有谁知道如何从土壤中提取脲酶

土壤微生物、土壤理化性质、土壤养分等。

根据相关资料查询，土壤脲酶活性实验中存在的误差因素有很多，如土壤生物区系、理化性质、农业植被以及一些人为因素等，其主要影响因素有土壤微生物、土壤理化性质、土壤养分、施肥等农业管理措施等。

土壤脲酶活性实验指《土壤脲酶活性的测定苯酚钠-次氯酸钠比色法》是2020年07月15日实施的一项行业标准。

苯酚-次氯酸钠比色法测定的是水体中的氨含量，脲酶测定时将尿素转化为铵盐，测定脲酶添加前后，比色铵盐差值进行活性计算的，如果过滤液混浊，定性滤纸没有作用，只能说明水体中存在有机质或者其他胶体颗粒物质。在处理样品中当低温静置没有效果时，先将该样品在所需光强波长下进行对比，如果发现不论加不加反应显色剂，空白值均小于所需测定值的5%,即可以用于测量过程，不影响测量结果，如果空白较大，则可以通过更小孔径(2.5μm或者1.2μm、0.75μm)的膜进行负压抽滤，取滤液进行测定。

由于该方法是要氨在碱性条件下与苯酚和次氯酸钠反应，可以事先用氢氧化钠进行pH调节后(注意添加量，记录进行体积校正)，如果还没有效果，可选择负压抽滤。

随着膨化技术在饲料工业中推广普及，越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉，与其它蛋白资源一样，大豆的适度熟化非常重要，熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子，熟化度过高又会导致氨基酸利用率低。判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性。脲酶活性是指:在30±5℃和ph值等于7的条件下，每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。脲酶本身无营养意义，但它与抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标。脲酶活性没有负值，最低为0。在我国现行的国标推荐值为0.3，在美国一般认为以不超过0.2为宜，并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12，当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受。国内很多大企业一般均采用0.2。

实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂，有滴定法和ph增值法两种，已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等。目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性，一般来说，主要有如下两种方法。

一.液态法

1.原理:大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。

2.试剂

2.1尿素:gb696，分析纯。

2.2酚红指示剂

2.2.1称取0.1g酚红，加1.43ml0.1mol/l氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解

2.2.2转移至250ml定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。

3.操作方法

3.1取0.2g粉末样品，置于25ml比色管中。

3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20ml，充分摇匀15s。

3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。

颜色出现时间 脲酶活性

1min 极强

1~5min 强

5~15min 稍有

15min 无

同时作空白对照试验。

样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品)，只有上述空白正常时，即酚红指示剂不改变颜色，试验结果才是可靠的。

一般企业认为7、8分钟变色较为合适。

二、半固态法

1.原理:大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。

2.试剂

2.1稀硫酸(h2so4)0.2n。

2.2尿素一酚红试剂

2.2.1将1.2克酚红溶解于30ml0.2n的naoh中

2.2.2用蒸馏水将之稀释至约300ml

2.2.3加入90g尿素(分析纯)并溶解之

2.2.4用蒸馏水稀释至2l

2.2.5加入14ml 1.0n的h2so4或70ml o.2n的h2so4

2.2.6用蒸馏水稀释至最后体积3l

2.2.7溶液应具明亮的琥珀色。

3.操作方法

3.1在一个150ml的烧杯中倒入少量试剂，注意溶液必须呈明亮的琥珀色。若溶液已转变为深桔红色，滴人稀硫酸溶液并搅拌之，直至溶液再度呈琥珀色。

3.2量一匙粉末样品，放置于培养皿中。

3.在样品上加入两匙试剂，轻轻搅拌，将样品平铺于培养皿中。若仍有干样品斑点，则再加入试剂，直至将样品浸湿。

4.放置5分钟后观察:

a. 没有任何红点出现:再任其放置25分钟，若仍无红点出现，说明大豆粉过熟。

b. 有少量红点:少量尿素酶活性，可用。

c. 样品表面约有25%为红点覆盖:少量尿素酶活性，可用。

d. 豆饼表面约有50%为红点覆盖:尿素酶活性较高，不可以使用。

e. 豆饼表面的75%-100%为红点覆盖:尿素酶活性很高，样品过生，不能使用。

以上两种简易脲酶活性估测方法在国内各饲料厂被广泛采用，尤其是后者在膨化大豆粉生产的在线检测上很普遍。尽管这两种方法原理一样，但是，因其操作过程差异，所以对膨化大豆粉品质的反映内容也不尽相同。

