乙醇,冰醋酸为什么能固定细胞
乙醇对组织细胞的处理既有固定作用又有脱水作用,乙醇借沉淀作用使蛋白质变性,固定组织以80%～95%浓度为好
冰醋酸：5%水溶液可作固定用。不能沉淀白蛋白，但能沉淀核蛋白。渗透性强，固定快，能使红细胞膨胀而破碎，常与其它液体配合使用。
卡诺氏固定液(Carnoy's Fluid) 适用于一般植物组织和细胞的固定,常用于根尖,花药压片及子房石蜡切片等.有极快的渗透力,根尖材料固定15—20min即可,花药则需1h左右,此液固定最多不超过24h,固定后用95%酒精冲洗至不含冰醋酸为止如果材料不马上用,需转入70%酒精中保存. .固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
1. 取适量植物组织（新鲜组织100 mg 或干重组织30 mg）在研钵中加入液氮充分碾磨成细粉。
2.转移细粉到一个1.5ml离心管，不要解冻，加600μl 65℃预热的裂解液PL (确认已加入β-巯基乙醇至2%)，剧烈涡旋振荡混匀，用大口径枪头轻柔吹打帮助裂解。
如果组织裂解困难，可根据需要加一个轻柔匀浆10秒的步骤帮助裂解。
3.65℃水浴20-60分钟，在水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
可选:如果组织干燥或者产量低，可以适当延长水浴时间。如果RNA残留多，可在水浴前加入6μl RNA酶（20mg/ml）。
注：如果提取的DNA残留RNA较多导致电泳时候条带拖尾，条带扭曲，背景很高等不正常电泳情况，可以加1% RNA酶（10mg/ml）37℃或者室温放置半小时即可消化RNA，消化完后不需要特殊处理便可用于PCR或者酶切。
4.加入700μl氯仿或者氯仿/异戊醇（体积比24：1混合），颠倒充分混匀几分钟（或者涡旋混匀），13,000rpm 离心5分钟。
若提取的植物组织富含多糖多酚，可以在第4步前用等体积酚/氯仿（1：1）抽提一遍。
5.小心吸取上清到一个新的1.5ml离心管，注意不要吸到界面物质。
如上清比较浑浊，则需要重复步骤4一遍，直到得到透亮上清。
6.较精确估算上清量，加入1.5倍体积结合液PQ （请先检查是否已加入无水乙醇!）后立刻涡旋，充分混匀。此时可能出现沉淀，但不影响实验结果。
7.将上一步所得混合物（包括可能出现的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液（先加700μl离心，弃废液，再加入剩余的溶液，再次离心）。
8.加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。
9.加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。
10.加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。
11.将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
12.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热），室温放置3-5分钟，12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果预计和需要产量高，可增大洗脱体积，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。
13.DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20℃。
附录（低DNA含量或者产量低样品操作步骤）：
1.取适量植物组织（新鲜组织400 mg 或干重组织200 mg）在研钵中加入液氮充分碾磨成细粉。
2.转移细粉到一个15ml离心管，不要解冻，加入9ml 65℃预热的裂解液PL (确认已经加入β-巯基乙醇至2%)，剧烈涡旋振荡混匀，用大口径枪头吹打帮助裂解。
如果组织裂解困难，可根据需要加一个轻柔匀浆10秒的步骤帮助裂解。
3.室温放置60分钟，中间不时颠倒离心管以混合样品数次。
如果组织干燥或者产量低，可以放置在65℃水浴。
4. 加4.5ml氯仿/异戊醇（体积比24：1混合），涡旋充分混匀，3,000g离心10分钟。
5.小心吸取上清到一个新的15ml离心管，注意不要吸到界面物质。重复一遍步骤4。
6.小心吸取上清到一个新的15ml离心管，估算上清量，加入0.7倍体积的异丙醇，涡旋混匀来沉淀DNA。
7.立刻3,000g离心20分钟沉淀DNA，弃上清，颠倒离心管口放在纸巾上控干残留液体，并小心用用移液枪吸干沉淀周围残留液体（不要过于干燥DNA沉淀）。
8.加入300μl－400μl预热到65℃的灭菌水，重新溶解DNA，可能需要在65℃短暂温育帮助溶解，期间不断轻弹管底帮助溶解。
9.加入1.5倍体积结合液PQ（450μl－600μl，请先检查是否已加入无水乙醇!）后立刻涡旋，充分混匀。此时可能出现沉淀，但不影响实验结果。
10.后续步骤和上面标准操作步骤7开始后完全一样。
乙醇可以自由扩散出入细胞膜。故而其可以对细胞膜的通透性产生影响，对细胞有一定的毒害作用。
其代谢产物，比如乙醛，也对细胞有毒害作用。
高浓度的乙醇可以渗透入细胞内，使胞内蛋白变性，到达杀灭细胞的效果。这也是乙醇灭菌的原理。
