，此方法原理是由DNA或RNA的序列与互补的标记单链DNA/RNA探针结合形成标记的双链杂交分子，本技术可对组织细胞原位的待测核酸分子进行定性，定量及定位分析。在细胞分化调节、基因定位、肿瘤遗传学、分子病理学、病毒学等领域得到广泛应用。经典的原位杂交技术包括载玻片处理，组织细胞的固定，探针的制备或选购，原位杂交，洗涤以及检测，其中探针制备技术不属于本章专业技术，故不作具体评叙，略交待制备使用原则。本章节主要介绍培养细胞的原位杂交技术。
一、探针的制备原则和选择
探针为RNA或双链、单链DNA，双链探针较单链探针有很多缺点，探针必须变性、复性，降低了探针杂交效率，双链探针在溶液中形成长的链状结构倾向，限制了它的组织穿透能力。适用于基因组DNA杂交。由于原位杂交的探针将与高密度的细胞融合，因此，需要减短探针的长度或增加探针的浓度，但是过高浓度的探针往往会增加非特异性结合，因此每种探针应选择适当的浓度。
探针的获得常采用随机引物延伸法的PCR合成和扩增，可获大量的DNA探针，或利用带有噬菌体强启动子多克隆位点的质粒载体来合成RMA探针，也可利用质粒菌扩增质粒，经酶切后纯化的基因片断，均可以获得制备探针原料。这些探针可以用同位素标记，也可以用非同位素标记，即光敏生物标记或地高辛配基标记于脱氧脲嘧啶三磷酸核苷(dUTP)上形成的地高辛-dUTP，可通过随机引物或缺口平移法与探针的核酸分子相连，构成地高辛一配基标记的核酸探针。比探针可用抗地高辛抗体偶联酶或荧光素通过松体结合和底物显色或产生荧光来检测。
这些探针基本均有市售，无需自行制备，只要根据说明书使用即可。
二、载玻片和盖玻片预处理
为了防止探针的非特异贴附而保证细胞粘附而需处理：
1、用于检测RNA的载玻片的处理
(1)用0.1mol/L HCL洗载玻片20分钟，再用无水乙醇洗数次使其干燥。
(2)在下列溶液中，65℃处理2小时
3×SSC 0.02%FicoLL400 0.02%聚乙稀吡咯烷酮(PVP)。
(3)固定在乙醇/乙酸(3:1 V/V)20分钟，180℃烘烤2小时。
2、用于检测DNA的载玻片的处理
以TESPA(three-amino-propyl-triethoxy-silane)涂载玻片。
3、对于盖玻片：于0.1mol/L HCL中浸泡20分钟，用无水乙醇洗，干燥后用二甲基氯化硅硅化，180℃烤2小时。
三、组织细胞固定
理想的细胞固定过程应该保护细胞形态，同时确保目的基因DNA或RNA序列暴露。对于RNA-RNA原位杂交有效的固定剂是4%多聚甲醛和PLPD（磷酸缓冲液PBS、赖氨酸、过碘酸盐及重酪酸盐）。
1、涂片细胞原位杂交固定
(1)用含有0.02%EDTA的PBS洗涤细胞，于0.1%胰蛋白酶消化，收获细胞计数，涂载玻片上。
(2)若检测RNA，固定于4%多聚甲醛pH7.0，在4℃下放60分钟，PBS洗5分钟，系列乙醇脱水干燥，-20℃保存。
(3)若检测DNA，固定在4%多聚甲醛16～24小时，0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分钟，浸泡在下述溶液中2×5分钟：
0.25%(v/v)Tritonx-100；0.25%(v/v)Nonidet P40；0.1mol/L Tris-HCL pH7.4；再用0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分钟。
(4)在100μg/ml蛋白酶K，50mmol/L Tris-HCL PH8.0，5mmol/L EDTA溶液中，37℃处理10分钟，再用含有甘氨酸的0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分钟。
(5)在20%(v/v)乙酸中40℃处理15分钟，0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分钟。
注意：对于DNA-DNA原位杂交多聚甲醛或福尔马林均可，但对于地高辛检测法必须用4%多聚甲醛，固定至少16小时，而且用蛋白酶K处理，这样可明显减少背景染色。
四、原位杂交
原位杂交与盐浓度、温度、甲酰胺浓度、pH等有关，DNA复性的温度是16～32℃，DNA-RNA原位杂交，25℃最佳，RNA-DNA杂交，可用较高温度，在pH5～9范围内复性率基本上与pH无关。最好选用温和的碱性条件。甲酰胺有机溶剂可降低双链核酸的稳定性，可避免杂交过程中处于过高的温度，防止高温破坏组织。
(一)同位素标记DNA探针的原位杂交
同位素标记的DNA探针，敏感性高，但要注意非特异结合，如35S标记探针在杂交前，用未经标记的dUTP预杂交，可减少非特异，可获较好的细胞内定位，此外还常用3H或125I标记探针，但3H放射线弱，自显影需100天曝光，不太理想，方法如下：
(1)取已形成单层的细胞的盖玻片，悬浮细胞可采用离心法，将细胞粘附到涂有明胶的载玻片上。组织印片，冰冻切片等标本。
(2)将标本浸入甲醇固定5分钟，再过3次4℃预冷的10%三氯醋酸。
(3)将细胞片标本浸入70%乙醇脱水，空气干燥，这时培养细胞盖玻片应该用中性树胶固定于载玻片上，注意细胞面向上。
(4)将细胞片放置在金属盘内，并将托盘放入43℃水浴箱中预热。
(5)直接向固定的细胞面滴加5mL含探针杂交液，然后用16mm盖玻片覆盖，其边缘用橡胶液封闭。
(6)43℃恒温水浴箱内培养18小时，此间保持箱内高湿度，防止因盖玻片封闭不严导致杂交缓冲液干涸。
(7)反应结束后，将玻片置于冰块上，用镊子小心剥下盖玻片周边的橡胶，将载玻片浸入垂直2×SSC溶液中，使盖玻片脱落。
(8)将载玻片放入湿盒中，加2×SSC溶液浸没玻片，加盖玻片并用胶带封闭湿盒。然后，将湿盒移入水浴箱中53℃处理30分钟。
(9)在18℃用2×SSC洗玻片4次，每次5分钟。
(10)玻片浸入70%乙醇脱水，空气干燥。
(11)将干燥后的干燥标本浸入新配制的核4乳胶液（核4乳胶液蒸馏水=1:1），垂直取出玻片，用滤纸擦去背面多余胶，室温干燥5小时（在暗室中进行）。
(12)用黑纸包裹标本放在4℃冰箱曝光（3H标记的探针通常需2～4周，有时需长达100天，可造成高背景，而不理想）。
(13)按常规显影、定影、水洗。
(14)对标本进行Giemsa或HE染色、脱水、封片。
结果分析：镜下观察，如需定量，可在镜下计数银颗粒或拍摄显微照片，用图象分析仪进行灰度分析。
(二)同位素标记RNA探针的原位杂交
RNA探针容易制备，合成率较高，成本低，易纯化，可提高检测敏感性。DNA-RNA、RNA-RNA杂交比DNA-DNA杂交稳定，能适应更多的条件。
(1)标本处理同前
(2)将RNA标记探针溶于杂交缓冲液中（5×107CPM/ml放射强度）。
50～70%去离子甲酰胺 2×SSC
0.5×Denhardt's液 1mmol/L EDTA pH7.0
200μg/mL变性鱼精DNA 85℃ 5分钟
(3)每张载玻片上滴加杂交液，使每张载玻片探针总量为2×105CPM，用一硅化的盖玻片盖住，封以不透性矿物油，在利于探针的温度下（常为42℃）杂交7～18小时。
(4)用氯仿洗数次，去除矿物油，室温下使盖玻片在2×SSC液中滑落，再滴加50%～70%去离子甲酰胺，0.1×SSC液，杂交温度下60分钟，室温2×SSC洗5分钟，用50μg/mL RNaseA在2×SSC中消化去除单链RNA，再滴加50%～70%去离子甲酰胺，0.1×SSC,室温15分钟，室温下用0.1×SSC洗5分钟。