三、液态法和半固态法之比较

首先需要说明的是，这两种脲酶活性快速检测方法没有行业约定俗成的名称，笔者接触过的企业均只采用其中的一种方法，对前者可以称之为“试管法”，后者称之为“表面皿法”，根据其实施的过程及样品的状态，笔者将其区分为“液态法”和“半固态法”。

从实施方法来看，液态法是过程检测，从开始一直到规定时间段结束，而半固态法属于断点检测，是5分钟后看结果液态法通过控制各个体合格，总体自然合格，而半固态法要求的是总体符合统计学上的合格，即允许部分个体不合格。简单地说，液态法要求每一个微粒的熟化程度均要满足5分钟以内不变色，如果一个不合格，整个批次为不合格而半固态法允许部分微粒在5分钟内变色，部分不合格，总体可以是合格的。从这点上来说，液态法对膨化大豆粉的品质要求更高，控制更严格，不仅要求熟化，而且要均匀熟化。举例说明，如果在熟化完全的大豆粉样品中掺入微量(可以是一粒)生大豆粉，液态法会立即变色从而判定为不合格，而半固态法只是增加了一个变色点，总体上仍是合格的。

从上可以看出，这两种检测方法对膨化大豆粉品质的反映内容是不一样的。半固态法反映的是产品符合统计学上的合格，而液态法反映的是完全合格。这两种不同检测方法对膨化设备的要求也是有差别的，液态法要求设备能均匀熟化，而半固态法允许产品出现部分不合格，只要总体上符合就可以，对膨化设备的要求自然要低。

可能会有人疑问，膨化大豆粉出来的不都应该是均匀一致的吗?其实不然，物料在膨化机内受到湿、热、机械剪切的共同作用从而熟化，机械剪切对膨化大豆粉所起的作用大约能占三成多，如果结构设计上缺陷或部件磨损，就会导致熟化不均匀。目前湿法膨化大豆粉的出料温度大都在135度左右(对家禽和猪要求可能低点)，六年前，笔者曾遇到过膨化大豆粉出料温度在170度，用液态法检测仍不合格，出来的料有熟的，有褐变的，还有少许夹生的，如果用半固态法检测，估计就合格了。次年，一膨化厂使用某企业膨化机生产膨化大豆粉，因不熟被退货六十吨，根据大部分企业采用半固态法检测的情况，将其以一定比例掺入熟化料中，最终符合统计学上的合格。上述事件，大概就是这两种不同测定方法的实践意义吧。

脲酶urease(水解酶):

脲酶试验原理:

存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解。脲酶的作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法是测定生成的氨量。

试剂:1)甲苯

2)10%尿素:称取10g尿素，用水溶至100ml。

3)柠檬酸盐缓冲液(ph6.7):184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/lnaoh将ph调至6.7，用水稀释至1000毫升。

4)苯酚钠溶液(1.35mol/l):62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升(a)，存于冰箱中27克naoh溶于100毫升水(b)。将ab溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。

5)次氯酸钠溶液:用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

6)氮的标准溶液:a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液

标准曲线绘制:吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。

取新鲜土壤7份，每份30g，装于棕色广口瓶中，先将1，3-二氯丙烯溶于丙酮(定量)，6份分别加入不同浓度均为1.5ml的1，3-二氯丙烯，使之在土壤中的浓度分别为1、10、50、100、200、500