实验方法原理： 体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。
分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。
实验步骤：
一、消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。
二、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。
三、取出盖片，按下列顺序操作：
PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。
四、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。
五、计算
分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100%
BrdU参入法
实验方法原理： 细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。
单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。
BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占1/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。
一、试剂配制
二、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10 μg/ml。
三、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1 μg。
四、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。
五、常规染色体制片。
六、染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC 液，距紫外灯管6 cm处紫外照射30分钟。
七、弃去2×SSC液，流水冲洗。
八、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。
九、镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。
十、计算
细胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小时）
细胞周期 （cell cycle) 是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，分为间期与分裂期两个阶段。
1.间期
间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。
（1）G1期
此期长短因细胞而异。体内大部分细胞在完成上一次分裂后，分化并执行各自功能，此G1期的早期阶段特称G0期。在G1期的晚期阶段，细胞开始为下一次分裂合成DNA所需的前体物质、能量和酶类等。
（2）S期
S期是细胞周期的关键时刻，DNA经过复制而含量增加一倍，使体细胞成为4倍体，每条染色质丝都转变为由着丝点相连接的两条染色质丝。与此同时，还合成组蛋白，进行中心粒复制。S期一般需几个小时。
（3）G2期
为分裂期做最后准备。中心粒已复制完毕，形成两个中心体，还合成RNA和微管蛋白等。G2期比较恒定，需用1～1.5小时。
2.分裂期
细胞的有丝分裂（mitosis）需经前、中、后，末期，是一个连续变化过程，由一个母细胞分裂成为两个子细胞。一般需1～2小时。
（1）前期（prophase） 染色质丝高度螺旋化，逐渐形成染色体（chromosome）。染色体短而粗，强嗜碱性。两个中心体向相反方向移动，在细胞中形成两极；而后以中心粒随体为起始点开始合成微管，形成纺锤体。随着核仁相随染色质的螺旋化，核仁逐渐消失。核被膜开始瓦解为离散的囊泡状内质网。
（2）中期（metaphase） 细胞变为球形，核仁与核被膜已完全消失。染色体均移到细胞的赤道平面，从纺锤体两极发出的微管附着于每一个染色体的着丝点上。从中期细胞可分离得到完整的染色体群，共46个,其中44个为常染色体,2个为性染色体。男性的染色体组型为46，XY，女性为46,XX。分离的染色体呈短粗棒状或发夹状，均由两个染色单体借狭窄的着丝点连接构成。
（3）后期（anaphase） 由于纺锤体微管的活动，着丝点纵裂，每一染色体的两个染色单体分开，并向相反方向移动，接近各自的中心体，染色单体遂分为两组。与此同时，细胞波拉长，并由于赤道部细胞膜下方环行微丝束的活动，该部缩窄，细胞遂呈哑铃形。
（4）末期（telophase） 染色单体逐渐解螺旋，重新出现染色质丝与核仁；内质网囊泡组合
为核被膜；组胞赤道部缩窄加深，最后完全分裂为两个2倍体的子细胞。
在体内根据细胞的 分裂能力 可把它们分为三类：
①增殖细胞群 ，如造血干细胞，表皮与胃肠粘膜上皮的干细胞。这类细胞始终保持活跃的分裂能力，连续进入细胞周期循环。
②不再增殖细胞群 ，如成熟的红细胞、神经细胞、心肌细胞等高度分化的细胞，它们丧失了分裂能力，又称终末细胞（end cell）。
