六种苯酚类化合物的高效液相色谱法测定
方法提要
在酸性条件下，用GDX-502固相萃取柱吸附水中酚类化合物，乙腈解析柱中有机酚，高效液相色谱-紫外检测器检测。
方法适用于饮用水、地下水及湖库水中苯酚、对硝基酚、间甲酚、2，4-二氯酚、2，4，6-三氯酚、五氯酚6种酚类的测定。对水中6种酚通常可检测到10～50ng/L水平。
仪器
高效液相色谱仪带紫外检测器，恒流梯度泵系统。
色谱柱WatersSymmetryC8，4.6mm×250mm，粒径5μm或性质相似的色谱柱。
GDX-502固相萃取小柱将使用过的SPE小柱填充物去掉并清洗干净，湿法加入约为0.5g纯化溶胀后的GDX-502树脂，打开活塞放出甲醇，直到液面刚好达到树脂床顶部。用10mL乙腈淋洗树脂，再用10mL水淋洗树脂，每次淋洗保持液面不低于树脂床。
针头过滤器孔径0.45μm，直径13mm，有机系。
固相萃取装置12管固相萃取装置。
真空泵。
采样瓶1L具磨口玻璃塞的棕色玻璃细口瓶。
氮吹仪。
微量注射器10μL、50μL、100μL、1000μL等气密性微量注射器。
K.D浓缩瓶25mL，带1mL定量管，须标定容积后使用。
试剂
空白试剂水去离子水蒸馏再经Millipore处理。
高效液相色谱流动相为水(含1%乙酸)和乙腈的混合溶液。
碳酸氢钠溶液c(NaHCO3)=0.05mol/L。
硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)。
乙腈，甲醇HPLC级。
丙酮(C3H6O)农残级。
乙酸。
盐酸。
标准储备溶液苯酚、对硝基酚、间甲酚、2，4-二氯酚、2，4，6-三氯酚、五氯酚六种的混标，购自国家标准物质研究中心。保存在-18℃冰箱中。
GDX-502树脂使用前用丙酮浸泡数日，数次更换新溶剂到丙酮无色。再用乙腈回流提取6h以上。纯化后的树脂密封保存在甲醇中备用。
替代物标准2-氟苯酚和2，4，6-三溴苯酚混标。
样品的采集与保存
1)水样采集。必须采集在玻璃容器中，在采样点采样及盖好瓶塞时，样品瓶要完全注满，不留空气。若水中有残余氯存在，要在每升水中加入80mg硫代硫酸钠除氯。
2)水样保存。避光、4℃下中保存。采样后7d内完成提取。40d内完成分析。
分析步骤
1)水样预处理。用孔径0.45μm的玻璃纤维滤膜，去除水中机械杂质。根据水中酚类化合物含量，取水样50～1000mL，加入2-氟苯酚和2，4，6-三溴苯酚等替代物标准，用6mol/LHCl调至pH2。水样以10mL/min的流速流经已活化的GDX-502固相萃取柱。当水样完全流过柱子后，用0.05mol/L碳酸氢钠溶液10mL淋洗柱子。用N2或空气将柱中水分充分抽干。用4mL每次1mL乙腈淋洗小柱，前两次淋洗液需在柱中平衡10min，后两次平衡2min，合并淋洗液，最终用乙腈定容为1.00mL。0.45μm有机相滤膜过滤，HPLC分析。
2)校准曲线。
3)高效液相色谱分析条件。
紫外检测器:双波长检测，检测波长280nm和290nm。柱温35℃。
流动相组成:A泵，99%水+(1+99)乙酸B泵，100%乙腈。
流动相流量:1mL/min，恒流。梯度洗脱，洗脱程序，见表82.41。
表82.41 洗脱程序
4)色谱图的考察。见图82.13。
定性与定量分析
1)定性分析。以样品保留时间和标样保留时间相比较来定性。根据标准色谱图各组分的保留时间，确定出被测样品中目标物数目和名称。对有检出的样品需用其他方法确证，如GC-MS等技术。
图82.13 六种标准酚类样品在不同检测波长下的液相色谱图(2μg/mL)