(5)将切片脱水，浸入由1%甘油稀释的放射自显影乳剂（1:1）中，放入暗盒中，在有硅胶干燥剂存在下-70℃，存放5天（或者曝光于X光胶片24～48小时），随后浸于液体乳剂。
(6)用HE染色。
(三)地高辛标记的DNA探针原位杂交
放射性同位素标记探针缺点是有放射损伤，易污染环境，需特殊防护和实验条件，有半衰期受限、标记不稳定及曝光时间长。若改用生物素、乙酰氨基、荧光或地高辛标记可避免，其中以地高辛标记探针最敏感，随机引物标记地高辛，其标记率很高，此探针用于原位杂交可获高敏感性，好的细胞定位以及低背景。非同位标记探针还可以通过双标记原位杂交法，同时测多条DNA序列。
(1)配液：①杂交缓冲液：2×SSC
5%（W/V）磷酸葡聚糖
50%去离子甲酰胺
②缓冲液I： 0.1mol/L Tris-HCL pH7.5
0.5mol/L Nacl
③缓冲液II： 0.1mol/L Tris-HCL pH9.5
0.1mol/L Nacl
5mmol/L MgCl2
(2)操作步骤：
①组织标本处理同前。
②将140ng/mL地高辛标记的探针加到杂交缓冲液中，每张滴加50μL杂交缓冲液，用盖玻片盖住，四周封以树胶。
③将目的DNA和DNA探针放入90℃，进行变性10分钟，双链打开，42℃，在潮湿环境中杂交16小时。
④去除盖玻片，按下列条件洗涤：
2×SSC室温10分钟→2×SSC室温10分钟→0.2×SSC室温10分钟→0.2×SSC 42℃ 20分钟。
⑤再按以下方法处理：
1) 在缓冲液I中洗30分钟。
2) 在含有20%羊血清的缓冲液I中洗30分钟。
3) 滴加1:5000标有碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶的地高辛抗体，在装有缓冲液I的湿盒中温育20分钟。
4) 在缓冲液I中洗2×20分钟。
5) 在缓冲液II中洗60分钟。
6) 加入下述溶液：缓冲液II
0.33mg/mL 四唑氮兰
0.17mg/mL 5-bromo-4-Chlora-3-indoly' phosphate
7) 将切片浸于20mmol/L Tris-HCL pH7.5，5mmol/L EDTA终止反应。
⑥ 用底物显色、复染、脱水、封片，按免疫组化常规法进行。
说明：
(1)用不同浓度和不同温度的盐溶液洗涤是为了去除探针与不完全同源序列杂交，减少非特异性显色，其原则盐浓度由高到低，温度由低到高洗涤，洗涤过程中切勿使切片干燥。
(2)应该有阳性和阴性对照，阳性对照：用该探针与已知含互补序列的组织细胞标本进行杂交。阴性对照：①应用RNA酶或DNA酶去除目的序列；②使用未标记探针；③不加核酸探针进行杂交（空白对照）；④用不含探针DNA的无关质粒DNA替代探针进行杂交；⑤同义RNA（Sense probe）进行杂交。
氯仿是分子量比较大的有机溶剂,在提取rna时,氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离.dna提取过程
有机相中主要是酚和蛋白结合,从而使得蛋白和dna脱离,dna进入水相.但是在rna的提取过程就要避免蛋白和dna脱离,否则dna会释放到水相.不管有酚也好,没有酚也好,氯仿本身也对蛋白有变性作用,剧烈的震荡,很容易使得dna的亲水基团,与水相接触.所以不要剧烈震荡.
异丙醇的作用是通过-oh的疏水作用使得rna
或者dna链中的亲水基团受到保护,等同于沉淀,但是这是个反应时发生在水相中,与前面的氯仿不矛盾.
氯仿的作用有多个方面,一是作为有机溶剂变性蛋白,使其沉淀并通过离心除去,同时也通过变性作用抑制rnase活性；二是rna提取试剂中通常含有苯酚（trizol主要成分就是苯酚,很多自己配试剂提的方法也用苯酚,抽提蛋白时也会用到苯酚）,苯酚微溶于水,抽提烷之后水相里有痕量的酚,如果不除去会损伤核酸,需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等）,起到一定除杂作用
通常氯仿里面会加少量异戊醇（1/25）,减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫,影响后续操作,不过个人经验感觉加不加没什么太大区别,也许是我的样品里蛋白不多吧
异丙醇是沉淀核酸用的,作用和乙醇一样.只不过用量少一点,0.6v~1v就够了,不像乙醇沉淀需要至少2v,一般需要2.5倍体积.在水相很多,离心管容积有限,加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀.不过感觉效果不如乙醇,偶尔会有沉淀不出来东西的时候
① 包涵体就是蛋白的变性聚集后的产物，6M盐酸胍及8M尿素是作为溶解包涵体的溶剂。
② 复性的过程是逐步去除盐酸胍或者尿素，从而使得蛋白天然构象逐步形成。
所以一般如果起始使用的是6M盐酸胍进行包涵体溶解，这个过程中逐步降低的是盐酸胍的浓度。梯度离心或者差速离心去除细胞碎片，一般1000r/min左右就差不多可以达到效果。包涵体是表达过快的蛋白来不及折叠而形成的蛋白团，所以一般蛋白纯度能够达到95%以上，用6M盐酸胍就基本把包涵体分开，再超滤一下加上缓冲液就基本上很纯了
RNA提取一般步骤总结
. ^2 ^. g# N1 eWRNA提取原理：
/ |# K0 K. @9 W. | 通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。
0 T3 z( F&_, D6 c% ^" h6 Y A6 _RNA提取的一般步骤
- O: Y+ x$ p# s8 U4 M9 S 所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。( O( g^+ K) f+ i&]% P
实验步骤：
* l&d6 s5 e( q1 F( g2 | j, ^0 s 破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。6 D8 }. QY, g* X
1、 破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。
" s% f, `0 [1 d* m! ]0 e2、 分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。
&X. P) i) YL# u/ [3、 沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。2 @0 d&z7 ?+ i, g1 @
4、 洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。
3 @% V" o9 v+ I1 J2 o9 k" z5、 融解RNA一般使用TE。
L5 f. n6 }( S1 t% Z&J6、 保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g离心5分钟。
&P3 [7 m* ^$ U$ _" ?
