正相系统空白有负峰，流动相是正己烷和异丙醇

反相的色谱柱都是走的极性比较大的流动相的，比如水啊什么的。

正相色谱在过得都是正己烷啊，氯仿啊什么的极性比较小的流动相。

乙酸乙酯的极性很小的，可以拿它做正相流动相了，干嘛走反相的柱子呢？

第一，这个反相，是要求流动相极性大于固定相极性的情况，称为反相色谱。这个乙酸乙酯的极性这么小，怎么能算是反相呢？根本就没有实验的意义。

第二，如果用它来跑，反相柱子里面的填料会溶解的啊，估计过两次色谱柱就废了。这和正相色谱柱不能进水是一个道理。

在HPLC分析中，在色谱柱正常，样品浓度适宜，分析方法合适，色谱峰在出峰时间较短的条件下，峰型应对称而尖锐。但在实际操作中，如果对样品不了解，前处理不恰当或者分析方法不合理等，会出现峰形不正常的情况，其中双峰现象就是液相色谱中常见的问题之一。色谱双峰指的是明明是同一种物质，但在色谱图中却呈现双峰，让实验人员误认为含有两种物质。

出现色谱双峰的原因一般有以下几种：

色谱柱

如果在样品分析时发现每个色谱峰都有双峰出现，尤其在采用单一纯物质时，则可以确定是色谱柱出现问题了，一般是柱头受损或者柱头固定相污染引起的。

如果进样量少，原来色谱柱正常，色谱峰的形状多为一大峰带一小峰，不一定拖尾，这一般应是柱头受堵，将色谱柱反过来接，用流动相冲洗或酸洗或其它溶剂，将堵在柱头的残留物冲掉，再反过来，一般情况下就行了。当然不反冲，正冲有时也会正常的。

如果峰拖尾，双峰强弱相差不大，柱头固定相变脏或流失可能性更大，这时可以将进样头拧开，将微孔滤片超声，柱头刮去一部分填料，重新填上新填料拧紧，不过这个对技术要求较高且不能经常做，否则用不了几次，色谱柱就会应柱效降低而报废。

如果上述不能解决问题，可能是柱塌陷造成的，此时需要更换色谱柱。

溶剂问题

目前HPLC分析多为反相色谱，流动相多为甲醇、乙腈、水，加各种添加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解，最佳的溶解方法是用流动相溶解。在实际分析中，有时候为了样品的溶解性或稳定性加入了一点的缓冲液，缓冲液的酸碱性可能会导致样品转化，从而产生双峰现象。此时需要更换缓冲液，调整溶剂pH值，或者用流动相配置样品。

此外，样品要现配现用，避免样品溶解液的有机相比例、pH值发生变化而导致的溶剂效应。

进样量

当用溶剂极性强度大的试剂，如纯甲醇、纯乙腈，纯乙醇，而分析体系中以水为主时，如果样品进样量大，如定量管为20ul，此时单一的纯物质会出现双峰，第二峰比第一峰小(每次都不太一样)，且拖尾，保留时间会提前(相对进样量少而言)，将进样量减少一半以上，峰型将变为正常。这是样品的溶剂与流动相极性相差太大，而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的，此情况下需要减少进样量。

另一个原因是，进样量不一定大，但绝对量很大，色谱图上的双峰紧靠在一起，基本上齐高，不拖尾(如果出峰很快，也可能是色谱柱问题)。将样品稀释再进样就可以了，这是由于进样量过大，色谱柱过载造成的。

pH值

体系pH值对色谱双峰的影响出现在各个环节上(前面已经提到)，尤其在缓冲液流动相平衡过程中其影响更为明显。当连续进样时，受pH的连续变化影响会经常遇到这种双峰的情况。另外，在样品分析时，流动相的pH尽量远离被分析物的等电点，否则也容易引起双峰的产生。在用离子对试剂分析时，选择不好条件也会容易引起双峰的产生。

样品特性

有些样品由于其化学结构的特点，存在互变异构现象，而这种互变异构体无法分开，而是以一个动态平衡存在。在色谱分析时，在一个特定的条件下(如pH值、流动相极性、温度等)，一种物质将出现双峰，双峰靠的很近，基本齐高，不拖尾，条件稍一变化，尤其pH，双峰现象将消失，如红霉素等。

有的样品紫外的色谱图上看不到双峰，但在LC-MS下，用质谱检测器，其质谱的总离子流图上较明显，如农药啶虫眯(吡虫清)。

1、液-固色谱法（液-固吸附色谱法）

固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。

①液-固色谱法的作用机制

吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。

流动相中的溶质分子X（液相）被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应：

X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）+nS（液相） 其作用机制是溶质分子X（液相）和溶剂分子S（液相）对吸附剂活性表面的竞争吸附。

吸附反应的平衡常数K为：

K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。 K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。

发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。

②液-固色谱法的吸附剂和流动相

常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。

一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。

对流动相的基本要求： 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小

流动相不能影响试样的检测

常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。

③液-固色谱法的应用

常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。

2、液-液色谱法（液-液分配色谱法）

将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。

①液-液色谱法的作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。

液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：K=C固/C液 K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。

②正相色谱和反相色谱

正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相。 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相。

一般地，正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性，而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。正相色谱适宜于分离极性化合物，反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。