（1）碳酸氢铵（NH4HCO3）

简称碳铵。含氮量在17%左右，为无色细粒晶体，易溶于水。碳铵的化学性质不稳定，易分解并引起氨的挥发损失。含水量低于0.5%的碳铵在常温下虽然不易分解，但在高温下会引起热分解，并随着吸热反应的进行，加速分解速率。吸湿水解是引起碳铵分解的又一个重要原因，在分解过程中产生的水分子会加速潮解。所以在贮运过程中易引起结块。碳铵要深施并覆土，这样可确保氨挥发明显减少，并在酸性、中性或石灰性土壤上保持与硫酸铵相同的肥效。由于碳铵在土壤溶液中解离可生成碳酸氢根，进一步析出二氧化碳为黄瓜生长提供碳源，所以不但能有效提供碳源，而且由于不在土壤中残留酸根，对栽培土壤亦无不良影响。（2）硫酸铵［（NH4）2SO4］简称硫铵。含氮量为20%左右，纯品为白色结晶，含有少量杂质时呈微黄色。硫铵易溶于水，在常温下每1000克水可溶解750克硫铵，水溶液呈酸性反应，吸湿性小，物理性状良好，化学性质稳定，常温下存放不挥发、不分解。但遇到碱性物质会引起氨的挥发损失。

硫铵在土壤溶液中可解离为铵离子和硫酸根离子，由于黄瓜根系吸收的阴阳离子不平衡，所吸收的铵离子的数量明显多于硫酸根离子，故容易引起栽培土壤的酸化。所以也叫生理酸性肥料。一般在酸性土壤上施用时，应适量配合施用石灰，以中和土壤酸性，并可补充土壤中钙离子的流失，不过硫铵和石灰不能同时施入土壤，要分开进行。在石灰性土壤上施用硫铵，虽然不会加重土壤的酸化，但此种土壤含有大量碳酸钙，呈碱性反应，硫铵在碱性条件下分解产生氨，所以必须深施覆土，才可避免氮素的挥发损失。在中性土壤上长期施用硫铵，会引起土壤酸化，所以也必须通过定期监测土壤酸碱度，确定在适当的时期补充一些石灰予以中和。

在黄瓜栽培中，硫铵既可作基肥、追肥，也可作种肥施用。而且由于其物理性状好，很适合作种肥。不过作种肥时，黄瓜种子与硫铵均应是干燥的，并须混合均匀。（3）硝酸铵（NH4NO3）

简称硝铵。含氮35%左右，其中铵态氮和硝态氮各占一半，纯品为白色结晶，含有杂质时呈淡黄色，比重1.73，熔点为170℃。易溶于水，在常温下每1000克水可溶解188克，水溶液呈酸性。

硝铵吸湿性强，容易结块。当气温高、空气湿度大时，存放过久会造成硝铵吸湿液化，给施用带来困难。硝铵对热的稳定性差，容易发生热分解，放出氨气或氧气，在有限的空间内，由于体积骤增，可发生爆炸。所以在贮运过程中不能与易燃物混存，并要严防接触铜、铝、镁、锌等金属物质，杜绝安全隐患。虽然硝铵是无副成分的氮素化肥，在土壤溶液中解离为铵离子和硝酸根离子，均能被黄瓜作物吸收，但实际施用时必须注意硝酸根离子容易随水流失的特性。而且因为硝铵含有铵离子，所以不能在石灰性土壤上作表土撒施，要深施覆土。硝铵不宜在莲藕等水生黄瓜中施用，避免硝态氮素过度流失。在黄瓜栽培中，硝铵只适宜作追肥，不可作基肥和种肥。硝铵覆土的深度要在10厘米以上。（4）尿素［CO（NH2）2］尿素是酰胺态氮肥，其氮素以酰胺形态存在。尿素含氮量为45%左右，是固体氮素化肥中含氮量最高的肥料。尿素为白色颗粒状晶体，易溶于水，水溶液呈中性，吸湿性小，在干燥条件下物理性状良好，常温下基本不分解，但遇到高温、潮湿环境，也会有一定的吸湿性，所以在贮运过程中要注意防潮。