: F" x u* N( ?( I氯化锂法提取总RNA：
" u}' I! r' ^' ^&l 本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片断丢失的缺陷。# ~* S: }9 `* r4 Z3 P
试验试剂：
" d$ r6 Q+ _. I8 Q1、 氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，过滤灭菌】
7 _8 w1 t" o9 a' q! i4 Z2、 悬浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】
! m8 Q4 R, ]&y: b# `7 d试验步骤：7 [6 ?$ `* }o7 _ Z' {
1、 对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5－10ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中。&Y) b: E, Q" l/ ^ Q: \$ s
2、 匀桨液在0－4℃放置4小时后，12000g离心30分钟。 x- C6 D- N/ N0 K! t2 a
3、 取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液，重复步骤2。
) y- x) S0 K9 y6 j, e4、 沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15－30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟。
3 d2 v' i1 ~( ~* D5、 取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心。
L4 a' Q4 u" l: a* K% Z$ ?( e6、 70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。3 }r0 [/ Q' G9 q
7、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。
0 f. X% R( H% B7 g
! y7 j5 u$ C' |) [% ~! J3 D: Q蛋白酶－热酚法6 |" ^0 b* [) P3 S* c4 b4 H4 l
本方法适合于病毒RNA的提取
* I( i+ b# r! K试验试剂：
$ ?4 [7 H9 `) J1、 蛋白酶K（终浓度50ug/ml）, J5 p l6 V/ t7 [/ I
2、 2×缓冲液：1%SDS? 20mMTris-HCL (pH 7.6)? 0.2MnaCL9 h, p ] y+ \$ Z) O
试验步骤：# W3 v8 G1 [$ ]5 y
1、 提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,37℃40-50分钟。
- K0 p/ E' G0 M# Q- z7 n, {# d2、 加入等体积65℃预热的酚溶液，轻徭,在65℃保温5分钟后再轻徭。
w! `W( ~, E: i3 ^3、 离心，取上清，氯仿抽提一次。, |( Z0 dj2 @7 m+ d2 Q&x H
4、 取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心(10000g,10min)。
7 [/ w, h2 d6 U$ k5、 70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。
% A5 Y{( w% ]3 a* y, O e) P6、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。植物RNA提取过程中难点的相应对策
植物RNA提取过程中难点的相应对策
) o5 B7 d/ Q3 _酚类化合物的干扰及对策：
a9 D* Z3 K ?7 W 许多植物组织特别是植物的果实（如苹果、樱桃、李子、葡萄等）和树木类植物中富含酚类化合物。酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。因而从幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，针叶类植物的针叶中多酚的含量比在落叶植物的叶子中要高得多。在植物材料匀浆时，酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应（browning effect）。被氧化的酚类化合物（如醌类）能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化。但Newbury等发现RNA提取的难易程度与材料中酚类物质的总量之间并无相关性，因此认为不是所有的酚类化合物都影响RNA的提取。但一般认为所谓的“缩合鞣质”即聚合多羟基黄酮醇类物质（如原花色素类物质）是影响RNA提取的一类化合物。目前去除酚类化合物的一般途径是在提取的初始阶段防止其被氧化，然后再将其与RNA分开。9 b0 S! }0 U6 |9 k/ l! v" v g1 ~/ @
防止酚类化合物被氧化的方法：
" vy, a4 k7 n/ Z1、 还原剂法：一般在提取缓冲液中加入(-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸来防止酚类物质被氧化，有时提取液中(-巯基乙醇的浓度可高达2％。(-巯基乙醇等还可以打断多酚氧化酶的二硫键而使之失活。Su等认为在过夜沉淀RNA时加入(-巯基乙醇（终浓度1％）可以防止在此过程中酚类化合物的氧化。硼氢化钠（NaBH4）是一种可还原醌的还原剂，用它处理后提取缓冲液的褐色可被消减，醌类化合物可被还原成多酚化合物。
&H. z. p+ ~&t% t5 G&G1 M- P/ q! u2、 螯合剂法：螯合剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO－N＝基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强。原花色素类物质中含有许多芳环上的羟基，因而可以与PVP或不溶性的PVPP形成稳定的复合物，使原花色素类物质不能成为多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步骤中被除去。用PVP去除多酚时pH值是一个重要的影响因素，在pH8.0以上时PVP结合多酚的能力会迅速降低〔11〕。当原花色素类物质量较大时，单独使用PVPP无法去除所有的这类化合物，因而需要与其它方法结合使用。
p% N0 w/ t7 r3、 Tris-硼酸法：如果提取缓冲液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以与酚类化合物依*氢键形成复合物，从而抑制了酚类物质的氧化及其与RNA的结合。这一方法十分有效，所以Lбpez-Gбmez等在提取缓冲液中不再加入其它还原剂。但如果Tris-硼酸浓度过高（＞0.2M）则会影响RNA的回收率。
# p8 ]0 ^8 K3 a4、 牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原－抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与RNA结合的机会，因此提高了RNA的产量。BSA与PVPP结合使用提取效果会更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用时要加入肝素以抑制RNase的活性。) ~# H/ y( P7 Q) j4 G* w1 G8 l
5、 丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料，可以有效地从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA。 @+ ?- X/ V9 z8 T8 H: B3 C! W' C
酚类化合物的去除 ：
&z# h) G0 H&]$ I1 N" f. l9 N 通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。与PVP、不溶性PVPP或BSA结合的多酚，可以直接通过离心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提时除去。Manning利用高浓度的2-丁氧乙醇（50％）来沉淀RNA，而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50％ 2-丁氧乙醇的缓冲液洗涤RNA沉淀以去除残留的多酚。他认为即使多酚被氧化，其氧化产物仍可以溶解在高浓度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，无需再用NaBH4来处理。5 C6 Y8 a1 S V: `2 ~
多糖的干扰及对策：6 I- b3 R4 ~$ T&O