③暂不增殖细胞群 ，如肝细胞、肾小管上皮细胞、甲状腺滤泡上皮细胞。它们是分化的，并执行特定功能的细胞，在通常情况下处于G0期，故又称G0期细胞。在某种刺激下，这些细胞重新进入细胞周期。如肝部分切除术后，剩余的肝细胞迅速分裂。
流式细胞仪
实验方法原理： 流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。
细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。
实验步骤：
一、取对数生长期细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，800 rpm，离心15 min去上清。
二、PBS洗2次，加0.5 mLPBS吹匀，务必吹散。
三、用5 mL注射器将细胞吸起，用力打入5 mL 70%(预冷)乙醇中，封口膜封口。4℃固定过夜（可长至2周）。
四、800 rpm 15 min收集固定细胞，PBS洗2次。
五、用0.4 mLPBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打（防止细胞破碎）。
六、加RNase-A约3 μL至终浓度约为50μg/mL ，37℃水浴消化30 min；
七、加PI约50 μL至终浓度约为65μg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。
八、用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，上机检测。
九、样品分析测定及打印。
常见问题
1.Q：胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查，取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？
A：以乳腺细胞的DNA含量测定为例，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加70%冰乙醇固定，要保证冰乙醇的最终浓度为50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时，最多可保存一个月，上机检测前再加PI综合染液。保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为5%.
2.PI分析细胞周期及凋亡率相关问题
Q： （1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配吗？
A：RNaseA用PBS配制没有问题，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。
Q： （2）测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶，可以一起检测吗？
A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定。
Q： （3）Triton－x－100是固定剂吧，用了70％的冷乙醇（是4℃吗？），是不是就不用Triton－x－100固定了？
A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定剂，可以用75％的乙醇于-20度固定。
Q： （4）还要设什么内参标准（5％鸡红细胞）吗？
A：对照肯定是需要的，这个根据自己的需要进行设置。
3.Q：流式检测细胞周期时加RNA酶所需的温度？
A：其实有关RNA酶在凋亡检测制样过程中使用的必要性问题尚有人持不同意见，该观点的人认为RNA酶在环境中无所不在，常规制样过程中所接触的试剂和环境中的RNA酶已足以降解样品中的RNA，所以为了简便实验操作，也有人不加RNA酶或如你所参考的方法将其与PI染液一起使用。不过经典的方法还是“先加RNA酶37度孵育30min，然后加PI
4度孵育30min”。至于染色时使用4度，是因为低温可减弱分子运动，增强荧光染料结合的稳定性和减少可能的荧光损耗。
4.Q：肿瘤细胞测周期。70％乙醇是否必须用PBS和乙醇配，用水配细胞会碎裂，PBS和乙醇配会出现絮状物？上流式前细胞用75％乙醇固定，使用瓶装75％乙醇是否可行？
A：先用冷PBS悬浮细胞，大约1-2ml，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入无水乙醇，终浓度为70-75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。乙醇固定之后没有细胞沉淀。
5.Q：流式分析细胞周期，收集了10的6次方细胞，但细胞在乙醇固定之后，还看到有细胞沉淀的，但PBS洗涤两次之后，就基本没什么细胞沉淀了，上机发现看不到细胞了。这是怎么回事啊？怎么解决这个问题啊？
A：很可能是洗细胞的过程中丢失了，解决办法有：
（1）尽量采用尖底的离心管和水平离心机
（2）离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒；吸上清时最好残留1mm左右的水膜，不要吸完。
（3）离心的转速或时间可稍微增加一点儿
（4）每次加抗体时，吸头最好不要接触液面；混匀时最好不要用吸头吹打，以免吸头挂壁带走部分细胞。
