检测核酸纯度方法

首先

Warburg和Christian（1942）提出OD260/OD280比值是蛋白制品被核酸所污染程度的很好指标。当蛋白中掺入了核酸之后，OD260/OD280比值变化很明显，尤其是纯的蛋白制品中掺入了一点点核酸后，变化最明显。例如：纯的蛋白样品，其OD260/OD280比值为0.57，而掺入5%的核酸之后，该笔直上升到了1.06。

但是反过来却是不成立的，即：这个比值不能用来指示核酸被蛋白污染的程度。因为核酸在260nm和280nm处的消光系数比蛋白质高很多，即使有明显的蛋白污染也不会大幅度改变核酸溶液的OD260：OD280比值。例如，纯的核酸的OD260：OD280比值是2.0，当掺入了5%的蛋白质污染之后，OD260：OD280比值变成1.99，掺入20%的蛋白质污染后，也才变成1.96。这就说明这个比值用来指示核酸被蛋白污染的程度是非常不灵敏的。

从下面这个表中就可以明显看出来。

蛋白质／ 核酸／ OD260:OD280

10000.57

95 51.06

90101.32

85151.48

80201.59

75251.67

70301.73

65351.78

60401.81

55451.84

50501.87

45551.89

40601.91

35651.93

30701.94

25751.95

20801.96

15851.97

10901.98

5 951.99

0 1002

说得再明白一些，这个比值更适合衡量蛋白质中核酸的污染度的。

其次

蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，但一定要注意：以上三者的吸收最高峰并不都在280nm处，其分别为257nm，275nm和280nm。当蛋白中的色氨酸含量偏高或偏低时，就一定会对260nm处的核酸吸收峰造成很大的影响。

第三

通常，使用 A260/A280 判断核酸的纯度。A260/A280 是一个给大家带来许多困惑的指标。以RNA为例，首先要明确该指标用于核酸的原始含义是：纯的 RNA，其 A260/A280 = 2.0 左右。纯 RNA 是‘因’，A260/A280 = 2 是‘果’。现在大家却在拿 A260/A280 当‘因’用，认为“如果 A260/A280 = 2，所以 RNA 是纯的”，自然会产生困惑。有兴趣的话，可以在你的 RNA 样品中加入一点抽提中经常使用的试剂，如苯酚，异硫氰酸胍，PEG 等，再测 A260/A280 比值。现实是，许多抽提 RNA 时使用的试剂，以及样品中的许多杂质都在 A260 和 A280 处附近有吸收，对 A260/A280 产生影响。

目前最具有指导性的做法是：对 RNA 样品在 200-300 nm 范围扫描。纯 RNA 的曲线具有如下特点：曲线平滑，A230 和 A260 是两个拐点，A300 接近 0，A260/A280 = 2 左右，A260/A230 = 2 左右，A260/A215 = 1 左右。如果没有扫描数据，除了测定 A260/A280 比值外，也一定要测定 A260/A230 比值，因为该比值对所有影响酶反应的杂质的残留更敏感。另外，要考虑设备的线形范围 (如 A260 要处于 0.1 - 0.5 之间)，超出线形范围的读数没有太大参考价值的。另外有两个有趣的现象：在水中测定 A260/A280，比值将变低 0.3 左右；而在 10mM EDTA 中测定的比值比在 1mM EDTA 中测定的高 0.2 左右。这两点也是要注意的，所以当我们用DEPC处理过的水溶解RNA并测定其260/280比值的时候，往往都是小于2.0的。

A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。

A260:A230是分光光度计测量RNA溶液的浓度出现的数值，表示样品的纯度。

1、A260nm：核酸的吸收峰测，测RNA，DNA等的浓度用的。260nm是核酸分子吸收峰的波长，是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1至1.0。如果不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内；如果吸光度小于0.05，检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等）影响。

2、A230nm：测定碳源物质，如酚，糖类等浓度用的，是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估。A230表示样品在230nm的波长处出现了吸收。在A230处出现吸收峰的原因是样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等。