多糖的污染是提取植物RNA时常遇到的另一个棘手的问题。植物组织中往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与RNA很相似，因此很难将它们分开。在去除多糖的同时RNA也被裹携走了，造成RNA产量的减少；而在沉淀RNA时，也产生多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液。由于多糖可以抑制许多酶的活性，因此污染了多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。在常规的方法中，通过SDS-盐酸胍处理可以部分去除一些多糖；在高浓度Na+或K+离子存在条件下，通过苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通过LiCl沉淀RNA也可以将部分多糖留在上清液中。但即使通过这些步骤仍会发现有相当多的多糖与RNA混杂在一起，所以还需要用更有效的方法来解决植物RNA分离纯化时多糖污染的问题。
7 [' X/ e, d8 x( B- p( |9 C&n 用低浓度乙醇沉淀多糖是一个去除多糖效果较好的方法。在RNA提取液或溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度10％～30％，可以使多糖沉淀下来，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的匀浆液中加入乙醇，如Lewinsohn等在从裸子植物的木质茎中提取RNA时，在匀浆上清液中加入乙醇至终浓度10％以沉淀多糖。但Tesniere等在从葡萄浆果组织中提取RNA时，是在用CsCl超离心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入终浓度30％乙醇来沉淀多糖的，进一步纯化了RNA样品。
! i5 b5 m* z9 G8 M4 ~- N/ D 另一个常用的方法是醋酸钾沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉组织的RNA时在匀浆上清液中加入1/3体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液以沉淀多糖；Ainsworth在提取酸模植物花组织的RNA时加入的是1/5体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液。Hughes等在提取棉花叶和花粉的RNA时是加1/3体积的8.5M醋酸钾（pH6.5）溶液到匀浆液中以除去多糖等杂质。在提取某些植物材料的RNA时，是将上述两种方法结合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA时，是在匀浆液中加入0.25体积的无水乙醇和0.11体积的5M醋酸钾溶液以去除多糖杂质。Su等在去除褐藻的多糖时，单独使用乙醇或醋酸钾都无效，只有两者结合使用效果最佳。
6 c9 |5 q1 b9 [5 l1 s+ n Fang等认为缓冲液中含有高浓度的NaCl有助于去除多糖。Chang等在提取松树RNA时，缓冲液中NaCl的浓度为2.0M和1.0M，通过氯仿抽提和乙醇沉淀RNA将RNA与多糖分离。Manning是将胡萝卜种子等材料苯酚提取后的上清液稀释，调节Na+离子浓度至80mM，然后加入0.4体积的2-丁氧乙醇来沉淀去除多糖。3 B1 h# M' {+ {0 U% U, K2 @, v
蛋白杂质的影响及对策：$ @- G5 o( f1 s9 _2 V* G2 n/ ^
蛋白质是污染RNA样品的又一个重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦属于蛋白质，因而要获得完整的、高质量的RNA就必须有效地去除蛋白杂质。常规的方法是在冷冻的条件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取缓冲液中含有蛋白质变性剂，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等，这样在匀浆时可以使蛋白质变性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K来降解蛋白杂质。进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质。' T7 v( F1 J9 @+ E
Wilcockson利用蛋白质与RNA在高氯酸钠溶液中的溶解度不同将它们分离。在70％高氯酸钠溶液中，RNA的溶解度大于蛋白质的溶解度，因而将大部分蛋白质沉淀下来。接着在离心上清液中加入两倍体积的无水乙醇，这时RNA能沉淀下来而能溶于70％高氯酸钠溶液中的残留蛋白质仍然留在上清液中。这样可以除去绝大部分的蛋白质。
3 q e/ \* I" A&@次级代谢产物的影响及对策：: N3 |) N f K# np' f6 h0 J2 A0 {
从植物组织中提取高质量RNA的另一个难点是许多高等植物组织尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物，这些次级代谢产物很容易与RNA结合并与RNA共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的RNA的分离。因不能确定这些次级产物具体是什么物质，所以，目前还没有什么特殊的方法来解决这个问题。Baker等综合Hughes等的选择性沉淀法、Chirgwin的氯化铯梯度离心法和Iversen等的RNA回收方法纯化了松树种子、成熟松树针叶等植物组织的RNA。( M s5 O% f! H- Q* \( m" `( }
由于植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性，使得植物组织RNA的提取相对于其它生物材料来说要困难的多。实践中经常会发现，即使同一种植物的不同组织其RNA提取方法会有很大的不同；含有某种干扰因素的不同植物材料，其适用的RNA提取方法可能不同；即使是同一种植物同一种组织材料，但来源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一样。所以，对于某一植物或其组织来说，其相应的RNA提取方法必需经过摸索和实践才能确立。# S0 a# G7 L3 S&A
随着植物分子生物学研究领域的拓宽，可以肯定地说，在作为其研究基础的植物材料RNA提取过程中还会出现新的难点，但随着不断地探索和经验的积累，科学工作者们一定会迅速地解决这些难点，为植物分子生物学的发展铺平道路。植物RNA提取中的一些特殊方法
植物RNA提取中的一些特殊方法
$ e* [2 U( E% h' [多酚类植物的RNA提取：! j! d, ]2 V( R! B&o
苹果棉花等多酚类植物提取RNA用TRIZOL一般提不出来。这个方法是验证过有效的,提取的RNA纯度不是特别高,但是用作northern足够。6 j&d2 u( \6 W8 _&o4 E1 X1 t
实验试剂：
# s7 s8 H! R# W1 y# g提取buffer 200ml：NaCl 1.1688g 100mM Tris 2.4228g 10mM (tris-HCl 8.0) EDTA 5.8450g 10mM SDS 2.0000g 1% NaOH调至8.0,定至200ml,加200ulDEPC融解.* j) st2 @) t4 W' F
试验步骤：
! T a0 I* C( w5 S" E* A' W1、 1.5ml离心管用液N2冷冻吼加入0.1g样品,立即加入500ul酚氯仿,再加入500ul提取buffer,剧烈振荡1-2min,冰上放置5min。" F3 S0 V5 @0 s7 i1 T
2、 4度12000rpm离心15min, 上清转入新管,加氯仿异戊醇抽提一次。) H' L7 d# d" y8 @
3、 取600ul异丙醇,-20度沉淀20min.
&w: m2 r: I4 \4 l# J4、 12000rpm离心10min。
! I. Y. \8 b7 A5、 沉淀用70度乙醇洗。
k! T. D1 [0 w+ ?) _0 D5 ?6、 8000rpm 5min。
" Ay# }' F( `5 }6 I+ N! x7、 沉淀晾干,溶于30ulDEPC水。^0 Q- R+ `5 j( n' [' m9 M
# m/ r3 o2 O! T6 z$ `1 m&e. ^
银杏等木本裸子植物的RNA提取方法：&A i&V! H0 ` ?6 R
银杏、香机等木本裸子植物，酚类和多糖等次生物质含量较多，对RNA的分离和纯化有很大干扰，严重影响了提取RNA的质量和产量，给相关的分子生物学实验的进行带来阻碍。目前，RNA的提取方法很多，采取常规的Trizol试剂盒、SDS等方法不能提取银杏RNA，而Shujun Chang等(1993)的CTAB法，提取RNA质量也较差，降解也十分严重。对其提取步骤进行改进，得到质量较高的银杏RNA样品。/ s4 i* V k8 S) x
试验试剂：! ]! M( q# E7 N3 t`# i. m( [
1、 1M tris:1 2.11g T ris，溶于60m L水中，用浓盐酸调至Ph8 .0，定容至lOO mL.用灭菌的DEPC水溶解。
`4 c9 {) p2 \4 t2、 500m M EDTA:1 8.61g E DTA "H 2O加入80m L水中，搅拌溶解，用NaOH调pH至8.0，定容至100mL。V# x* j! H4 y! G4 M# q3 c5 P
3、 10 mol/LLiCL: 42.4 gLiCL, 100mL水溶解即可。9 i) @ a' \&w+ c p* g
