加2ml含0.3m盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀怎么配

二巯基丙醇的作用是断裂多肽链之间的二硫键（共价键），故5000的蛋白质由2条多肽链通过二硫键结合而成。盐酸胍的作用断裂蛋白质之间的氢键，而不会破坏蛋白质之间的共价键，改变蛋白质的空间结构。使蛋白质由多聚体变成单聚体。所以该蛋白质的可能结构是：由2条不同的多肽链通过二硫键结合形成分子量为5000的单聚体蛋白，在通过6个这样的单聚体蛋白通过蛋白质之间的氢键，范德华作用力等次级键相互折叠缠绕成分子量为30000的蛋白质。

希望得到你的认可哦！

1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。

2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。

3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃

4、提取上清液，样品制备完成。

蛋白质提取液：300ml

1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml

2、甘油（Glycerol）75ml

3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g

这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！

二、植物组织蛋白质提取方法

氯醋酸—丙酮沉淀法

1、在液氮中研磨叶片

2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。

3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。

4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。

5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。

药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。

这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！

三、组织：肠黏膜

目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达

应用TRIPURE提取蛋白质步骤：

含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）

倒转混匀，置室温10min

离心：12000 g，10min，4度，弃上清

加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）

振荡，置室温20min

离心： 7500g，5 min，4度，弃上清

重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次

沉淀中加入100％乙醇 2ml

充分振荡混匀，置室温20 min

离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀

1％SDS溶解沉淀

离心：10000g，10min，4度

取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT）

存在的问题：加入1％SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。

解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。

四、植物材料：水稻苗，叶鞘，根

1、200毫克样品置于冰上磨碎

2、加lysis buffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清

3、重复离心5min

lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40

五、蛋白质样品制备

秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。

100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，15000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。

按每mg干粉加入20μl（可调） UKS液[9.5 M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃温育30min，期间搅动几次，28度 （温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000 r/min离心15 min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存

六、植物根中蛋白质的抽取

(1) sample, 液氮研磨

(2) 装1.5 ml centrifuge 用tube

(3) 加 1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul

(4) 12000 rpm, 4度, 10-15minite

(5) 取上层液，蛋白质就在里面

2 测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。

3 二硫键的断裂。几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。

二硫键的切割与保护（元素后数字为下标）

a 过甲酸〔performic acid〕 不可逆

－CH2SO3H

b、还原＋氧化 不可逆

[ 巯基乙醇，DTT ] ＋ 碘乙酸等

－S-CH2-COOH

c、亚硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆

－R1-S-S-R2 ＋ HSO3-

R1-S- + R2-S-SOH3

可以通过加入盐酸胍的方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。

巯基（-SH）的保护4 测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比（如右图）

5 分析多肽链的N-末端和C-末端

多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法（Sanger法；Edman法；DNS-Cl；酶降解法），C末端分析法（肼解法；酶降解法；硼氢化锂法）。

6 多肽链断裂成多个肽段。可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。

7 测定每个肽段的氨基酸顺序

8 确定肽段在多肽链中的次序。

利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。

9 确定原多肽链中二硫键的位置

一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将可能含有二硫键的肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。