3、A260:A230可以表征样品的纯度，A260:A230的比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。

扩展资料

一、RNA质量检验。

RNA样品的品质检测一般分为总量，纯度与完整性三大项。

1、总量：微量分光光度计测260nm吸收值计算。

2、纯度：微量分光光度计测260nm/230nm吸收值的比值，用于评估有机溶剂残留；260nm/280nm吸收值的比值，用于评估蛋白质污染比例。

3、完整性：以Agilent Bioanalyzer进行毛细管电泳(capillary electrophoresis)，并以软件的RIN(RNA Integrity Number)分数评估，10为RNA完整性最好，0为最差。

二、RNA纯度。

RNA在纯化过程中容易受到DNA、蛋白质及有机溶剂的影响，这些残存物将会影响以后的操作。

光谱分析(NANODROP)利用物质对不同波长光的吸收度的不同，可以鉴别出溶液纯度及浓度。

RNA溶液的A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法，比值范围一般为1.8-2.1。各项实验对RNA纯度要求不一，比如即使比值超出这个范围，RNA样品也一样可以用于一些普通实验中，如Northern杂交、RT-PCR、荧光定量PCR和RNA酶保护等实验。

参考资料来源：

百度百科-分光光度计-核酸的定量

首先，分光光度计测量的样品必须是均一的，摇匀后再测量结果会准确些。它是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器。

核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260

nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD

的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。

事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如Eppendorf

Biophotometer的准确度≤1.0%（1A）。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。

除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8

或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。

分光光度计的重要配件——

比色杯

比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积，有比色杯和毛细比色杯等。一般测试核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法测定。因为反应中的染料（如考马斯亮兰）能让石英和玻璃着色，所以必须采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品。

由于另外测试的样品量不同，所以一般分光光度计厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不同的需求。目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量，亦可用于蛋白比色法测定的塑料杯，样品用量仅需50μl，比色杯单个无菌包装，可以回收样品。如Eppendorf

UVette塑料比色杯，是目前比色杯市场上一个革新。随着生命科学以及相关学科发展，对此类科学的实验研究提出更高的要求，分光光度计将是分子生物学实验室不可缺少的仪器，也成为微生物、食品、制药等相关实验室的必备设备之一。

当然，

随着科技的发展，现在比色杯已经不是使用分光光度计时的必备物品。目前国外Nanodrop公司（现已被Thermo

Fisher公司收购）生产的ND1000分光光度计与旧式分光光度计相比，已经可以做到无需稀释样品，无需使用比色杯，每次测量仅需1-2μl样品即可完成测量。

比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。

A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。

A260/A280和A260/A230是核酸纯度的指示值。纯度好的DNA或RNA，在pH7-8.5下A260 / A280的比值应该在2.0 或2.5。

纯净的样品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、盐（胍盐）等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0 。

当 0.5％BSA蛋白质污染时，蛋白污染会导致260和280的数值都下降，其净结果是260/280比值下降，但260/280的比值变化并不显著，正如分子克隆3所说。

但蛋白残留会导致230的数值显著上升，显著影响260/230的比值。也就是说，如果RNA样品的260/280＝1.7，260 /230＝0.5，那么就应该考虑污染原因不是胍盐残留，而是蛋白残留。

测DNA或RNA的OD值的含义：

范围内表示提取的DNA纯度较好,若小于1.7可能有蛋白污染，若大于2.0则说明有RNA污染或者DNA已经降解。260/230测的结果一般作为参考值，RNA提取时如果该值小于2说明裂解液中有异硫氰酸胍和巯基乙醇残留。

使DNA的纯度高，首先样品量合适，不能反复冻融，研磨时要充分，随时补充液氮，在样品未完全解冻前迅速加入裂解液中，后面的操作应尽量柔和，避免造成损伤。

RNA及DNA的提取,260/280测定用来鉴定DNA及RNA的纯度。260/280的值在1.8-2.0之间最好。

RNA 260/280<1.8说明有蛋白质、酚的污染，>2.0说明RNA降解。

DNA 260/280<1.8说明有蛋白质污染，>2.0说明RNA污染。

一般来说OD260代表核酸的吸光度，OD280代表蛋白质的吸光度。OD230来评估样品中是否存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等。