4、 提取缓冲液(DEPC水处理):2% CTAB（蛋白质变性剂）.2% PVPK 30（去除多酚类物质）10 0m M Tris-HCL (Ph8.0)25 m M EDTA（金属鳌合剂）2.0 M NaCL（去除多糖和CTAB）配法:2 g CTAB, 2 g PVP, 10 mL 1 mol/L tris, 5mL 500 mM EDTA, 11.7gNaCL,定容到100mL。) o+ \5 E! XO# A( M+ P8 H* K9 n0 q
5、 亚精胺(提取时加少量)（RNA酶抑制剂）
# J9 g6 O/ h( u' d6、 4%0一疏基乙醇(提取时加)（去除多酚类物质）' D e, d( J. K$ z! O9 f
7、 氯仿异戊醇(24: 1)（抽提蛋白质）) U) A+ ]4 \# Q
8、 10 MLiCL（沉淀大分子RNA）
7 M+ b) g4 J4 m5 C0 f- \9、 SSTE（溶解RNA）1.0 M NaCL 0. 5%SDS 1m MEDTA(PH8.0) 10 m MTrisHCL(pH8 ）配法:2.9 g NaCL, 0.25 g SDS, 0.5 mL 1 M tris, 100 u L 500 mM EDTA, pH8.0,定容至50 mL。. m5 z+ J3 X0 V&\6 e7 Y# R
试验准备：_5 z9 }" f% q6 t
1、 研钵和玻璃器皿用锡纸包好，200℃以上向温烘烤2小时以上，或180*C 高温烘烤4小时。X7 n3 w, W2 }9 M
2、 塑料制品(枪头和离心管)最好用新的，并且用报纸包好，121'C高压灭菌，灭菌40 min，或连续两次121'C高压灭菌，每次灭菌20 min，然后用烘箱烘千。
X* f+ ~, v7 }. a3、 所有溶液配制好后，加DEPC水使DEPC uJ浓度为0.1%, 37℃过夜，1211C高压灭菌40 min.(其中Tris因为不能用DEPC处理，所以Tris用DEPC处理的水溶液灭菌后配制。)
) x&B, {% e" ^&F: s0 q试验步骤：" Y6 U+ `2 C* \4 X2 a# r
【根据文献(Shujun Chang, 1993) CTAB法，稍作改进。】
F ^+ e9 I# h/ Q7 m* A* ]1、 将4mL提取液加入到lOmL离心管c卜650C水域加热。$ D+ ?4 w7 \3 J: w, M
2、 用液氮冷却研钵，在研钵中加入少量的抗氧化剂PVP，取1g低温冷冻的银杏叶片，迅速置于研钵中，不时加入液氮以防止研磨过程中叶片融化，充分研磨后，立即加入到预热好的提取缓冲液中，用手摇功混匀。6 C4 i+ L/ Z* C5 G) v
3、 65℃，水域1 min后冷却至室温。
( N2 @) U: S, {9 M" e8 f4、 加入等体积(4mL)的氯仿:异戊X17 (2=L: 1)，混匀，10000rpm, 40C，离心10 min。
( H6 P o1 y8 p# ?5、 小心吸取上清液，加入等体积(4mL)的仿:异戊醇(24: 1),混匀，10000rpm, 40C,离心10 min。. {# k/ z5 r: x: v1 x
6、 吸取上清液，加1/4体积的IOMLiCL,混合，4℃沉淀过夜，然后10000rpm离心20 min。
7 x P4 o6 z1 D! [8 }7、 用枪吸干，用500u L SSTE溶解沉淀，转到1.5m L离心管.加等体积氯仿:异戊醇混匀，10000rpm, 40C，离心10 min。
, H2 b7 C1 d* [6 r4 c8、 离心吸取取上清液，加两倍体积的无水乙醉，-70℃沉淀至少30 min，或一200C下沉淀2 h。" W* c' Y1 P- t5 K) ^, `
9、 12000rpm, 40C,离心20 min，去上请用70%的乙醇洗两次，吹干沉淀。1 x, S* X0 V" y6 F/ l
10、 用40 u LDEPC处理的水溶解沉淀，得到RNA样品。8 f2 C- S4 R3 O9 R4 T e&{
11、 除用于电泳和紫外检测外，其余RNA-70℃冰箱保存备用。
Q0 o7 V. ]9 x, {1 i: _ _
! U* X1 m5 G9 A( W% U改良Krapp提取法：
1 r) r# s3 ~ |. q1 v. w试验试剂：
' C7 Z1 ^) J5 A&f&W( K d1、 RNA抽提掖：母液：4mol 异硫氰酸胍 20mmol EDTA 20mmol MES pH 7.0。工作液：取400ml母液加入1.7ml 2-ME贮存在4℃条件下备用。/ a. I$ E. R S% z
2、 RNA重悬液：2mol LiCl 10mmol NaAc调整终体积为250ml，pH 5.2，灭菌后贮存在4℃条件下备用。2 uJ1 S9 V8 a. j
试验步骤：
) O/ o, L# q- D8 v) U1、 取新鲜植物材料0.5~1g，冷冻干燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨，然后加入 10ml RNA抽提掖充分混匀。7 n Q: B" S N9 B! J$ u
2、 4℃条件下8000rpm离心10min，将上层水相转移至一干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿抽提掖，在4℃条件下8000rpm离心10min。
1 N: K+ ]3 R" a7 `3、 上清液转移至一干净离心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次（加入10ml氯仿充分混匀后，在4℃条件下8000rpm离心10min.）。
$ p+ y, P/ ^- w/ E' g" k0 y: [4、 小心将上清液转移至另一干净离心管中，加入1/10 vol 3mol NaAc和2 vol冷无水乙醇，在-80℃条件下沉淀2小时。: t&M8 O1 O! C- w5 a
5、 在4℃条件下8500rpm离心30min.，小心弃去上清液，沉淀重悬于RNA重悬液中，置于4℃条件下1小时。9 b7 Z# K4 v( y% l8 Q0 a8 N) I% |
6、 4℃条件下8500rpm离心10min.，弃去上清液，沉淀溶于适当体积的DEOC处理水中。检测后分装，置于-70℃条件下保存。
RNA提取般步骤总结
^ 2 ^ G＃N1 EWRNA萃取原理：
/ |＃K0 K. @ 9 W |破碎细胞或组织RNA氯仿等机溶剂萃取并再经沉淀洗涤干燥溶解变性剂由于RNA酶处随能RNA降解所需要注意实验稍疏忽前功尽弃
0 T3 Z（F＆_D6 C％^Y A6 _RNA H6提取般步骤
- O：Y + X $ P＃S8 U4 M9所RNA提取程五关键点即：效破碎细胞或组织本效使核蛋白复合物变性内源性RNA酶效抑制效RNA提取DNA蛋白质混合??物参与效除糖杂质糖含量高品关键抑制RNA RNA提取阶段两种式使用：提取总RNA核酸沉淀氯化锂直接酸性条件酸性条件DNA蛋白质提取RNA留水相机相第提取导致量RNA损失种使用电流频率已经非低 （O（克^ + K）F + I＆]％P
实验步骤：
* L＆D6 S5 E（Q1 F（G2 | J ^ 0坏组织RNA→沉淀→离RNA→洗涤→保存RNA→解冻RNARNA6 D8} QYg * X
甲破碎组织RNA酶失同进行使用盐酸胍异硫氰酸胍NP-40SDS蛋白酶K等粉碎组织加入β-ME抑制RNA性
S（％）F`0 [1 D *米] 0 e2RNA离般用苯酚氯仿等机溶剂通加入少量异戊醇并步骤离离RNA般布层蛋白质层离
＆X. P）I）YU / L＃[3般用乙醇3M醋酸钠（pH值5.2）或异丙醇沉淀RNA 2 @ 0 D＆Z7 + IG1 @
4用70％乙醇洗涤洗涤RNA避免RNA洗掉步骤省略洗涤干燥或干燥乙醇能太干否则难溶解
3 @％VO9 V + I1 J2 O9 KZ5融化RNA通用于TE
L5 F N6}（S1吨％Z＆J6保存RNA应低温防止痕量RNase污染离RNA富RNase品（胰脏肝脏）需要要存储甲醛期存储高品质RNA存储特别鼠肝脏RNA水存储星期鼠脾脏提取基本降解RNA提取仍存储水3稳定外度比跟踪RNase降解于4KB誊转录呈现更敏增加RNA品存储稳定性RNA溶解离甲酰胺并存储-70℃保存RNA甲酰胺必须包含自胰腺RNA碎片RNA降解甲酰胺至少节省使用面准备使用RNA：加入醋酸钠0.3 M12000×g离5钟沉淀RNA
P3 [7米* ^ $ U $ _
：F徐* N（（I氯化锂提取总RNA：
U}'IR'^'^＆升尿素变性蛋白高浓度本发明并抑制RNA酶RNA选择性用氯化锂沉淀特别适合于少量组织RNA提取量品具快速简洁处少量污染DNARNA产量高损失RNA片段缺陷＃?* S：} 9`* R4 Z3 P
检测试剂：
D $ R6 Q_ I8 Q1氯化锂/尿素溶液氯化锂126克（3M）尿素360克（6M）加水至1L通滤灭菌]
7 _8 W1吨O9'QI4 Z2悬浮液[10mMTris-HCl（pH值7.6）1mMEDTA（pH8 0）0.5％SDS]
M8第4季R＆Y：B＃`7测试程：7 [ $`*}O7 _ Z'{
1进行量组织或细胞每克组织或细胞加入5-10ml氯化锂 - 尿素溶液匀浆器件速度匀浆2钟于数量细胞（107细胞/毫升）每克组织或细胞加入0.5毫升氯化锂 - 尿素溶液手匀浆并转移Eppendof管 ＆Y）B：EQL / ^ Q：\ $号
图2所示匀浆液放置0-4℃412000克离30钟 X-C6 D-N / N0 K表 T2 A
3颗粒加入1/2体积原始匀浆液体氯化锂 - 尿素溶液重复步骤2
）YX）S0 K9 Y6 Je4用1/2体积原匀浆液氯化锂 - 尿素溶液重构沉淀加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇室温15-30钟摇组合4000克离5钟
