苯酚：氯仿：异戊醇为什么要25:24:1

苯酚、氯仿、异戊醇抽提DNA的原理是通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质,再加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.

使用苯酚抽提细胞 DNA 时,苯酚的作用是使蛋白质变性,同时抑制了 DNase 的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与 DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶.蛋白分子溶于酚相,而 DNA 溶于水相.

氯仿的作用是克服酚的缺点；加速有机相与液相分层.最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚.（酚易溶于氯仿中）

用酚-氯仿抽提细胞基因组 DNA 时,通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇,为什么?因为异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡.异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡 产生.另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含 DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定.

配制好的酚：氯仿：异戊醇会分层吗

上层是水.

氯仿：使有机相和水相易分层,增加核酸得率,同时可除去脂类.

1. 说明：从核酸样品中除去蛋白质时常常使用苯酚/氯仿/异戊醇（25 : 24 : 1).氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离,而异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡.

2. 配制方法：将Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊醇（24 : 1）混合均匀后,移入棕色玻璃瓶中4℃保存.

两种可能：

1、氯仿的体积比水（也就是Trizol）略少，出现了乳化现象，补加一点氯仿再多静置一会儿即可；

2、使用的氯仿已经变质（如吸水等因素），造成乳化现象，所以不分层。

望采纳，谢谢！

酚:氯仿:的目的是沉淀蛋白质原理如下：酞与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时,蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去,使蛋白失去水合状态而变性过离心,变性蛋白质的密度比水的密度为大,因而与分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开.水相异戊醇的目的是减少抽提过程中的泡沫产生,原理如下：在抽提DNA时,为了混合均匀,必须剧烈振荡容器数次,这时在混合液内易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用.加入异戊醇能降低分子表面张力,所以能减少抽提过程中的泡沫产生.

组织抽提前应保存于液氮中，以免DNA受到破坏；纯化时应时刻注意抑制核酸酶的污染，使用EDTA等防止DNA降解。

剧烈振荡可使DNA断裂，故操作时应尽量轻柔、缓慢地颠倒混匀。

要获得高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。

DNA在260nm处有一吸收峰，而蛋白质在280nm处有吸收峰。当纯度比值小于1.6时，应考虑进行再次纯化。

整个实验须接触多种有毒、有腐蚀性试剂，故应注意操作规范安全。

酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去，氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质，本身酚：氯仿：异戊醇=25：24：1的主要作用是抽提蛋白质

刚期末考完居然有人问……要再过一星期我就回答不出来了5555

CTAB法原理CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

CTAB提取缓冲液的经典配方

Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；

NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；

β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除

PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？

使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。

氯仿的作用？

氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）

用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？

异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？

用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。

简言之，无论哪种抽提方法，药品的作用基本都是一样的

首先告诉你：酚和氯仿/异戊醇不是提取DNA方法，只是除杂的溶液！

常见问题就是除杂不彻底，除杂过程导致DNA断裂。

我做实验，材料里蛋白不太多不用苯酚，氯仿：异戊醇24:1就可以了。

操作中一定要把溶液混匀，这样离心后除杂效果才好！混匀过程要温柔，以免DNA断裂。