OD是optical density（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度， OD=lg（1/trans），其中trans为检测物的透光值。

扩展资料：

吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关，只要光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数就不变。

当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。

吸光度用A表示。

A=abc，其中a为吸光系数，单位L/(g·cm)，b为光在样本中经过的距离（通常为比色皿的厚度），单位cm ， c为溶液浓度，单位g/L。

A=Ecl

影响吸光度的因数是b和c。a是与溶质有关的一个常量。此外，温度通过影响c，而影响A。

参考资料来源： 百度百科-OD260/280比值

?核酸的变性主要指DNA的变性。核酸变性时双链间的氢键断裂成单链，但并不涉及共价键的断裂。引起DNA变性的因素很多，如高温引起的热变性，酸碱改变引起的酸碱变性等。

?2 DNA热变性现象

?当把DNA的稀盐溶液加热到80℃～100℃时，双螺旋结构即发生解体，两条链分开形成无规则线团。同时，一系列物化性质发生改变：260nm处紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高。由于二级结构的丧失，也失去了部分或全部生物活性。

?3 增色效应和减色效应

?当DNA分子加热变性后，其260nm的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。变性DNA复性后，在260nm处的吸收值减少的现象称为减色效应。

?4 DNA的复性

?变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的多核苷酸链重新结合成为双螺旋结构，以上过程称为复性。复性的条件是：(1)变性DNA只有在缓慢冷却时才能复性。如果DNA在沸水浴中加热数分钟后，骤然在冰浴中冷却至低温，DNA不能复性，这也是防止复性的方法。(2)DNA浓度愈大，复性愈快。(3)DNA片段愈长，复性也愈快。

?5 核酸分子杂交

?DNA杂交是指不同来源的DNA经热变性后，在慢慢冷却的复性过程中，由于异源DNA之间的某些区域有相同的序列，可以彼此结合形成杂交分子，称此方法为DNA分子杂交。DNA也可与互补的RNA之间发生杂交，形成DNA—RNA杂交分子。

?核酸杂交可在液相或固相上进行，由于硝酸纤维素膜只吸附变性DNA，故常用硝酸纤维素膜作核酸杂交的支持介质。

?6 如何应用核酸的紫外吸收

?由于嘌呤和嘧啶在240nm～290nm紫外线处表现出强烈的吸收性能，所以可以利用紫外分光光度计测定碱基、核苷、核苷酸和核酸，它们的最大吸收峰值在260nm附近。不同核苷酸有不同的吸收特性，可以此作定性定量检测。

?在研究中常用紫外分光光度计检测少量的DNA和RNA，纯样品和不纯样品的检测根据是：

?纯DNA：OD260／OD280＝1．8

?纯RNA：OD260／OD280＝2

?样品中如含杂蛋白及苯酚(它们在紫外也有吸收)，比值明显降低，故不纯样品不能用此法定量。

?7 熔解温度(Tm）是指什么?受什么因素影响?

?DNA变性的特点是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。通常把DNA双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的熔解温度（Tm）或称熔点。DNA的Tm值一般在70℃～80℃之间。

?影响DNA的Tm值的因素有：

?(1)DNA的均一性。均一性愈高的样品，熔解过程愈是发生在一个很小的范围内。

?(2)G—C之含量。由于G—C之间有3个氢键，因此G—C含量愈高，其Tm值也愈高，成正比关系。所以测定Tm值，可推算出G—C对的含量，其经验公式为：G—C％＝（Tm－69．3）×2．24。

?（3）介质中离子强度的影响。一般来说，离子强度愈低的介质中，DNA的熔解温度也较低，且熔解温度范围也较窄。所以DNA制备应保存在较高浓度的缓冲液中，常在1mol·mL－1的NaCl溶液中保存。