3 D2 VI1??（?* D5水清液添加1/10倍体积3M乙酸钠（pH5.2）2倍体积乙醇??-20℃进行15000克离
L4Q4 U L：* K％Z $ （E670％乙醇沉淀洗涤并真空干燥3}R0 [/ Q'G9 Q
RNARNA溶解液溶解沉淀物装保存于-70℃
0 F X％R（H％B7?
Y7 J5 U $ C'|）[％? J3e：Q蛋白酶 - 热酚|^ 0 B *）P3 S * C4 B4 H4升
本发明适合病毒RNA提取
* I（I + B＃RK测试试剂：
$ 4 [7 H9`）蛋白酶K（终浓度50ug/ml）J1J5 P L6 V / T7 [/ I
22×缓冲液：1％SDS20mM Tris-HCl（pH值7.6） 0.2MnaCL9 HP] Y + \ $ Z）O
测试程序：＃W3 [$] 5 Y V8 G1
1纯化病毒溶液加入等体积缓冲液蛋白酶K37℃40-50钟
- K0 - P / E'Q-Z7?G0 M＃{＃D2加入等体积65°?预热酚溶液轻徭薄赋光5钟65℃徭培养
W `W（E：酷睿i3 ^ 3离取清液氯仿萃取间（Z0 DJ2 7米+ D2 Q＆X?
4取层水相加1/10倍体积3M乙酸钠（pH5.2）2倍体积乙醇??-20℃进行1离离5000克（万克10钟）
7 [/瓦特氢气D6 U $ k570％乙醇洗涤沉淀物真空干燥
％A5 Y{（W％3 * Y O E）P6 RNA溶解液溶解沉淀RNA装保存于-70℃策植物RNA提取程难
策植物RNA提取程难
）O5 B7 D / Q3 _酚类化合物干扰及策：
A9 D * Z3 K 7 W许植物组织特别水（苹樱桃李葡萄等）植物树木植物含丰富酚类化合物酚与植物增加含量更容易轻植物材料RNA提取外针叶树植物落叶植物叶织针酚含量要高氧化匀浆焦黄加深植物材料匀浆酚类物质释放氧化程度增加种现象称褐变影响（BROWNING效）酚类化合物（例醌类）与RNA稳定结合氧化影响RNA离纯化纽伯与酚类总量材料没发现RNA提取难易程度间相关性并非所酚类化合物影响RNA提取般认所谓缩合单宁聚合物羟基黄酮醇类物质（原花青素物质）影响RNA提取类化合物除酚类化合物般初始阶段提取防止氧化离RNA 9 B0 S} 0 U6 | 9 K / L VV G1?/ @
防止氧化酚化合物：
V yA4 K7 N /原Z1：般提取缓冲液加入（ - 巯基乙醇二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸防止酚类氧化提取溶液（ - 巯基乙醇浓度高2％（ - 巯基乙醇等断便苏由酚氧化酶失二硫化物即添加沉淀RNA夜（ - 巯基乙醇（终浓度1％）防止氧化程硼氢化钠（硼氢化钠）酚类化合物原醌原剂用提取缓冲液处理棕色消减醌化合物原酚化合物
＆H Z P +?＆T％T5 G＆G1 M-P / Q U2螯合剂：螯合剂聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）CO-N =基团包括酚化合物强结合能力结合能力与酚化合物芳香环数目增加羟基加强原花青素物质包含许芳香环羟基基团其形稳定复合物与PVP或溶性PVPP使原花青素物质能酚氧化酶酶底物氧化并且提取步骤除随着PVP除酚pH值重要影响素结合酚PVP pH值8.0更迅速降低[11]原花青素单独使用更质量PVPP除所化合物需要与其结合使用
p％N0瓦特/ t7r3Tris-硼酸盐：提取缓冲液含Tris-硼酸盐（pH7.5）其特征于所述硼酸根据带*氢与酚类化合物形复合物抑制酚类氧化与RNA结合种非效所提取缓冲液溶液加入Lбpez-Gбmez再其原剂Tris-硼酸浓度高（>0.2M）影响RNA收率
＃P8] 0 ^ 8 K3 a4牛血清白蛋白（BSA）（）：物质BSA原花色素产类似溶性或溶性复合物形间抗原 - 抗体相互作用降低材料RNA结合原花色素机提高产率RNA BSAPVPP合并提取液效更由于RNA酶往往含BSA要加入使用肝素抑制核糖核酸酶性 ?＃H / Y（P7 Q）J4）G * W1 G8升
5星丙酮：Schneiderbauer冻结云杉松树山毛榉等-70℃丙酮萃取植物材料与抛光效离高品质植物材料酚醛化合物丰富RNA @ + - X / V9 Z8 T8 H：B3?白c
除酚类化合物：
＆Z＃H）G0 H＆$ I1 N F L9 N李+Ca2 +沉淀RNA未氧化酚类化合物清除PVP溶性PVPP或BSA结合酚类物质直接通离离除或曼宁使用高浓度2 - 丁氧基乙醇（50％）沉淀RNA除苯酚氯仿萃取酚溶解2 - 丁氧基乙醇除含50％2 - 丁氧基乙醇缓冲液洗涤RNA沉淀认甚至酚氧化其氧化产物仍溶解高浓度2 - 丁氧基乙醇溶液除残留酚删除外没必要再使用硼氢化钠处理 C6 Y8 A1 SV：2
糖干扰及策：6 I-B3 R4?$ T＆O