2) 定量分析。每个工作日必须测定一种或几种浓度的标准溶液来检验校准曲线或响应因子。如若某一化合物的响应值与预期值间的偏差大于 10%，则必须用新的标准对该化合物绘制新的校准曲线或求出新的响应因子。使用紫外检测器时，6 种酚类的最大吸收波长不同，为提高分析灵敏度，苯酚、间甲酚采用 280nm 波长定量对硝基酚、2，4 -二氯酚、2，4，6-三氯酚、五氯酚采用 290nm 波长定量。计算公式参见式 (82.16) 。
方法性能指标
1) 精密度、检出限和线性范围。按实验方法，配制浓度为 0.5μg / mL 酚类混合标准样品，按选定的工作条件分析，重复检测 7 次，计算方法的精密度。检出限的测量是以相对于基线噪音 3 倍时组分峰高所对应的浓度。各组分的精密度、检测下限和线性范围见表82.42。
表82.42 方法精密度、检出限及线性范围
2) 准确度。分别将 50μL 浓度为 2μg / mL 的混合标准样品加入 0.25L 和 1.0L 试剂空白水中，用 502 树脂固相萃取柱吸附富集，洗脱后定容 1.0mL，HPLC 测定，计算加标回收率。结果见表82.43。
表82.43 方法的准确度
3) 基体加标回收率。从北京不同地区取护城河水过滤后，分别取 1L 水加入表82.44中不同量的标准样品，及未加入标准样品的 1L 水，经水样预处理，在 HPLC 上检测，得到加标回收率。
表82.44 地表污水加标回收率
注: 2-氟苯酚、2，4，6-三溴苯酚为替代物，回收率均符合控制限要求。
两者的气味不同，一闻便知
苯酚俗名石炭酸，分子式C6H5OH，比重1.071，熔点42～43℃，沸点182℃，燃点79℃。无色结晶或结晶熔块，具有特殊气味。置露空气中或日光下逐渐变成粉红色至红色，在潮湿空气中，吸湿后，由结晶变成液体。有特臭，有毒，有强腐蚀性。室温微溶于水，能溶于苯及碱性溶液，易溶于乙醇、乙醚、氯仿、甘油等有机溶剂中，难溶于石油醚。常用于测定硝酸盐、亚硝酸盐及作有机合成原料等。
苯酚工业生产以异丙苯法为主，该法具有产品纯度高、原料和能源消耗低等优点，但其发展受联产物丙酮的制约。近年来，人们开始研究苯直接羟基化（也称氧化）制苯酚的方法，其中有些成果已显示出工业化前景。目前研究的氧化剂类型主要有N2O、H2O2、O2/H2等。
苯酚主要用于生产酚醛树脂、己内酰胺、双酚A、己二酸、苯胺、烷基酚、水杨酸等，此外还可用作溶剂、试剂和消毒剂等，在合成纤维、合成橡胶、塑料、医药、农药、香料、染料以及涂料等方面具有广泛的应用。
苯的沸点为80.1℃，熔点为5.5℃，在常温下是一种无色、有芳香气味的透明液体，易挥发。苯比水密度低，密度为0.88g/ml，但其分子质量比水重，。苯难溶于水，1升水中最多溶解1.7g苯；但苯是一种良好的有机溶剂，溶解有机分子和一些非极性的无机分子的能力很强。
苯能与水生成恒沸物，沸点为69.25℃，含苯91.2％。因此，在有水生成的反应中常加苯蒸馏，以将水带出。
利用苯酚法可以直接从动物组织中提取RNA,组织匀浆用苯酚处理并离心后,RNA即溶于上层被酚饱和的水层中,DNA和蛋白质则留在酚层中,向水层加入乙醇后RNA即呈白色絮状沉淀析出.操作步骤
1 称取3克肝组织,剪成小块,置于研钵中,加3-4滴90%的苯酚溶液后研磨,匀浆中加入15mL水,转移至三角烧瓶中,加10mL酚至三角烧瓶中.2 室温下剧烈振荡45分钟,于3000rpm离心20分钟.3 用吸管将上层液吸出,并加入1/2体积的氯仿-异戊醇,于低温下振荡20分钟,以除去提取液中的蛋白质,以2000rpm离心10分钟,吸出上层清液,向上清液中加入醋酸钾粉末,使最后浓度大约为2%,装入小烧杯后,一边搅拌,一边缓慢加入两倍于上清液体积的95%乙醇以沉淀RNA.4 于冰浴中放置半小时后,以1000rpm离心5分钟,沉淀再用少量75%乙醇洗涤1-2次,收集沉淀,置于干燥器内干燥,称重.5 测定A260/A280的值,应大于1.85,若小于1.85,则说明含杂蛋白和DNA高了.