③液-液色谱法的固定相 常用的固定液为有机液体，如极性的β，β′氧二丙腈（ODPN），非极性的十八烷（ODS）和异二十烷（SQ）等。

缺点：涂渍固定液容易被流动相冲掉。 采用化学键合固定相则可以避免上述缺点。

使固定浓与担体之间形成化学键，例如在硅胶表面利用硅烷化反应：形成Si-O-Si-C型键，把固定液的分子结合到担体表面上。

优点：

化学键合固定相无液坑，液层薄，传质速度快，无固定液的流失。 固定液上可以结合不同的官能团，改善分离效能。 固定液不会溶于流动相，有利于进行梯度洗提。

④液-液色谱法的应用

液-液色谱法既能分离极性化合物，又能分离非极性化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、稠环、染料、留族等化合物。化合物中取代基的数目或性质不同，或化合物的相对分子质量不同，均可以用液-液色谱进行分离。

3、离子交换色谱法

原理：离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的被测离子进行可逆交换，由于被测离子在交换剂上具有不同的亲和力（作用力）而被分离。

①离子交换色谱法的作用机制

聚合物的分子骨架上连接着活性基团，如：-SO3-，-N（CH3）3+等。为了保持离子交换树脂的电中性，活性基团上带有电荷数相同但正、负号相反的离子X，称为反离子。

②溶剂和固定相

两种类型：多孔性树脂与薄壳型树脂。

多孔性树脂：极小的球型离子交换树脂，能分离复杂样品，进样量较大；缺点是机械强度不高，不能耐受压力。

薄壳型离子交换树脂：在玻璃微球上涂以薄层的离子交换树脂，这种树脂柱效高，当流动相成分发生变化时，不会膨胀或压缩；缺点是但柱子容量小，进样量不宜太多。

③离子交换色谱法的应用

主要用来分离离子或可离解的化合物，凡是在流动相中能够电离的物质都可以用离子交换色谱法进行分离。

广泛地应用于：无机离子、有机化合物和生物物质(如氨基酸、核酸、蛋白质等)的分离。 4.凝肤色谱法（空间排阻色谱法）

凝胶是一种多孔性的高分子聚合体，表面布满孔隙，能被流动相浸润，吸附性很小。凝胶色谱法的分离机制是根据分子的体积大小和形状不同而达到分离目的。

①凝胶色谱法的作用机制

体积大于凝胶孔隙的分子，由于不能进入孔隙而被排阻，直接从表面流过，先流出色谱柱；小分子可以渗入大大小小的凝胶孔隙中而完全不受排阻，然后又从孔隙中出来随载液流动，后流出色谱柱；中等体积的分子可以渗入较大的孔隙中，但受到较小孔隙的排阻，介乎上述两种情况之间。

凝胶色谱法是一种按分子尺寸大小的顺序进行分离的一种色谱分析方法。

②凝胶色谱法的固定相

软质凝胶、半硬质凝胶和硬质凝胶三种。

③凝胶色谱法的应用特点

保留时间是分子尺寸的函数，适宜于分离相对分子质量大的化合物，相对分子质量在400～8×105的任何类型的化合物。

保留时间短，色谱峰窄，容易检测。

固定相与溶质分子间的作用力极弱，趁于零，柱的寿命长。

不能分辨分子大小相近的化合物，分子量相差需在10%以上时才能得到分离。

分离度（resolution，又称为解析度、分辨率）是色谱图中相邻两峰分离程度的量度。两峰间的分离程度受两峰尖的距离和两峰各自峰宽的制约。若保持峰宽不变，加大峰间的距离则分离程度加大，即分离度与两峰的保留时间之差成正比；若保持两峰间距离不变，使峰的宽度减小，两峰分离程度亦将增大，即分离程度与峰宽成反比。分离度，就我所做的色谱方面讲，分离度resolution——R等于相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。简单说，就我所用的HPLC在工作时，得到的图谱有很多峰，看每个峰离的远不远，基线会不会连在一起，是否互相干扰的。又称分辨率,为了判断分离物质对色谱柱在色谱柱中的分离情况,常用分离度作为柱的总分离效能指标.用R表示.R等于相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比. 相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R越大，表明相邻两组分分离越好。一般说当R＜1时，两峰有部分重叠；当R=1.0时，分离度可达98%；当R=1.5时，分离度可达99.7%。通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。当R＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。R＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7%。R≥1.5称为完全分离。《中国药典》规定R应大于1.5。 分离度计算公式：R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)

堵住柱子的，应该是你要检验的物质。想要把它冲出来应该继续用你的流动相。可是你的流动相是正相的，对反相柱子伤害太大了。冲出来基本上也把柱子毁了。

愿意冲的话，你就把柱子反接，用异丙醇低流速冲冲看吧。我不知道你的样品在异丙醇中溶解怎么样，不过异丙醇粘性很大，说不定可以把柱子里面的物质带出来。

我们加入乙酸乙酯后，需要搅拌一分钟，搅拌一分钟是为了让反应物混合均匀。防止发生上下分层的现象。

乙酸乙酯，又称醋酸乙酯，能发生醇解，氨解，酯交换，还原等一般酯的共同反应。低毒性，有甜味，浓度较高时有刺激性气味，易挥发，具有优异的溶解性，快干性，用途广泛，是一种重要的有机化工原料和工业溶剂。属于一级易燃品，应贮于低温通风处，远离火种火源。实验室一般通过乙酸和乙醇的酯化反应来制取。