糖污染提取植物RNA经遇另棘手问题植物组织往往富含糖许物理化性质RNA糖非相似难除糖RNA裹着移植性路程导致RNA产量减少RNA沉淀产糖凝胶状沉淀物例含糖类RNA沉淀溶于水或溶解粘稠溶液由于糖抑制许酶性污染糖RNA品能用于进步物研究传统通SDS-盐酸胍处理部除些糖氯仿萃取移除些糖由苯酚存高浓度Na +或K +离条件?? LiCl沉淀RNA糖部留清液即使通些步骤仍发现相数量糖RNA混合起所需要使用更效式解决污染问题植物RNA离纯化糖
7 ['X / Ed8×（沸点（| 9 C＆n与低浓度乙醇沉淀除糖糖种更提取RNA或溶液缓慢加入水乙醇至终浓度10％至30％并且使沉淀糖RNA保持溶液乙醇溶液加入通植物材料匀浆Lewinsohn RNA萃取裸植物木质茎统乙醇浆料清液加入终浓度10％情况沉淀糖Tesniere葡萄浆组织提取RNA通CsCl超离乙醇沉淀RNA溶液加入终浓度30％乙醇沉淀糖进步纯化RNA品
I5 B5米* Z9八集团M4? - N / D另用醋酸钾沉淀糖加入1/3量5 M醋酸钾（pH4.8）解决案巴赫卢勒云杉组织匀浆提取RNA沉淀糖安斯沃思鲁梅克斯植物花卉组织RNA提取加入1/5体积5 M钾乙酸乙酯（pH4.8）溶液 Hughes等棉叶花粉RNA提取添加1/3体积8.5M醋酸钾（pH值6.5）溶液匀浆除糖等杂质植物材料RNA提取物述两种组合使用种Lбpez-GбmezRNA提取芒皮匀浆液加入0.25体积水乙醇0.11倍体积5M醋酸钾溶液除糖杂质 Su等除糖藻酸盐单独使用乙醇或醋酸钾效并使用结组合
6 C9 | 5 Q1 B9 ??[5 L1 S + N缓冲液含高浓度NaCl助于除糖 Chang等提取松树核糖核酸NaCl浓度2.0M1.0M缓冲溶液氯仿萃取乙醇沉淀RNA与糖离RNA曼宁萝卜种其材料苯酚提取清液稀释Na +离浓度调节至80毫米加入0.4体积2 - 丁氧基乙醇沉淀除糖 3 B1 H＃M'{+ {0 U％UK2 @V
蛋白质杂质影响策：$ _at_ - G5 O（F1 S9 _2 V * G2 N / ^
蛋白RNA品污染重要素核糖核酸酶酚氧化酶蛋白质获完整高质量RNA必须效除蛋白杂质传统抑制冷冻条件性RNase等磨碎植物材料提取缓冲液含蛋白质变性剂苯酚胍十二烷基硫酸钠十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）使匀浆蛋白质变性聚集些蛋白酶K降解蛋白质杂质五月进步除蛋白质用苯酚氯仿萃取 T7五（F1 J9 @ + E
Wilcockson同溶解度使用高氯酸钠溶液蛋白质RNA离 70％高氯酸钠溶液于该蛋白质溶解度RNA溶解度数蛋白质沉淀随通离离清液加入两倍体积水乙醇RNA安顿并溶解70％高氯酸钠溶液残余蛋白保持清液除部蛋白质
3 QE / \ * IA＆@代谢产物影响及策:: N3）N F K＃NP F6 H0 J2 A0 {
另困难植物组织许高等植物组织尤其熟组织产些水溶性级代谢产物提取RNA质量些级代谢产物容易与RNA结合RNA提取满阻碍离物性RNA些级产品能确定具体物质没特别式解决问题贝克休斯等选择性沉淀Chirgwin氯化铯梯度离离纯化松树种熟松树针叶植物组织RNA艾弗森RNA恢复 （M S5 O％FH-Q * \（`（}
难易其物材料植物组织特别高等植物细胞内外复杂性组合物使植物组织RNA提取阶段通实践发现即使同种植物同组织RNA提取同同植物材料包含某种干扰素同RNA提取能适用即使同种植物相同组织材料同基型植物RNA提取能相同于工厂或组织其相应RNA提取必须经探索实践建立 ＃S0＃G7 L3 S＆A
随着植物物研究领域扩我肯定说现新困难RNA提取植物材料程作其研究基础断探索经验积累科家快解决些困难并植物物发展铺平道路些特殊植物RNA提取
些特殊植物RNA提取
$ E * [U（E％H'酚植物RNA提取：JD2 V（R! B＆?
苹棉花酚植物RNA提取采用TRIZOL般没验证效所提取RNA纯度没特别高作北足够 6 J＆D2 U（\ 6 W8 _＆O4 E1 X1吨
试剂：
＃S7 S8? R＃W1 Y＃克提取缓冲区200毫升：氯化钠1.1688克100毫米Tris2.4228克10毫米（Tris-HCl4.0）EDTA5.8450克10mMSDS2.0000克1％NaOH溶液调节至8.0并设置200毫升再加200ulDEPC解冻 * J）T2 @）T4 W'F
测试步骤：
?A0 I * C（W5 S * A'W11.5毫升管冷冻液态N2吼加入0.1克品加入500UL苯酚 - 氯仿加入500UL提取缓冲液剧烈振摇1钟放置冰5钟 F3 S0 V5 @ 0 S7 I1?
24 12000rpm进离15min清液转移新试管添加氯仿异戊醇提取间 ）H'L7 D＃DY8 @
3取600ul异丙醇-20℃沉淀20钟
＆W：M2 R：I4 \ L＃J412000转离10min
IY \ 8 b7A5沉淀物用乙醇（70度）
K T. D1 [0 w +）_0 D5 68000RPM 5钟
AY＃}'F（`5} 6我+ NX7沉淀干燥溶解30ulDEPC水^ 0 QR +`5 J（N'['M9号
＃M / R3 O2? T6 Z $`1 M＆E ^
银杏等木本裸植物RNA提取：A I＆V H0` ?