GB/T 15351—94
化 学试剂
苯 酚 红
Chemical reagent
Phenol red
本试剂为红色结晶性粉末，易溶于乙醇及碱溶液中，不溶于三氯甲烷及醚中。
示性式：C19H14O5S
结构式：
相对分子质量:354.38（按1991年国际相对原子质量）
1 主题内容与适用范围
本标准规定了化学试剂苯酚红的技术要求、试验方法、检验规则和包装及标志。
本标准适用于化学试剂苯酚红的检验。
2 引用标准
GB/T 601化学试剂滴定分析（容量分析）用标准溶液的制备
GB/T 603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备
GB/T 604化学试剂酸碱指示剂pH变色域测定通用方法
GB/T 619化学试剂采样及验收规则
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 9721化学试剂分子吸收分光光度法通则（紫外和可见光部分）
GB/T 9741化学试剂灼烧残渣测定通用方法
HG 3—119 化学试剂 包装及标志
3技术要求
3.1 pH变色域:
1.2(橙)～3.0(黄)；
6.5(棕黄)～8.0(紫红)。
3.2 最大吸收波长（nm）：
λ1(pH1.2)…………………………………503～506
λ2(pH3.0)…………………………………430～435
λ3(pH6.5)…………………………………430～435
λ4(pH8.0)…………………………………557～560
3.3 质量吸收系数（L/cm•g）：
a1(λ1,pH1.2干样)…………………………………110～123
a2(λ2,pH3.0干样)…………………………………60～68
a3(λ3,pH6.5干样)…………………………………62～72
a4(λ4,pH8.0干样)…………………………………120～135
3.4 杂质最高含量：
%
名 称 指 示 剂
碱溶解试验
干燥失重
灼烧残渣（以硫酸盐计） 合格
1.0
0.2
4试验方法
本试验方法中标准滴定溶液、制剂及制品和pH缓冲溶液，除另有规定外，均按GB/T 601、GB/T 603、GB/T 604之规定制备，实验用水应符合GB/T 6682中三级水规格。
4.1 pH变色域测定
按GB/T 604的规定测定。
4.2 最大吸收波长测定
按GB/T 9721之规定测定，其中：
4.2.1 测定条件
吸收池厚度：1cm；
参比溶液：水。
扫描范围：400～700nm。
4.2.2 测定方法
称取0.100g预先于105±2℃干燥至恒重的试样，精确至0.0001g。加14.20mL氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=0.02mol/L]，水浴加热溶解，冷却后，置于500mL容量瓶中，并用无二氧化碳的水稀释至刻度，摇匀。
量取2.00mL、3.00mL、3.00mL、2.00mL上述试样溶液，各置于100mL容量瓶中，分别用pH1.2，pH3.0，pH6.5，pH8.0缓冲溶液稀释至刻度，摇匀。按GB/T 9721中7.2.1条之规定，测量出最大吸收波长及相对应的吸光度A（A用于质量吸收系数的计算）。
4.3 质量吸收系数
质量吸收系数按式（1）计算：
a = A ……………………………………(1)
b•c
式中：a----质量吸收系数,L/cm•g
A----4.2.2条中所测得的吸光度；
b----吸收池厚度，cm
c----试样溶液的浓度，g/L
4.4 杂质测定
试样称量须精确至0.01g。
4.4.1 碱溶解试验
称取0.1g样品，加0.3mL氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=1mol/L]溶解，稀释至250mL，应全溶清亮，无机械杂质。
4.4.2干燥失重
称取1g样品，精确至0.0001g，置于已在105±2℃干燥至恒重的称量瓶中，于105±2℃的电烘箱中干燥至恒重。
干燥失重按式（2）计算：
X = m1－m2 ×100 …………………………(2)
m1
式中：X----干燥失重，%；
m1----恒重前样品的质量，g；
m2----恒重后样品的质量，g；
4.4.3灼烧残渣
称取0.5g样品，按GB/T 9741中4.1条之规定测定。结果按GB/T 9741中第5章 之规定计算。
5检验规则
按GB/T 619的规定进行采样及验收。
6 包装及标志
按HG 3—119的规定，其中：
内包装形式：Gz-3；
外包装形式：W-1；
包装单位：第2类。
附加说明：
本标准由中华人民共和国化学工业部提出。
本标准由北京化学试剂总厂归口。
本标准由北京化工厂负责起草。
本标准主要起草人郝玉林、关瑞宝、强京林、刘冬霓。
本标准自实施之日起，原化学工业部部标准HG 3—957—76《化学试剂 苯酚红》作废。
剧烈振荡可使DNA断裂，故操作时应尽量轻柔、缓慢地颠倒混匀。
要获得高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。
DNA在260nm处有一吸收峰，而蛋白质在280nm处有吸收峰。当纯度比值小于1.6时，应考虑进行再次纯化。
整个实验须接触多种有毒、有腐蚀性试剂，故应注意操作规范安全。
【解析】：
1、酚试剂法要求0.5L/min采10L（20min），是方法标准的规定。其依据是保证程度结果的可信度。
2、测1h均值至少采45min，是<室内空气质量标准>中关于筛选法的规定。是对结果做评价的要求。它比方法标准的要求跟可靠和更科学。
3、关于采45min，在标准里没有严格具体规定。一般是连续采样45min。也可以间断采样累加时间是45min 以上（要求采样环境条件不 改变为宜）。