尿素在造粒过程中，温度超过50℃便会有缩二脲生成，当温度超过135℃时，尿素会分解生成缩二脲。尿素中的缩二脲含量超过2%就会明显抑制黄瓜种子发芽，危害植株生长。所以，在选购尿素时，应确定其中的缩二脲含量不超过1.5%；如果用作根外追肥，则缩二脲的含量不能超过0.5%，否则会对茎叶造成伤害。

施入土壤中的尿素，在其未转化前，可以分子态被土壤胶体吸附。土壤对尿素分子的吸附，在一定程度上可避免尿素在栽培土壤中淋失。尿素施入土壤后，除了少量以分子态被土壤胶体吸附，大部分在土壤脲酶的作用下，水解为碳酸铵，并进而释放出氨。所以，表层施尿素也会引发部分氨挥发损失。

在黄瓜栽培中，尿素适宜在各种土壤中作基肥和追肥施用，但不可作种肥，以防尿素中的缩二脲烧坏种子。但都应适当深施或施用后立即灌水，通过控制水量使尿素渗入土层中，由于深层土壤脲酶的活性较低，从而减缓了尿素的水解。尿素作根外追肥效果很好，因其分子体积小，易透过细胞膜，呈中性、电离度小，不易引起细胞质壁分离，又有一定的吸湿性，能保持叶面湿润，利于叶片吸收。尿素进入叶片细胞后很快参与同化作用，肥效很快。大多数黄瓜作物以0.5%～1%的浓度喷施为宜。喷施在早晚进行为宜。

土壤碱性磷酸酶活性测定试剂盒使用说明货号:BC0280规格:50T/48S产品简介：土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷化合物矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH显著影响。通常按照其最适pH范围，分为碱性、中性和酸性三种类型磷酸酶。碱性环境中，S-AKP/ALP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即可计算出S-AKP/ALP活性。脲酶urease（水解酶）：nbsp脲酶试验原理：nbsp存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解。脲酶的作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。nbsp土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。

尿素是一种高浓度氮肥，是一种中性速效肥料，也可用于生产多种复合肥。尿素是一种有机氮肥，通过土壤中脲酶的作用，水解成碳酸铵或碳酸氢铵，可供作物使用。因此，应在施肥期前4~8天施用尿素。土壤中无有害物质残留，长期施用无不良影响。尿素在转化前是分子，不能被土壤吸附，因此应防止其随水流失。转化后形成的氨也具有挥发性，因此尿素也应施用于深层土壤。

尿素是氮素含量最高的固体氮肥，其肥效高，使用方便，可作为基肥，也可作为追肥。由于尿素在土壤中的转化可以积累大量的铵离子，会导致PH值升高2-3个单位，再加上尿素本身含有一定量的二脲，其浓度在500ppm时，会对作物的幼根和幼芽起到抑制作用，因此不宜施肥。然而，尿素使用过程中的浪费现象相当严重。最优质氮肥的尿素利用率一般只有50%。有没有办法提高尿素的利用率？

土壤pH值会影响土壤中尿素的转化。中性土壤中尿素的转化率明显高于酸性或碱性土壤，因为中性土壤更适合微生物活动。脲酶提高了尿素转化率，肥沃的土壤脲酶含量高，因此肥沃的土地加速了尿素转化。土壤温度也会影响尿素的转化率。当土壤温度约为10度时，尿素需要7-10天才能完成转化。当温度高于20摄氏度时，只需四到五天。当温度高于30摄氏度时，转换时间仅为两天。

根据实验研究，当土壤湿度较大时，脲酶水解作用很强，在25-30度时，当土壤水分为70%时，尿素可以在一天内转化，28%的尿素转化铵态氮被作物吸收。相反，土壤水分不足，尿素转化将非常缓慢。无论是用作底肥还是追肥，尿素在转化前都是分子的，不能被土壤吸附，应防止水分流失，应深施土壤，施肥深度宜在10-12厘米左右，这样可以显著提高肥料的利用率。据研究，尿素浅施2-3厘米，利用率仅为30%；施肥深度为5cm，利用率约为45%。如果涂抹深度为10-20 cm。这是65%的利用率。