银杏香其木本裸植物代谢物糖离纯化RNA干扰RNA提取质量产量严重影响酚含量物实验展带阻碍目前RNA提取许传统Trizol试剂盒SDS其提取银杏RNA蜀郡张等（1993）CTAB提取RNA质量较差退化非严重改善其提取步骤获更高质量银杏RNA品 / S4我* V K8 S）x
检测试剂：M（Q＃E7 N3吨`＃I M（[
11M三：12.11克?斯溶解60米L水用浓盐酸PH8 0.0体积LOO毫升菌DEPC水溶解使用
`4 C9 {）P2 \ 4 T2 M EDTA500米：18.61克?DTAH 2O80米升水搅拌至溶解用NaOH pH值调至8.0定容至100mlV＃X G4 M＃Q3 C5 P * JH4 Y
310摩尔/ LLiCL：42.4 gLiCL 100毫升水溶解即 9 I）@'\＆W + C P * G
图4所示提取缓冲液（DEPC处理）：2％CTAB（蛋白质变性剂）0.2％PVPK 30（除酚）100米摩尔Tris-HCL（pH8.0）25米M EDTA（金属螯合剂混合物）2.0M氯化钠（除糖CTAB）与：10 mL1 mol / L三PVP2克2克CTAB5ML 500毫米EDTA11.7gNaCL音量设置100毫升 ）O + \ 5 E XO＃A（M + P8 H * K9 N0 q
5亚精胺（提取液加少量）（RNA酶抑制剂）
＃J9 G6 O / H（U'D64％稀疏乙醇（添加）提取（除酚）'D ED（J. K $ ZO9 f
7氯仿异戊醇（24：1）（萃蛋白质））U）A +] 4 \＃Q
810 MLiCL（沉淀物RNA）
7 M +）G4 J4 m5C0f-\ 9SSTE（溶解RNA）1.0M氯化钠01m10米MTrisHCL（pH8）：氯化钠2.9克0.25毫摩尔EDTA（pH8.0）5％SDS克SDS0.5毫升1三L 500毫米100 U EDTApH值8.0定容至50 mL M5 Z + J3 X0 V＆\ 6 E7?＃R
测试准备：_5 Z9}F％Q6吨
灰浆玻璃器皿包裹铝箔烘焙温度200℃或至少2或180 * C高温烘烤4信息 X7 N3 WW2} 9 M
2塑料制品（提示管）新裹报纸121'C高压灭菌器消毒40钟或两121'C高压釜每灭菌20钟烤箱烤千
X * F +?V7} A3所溶液制备加DEPC水DEPC UJ浓度0.1％37℃培养夜1211C高压蒸汽灭菌40钟液（Tris没用DEPC所Tris DEPC-处理水溶液制备灭菌处理）
）X＆B {％E ^＆F：S0 q检验程序：Y6 U +`C * \ X2＃R
[据文献（蜀郡张1993）CTAB改进 】
F ^ + E9 I＃H / Q7 M * A *] 14毫升提取物加入lOmL离离机加热管C卜650C水域 $ D + 4 W7 \ 3 J：WM
2研钵用液氮冷却研钵抗氧化剂PVP加入少量采取1克低温冰箱银杏迅速放置研钵加入液氮研磨程防止叶片熔体充研磨紧接添加预热提取缓冲液并混合与手功能 C4我+ L / Z * C5?）V
365℃1钟冷却至室温水
（N2 _at_）U：S{9 ME8 F4通添加量（4毫升）氯仿：异戊X17（2 = L：1）混合10,000 rpm40C10钟
（H6 P O1 Y8 P＃5星仔细清液加入等体积（4毫升）仿：异戊醇（24：1）并混合10,000 rpm40C离10钟{＃K / Z5? ：X：V1 x
6取清液加入1/4体积IOMLiCL混合4℃沉淀夜10000RPM离20钟
7×P4 O6 Z1 D [8} 7干燥溶解沉淀500U?SSTE 1.5M号离管放炮等体积氯仿：异戊醇混合1万转40C离10钟
H2 b7C1e* [6 R4c8离拉伸清液加两倍体积水乙醇-70℃沉淀至少30钟或20℃沉淀物2 W * C'Y1 P-T5 K表）^`
912000rpm进40C离20钟用70％乙醇洗涤两干燥沉淀 1×S * X0 VY6 F /升
1040 U LDEPC处理水溶解沉淀物RNA品 8 F2 C-S4 R3 O9 R4 T E＆{
11除电泳紫外检测RNA-70℃冰箱备用
Q0 O7 V.] 9 x{1我：__
U * X1 M5 G9（W％U改进克拉普提取：
1 R）R＃S3? Q1诉W测试试剂：
C7 Z1 ^）J5 A＆F＆W（K D1RNA提取掖：母液：4mol异硫氰酸胍20毫摩尔EDTA 20毫摩尔MES pH值7.0工作液：取400毫升母液加入1.7毫升2-ME贮存4 ℃储备/ I $ E. RS％Z
2RNA重新悬浮液：氯化锂10毫摩尔乙酸钠2mol调整终体积250mlpH5.2灭菌存储4℃条件使用 2 U J1 S9 V8 ?
测试步骤：
）O / O型L＃q构-D8 V）U1取新鲜植物材料0.5?1g冻干必要添加至0.2g砂磨起拌匀加入10ml RNA提取掖 7 N Q：BS N9 BJ $ü
24℃8000RPM离10min条件层水相转移干净离管并加入等体积苯酚/氯仿萃取除皱离10钟4℃条件8000RPM
1N：K +] 3 R A7`3清液转移干净离管清液1（添加调匀10毫升氯仿洗涤10ml氯仿4℃条件8000RPM离10min ）
$ P + YP / ^ - W / EGK0 Y：[4清液转移另干净试管加入1/10体积3摩尔乙酸钠2倍体积冷乙醇-80℃降水两条件：T＆M8 C-W5O1 O
54℃8500rpm离30钟条件弃清液沉淀再悬浮RNA再悬浮并4℃放置1条件 9 B7 Z＃K4 V（同期L8 Q0 A8?）I％|
64℃条件8500rpm离10min丢弃清液DEOC沉淀物溶解适体积处理水测试包装保存-70℃条件
不要多想 这样的提问没有意义
很多烦恼都是我们自己找的
（2）并在构象分析和分子图形拟合的基础上，提出了芬太尼类化合物与阿片受体之间相互作用的结构要求。
（3）变性剂如脲、酸、碱与高温等条件均因破坏氢键而影响构象的变化。
（4）结果表明，毛细管区带电泳作为监测蛋白质构象变化的一种有效手段，方法简便、快速、灵敏度高、样品消耗量少。
（5）用一个匀速转动的偶极子来描述马达的构象变化，考虑了马达的内部自由度。
（6）系统介绍香菇多糖的化学结构及空间构象分析方法，综述香菇多糖的构效关系。
（7）推测这一构象变化可能主要发生在蛋白质的IA亚区，并且很可能是一种促使IA亚区变得更加开放的“绞链式运动”。
（8）这和其他方法所测BSA构象转变结果基本一致，说明闪光光解方法有可能为构象研究提供某种信息。
（9）研究蛋白质寡肽构象在构象空间中的分布情况，对提取寡肽模式并构建短肽库具有重要的意义。
（10）荧光光谱分析表明，酶活性的表现与酶分子的构象变化有一定的相关性。
（11）在研究蛋白质的构象、相互作用以及动力学过程中，色氨酸残基常常被当作探针来使用。
（12）上簇环境不同的原料茧必将引起丝胶分子构象发生变化。
（13）连接蛋白的表达和构象的改变影响裂隙连接的通透性，从而改变细胞间通讯。
（14）离子通道的开闭反映了蛋白质构象变化的动力学过程。
（15）肽链的这个空间构象就是二级结构。
（16）他们可以采取有最大熵值的构象.
（17）结果表明，这些取代基有着各自不同的空间构象，对卟吩环的整体结构没有很大的扰动。
（18）用电偶极子的转动来描述驱动蛋白的构象变化.
（19）扭曲构象为较好的发光构象。分子受激后，平面构象可经旋转松弛到扭曲构象。
（20）原料茧解舒有较大差异是丝胶分子构象变化的内在反映。
（21）大型蛋白构象变化，伴随脱氧核糖核酸变形，造成偶催化站点位置脱氧核糖核酸骨干近被动酪氨酸和协调一致的镁离子。
（22）以紫外荧光光谱为检测手段，比较研究了溶剂极性及盐酸胍对碳酸酐酶构象的影响。
（23）我也仍然是一个工作犬法官作为主审法官在所有苏联比赛，从工作的审判和判断的狗构象表明，在几乎所有前苏联共和国。
（24）近来，科学技术的探索发展使我们可以观察、检测甚至操纵单个分子并且研究它们的构象变化和动力学行为。
（25）醛缩酶和TNBS之间的反应支持酶分子的氨基（lishixinzhi），尤其是蛇肌醛缩酶的氨基在维护其天然构象中起着特殊作用的观点。
（26）通过氨基酸的结构可以推断其旋光方向，从旋光方向也可推断构型和构象。
（27）二氢叶酸还原酶去折叠过程中没有稳定存在的中间体，动力学过程中的两相可能是两种天然构象态的去折叠速度常数不同造成的。
（28）利用旋转异构态模型和伪立体化学平衡统计方法，得到考虑侧基的均方回转半径及温度系数的改进公式，研究典型的大侧基聚衣康酸酯链的构象和构型性质。
（29）胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于鱼类胰脏中，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。
（30）实验表明，S蛋白受体结合区无线性中和表位，中和抗体的产生是由构象表位诱导的。
