测定土壤脲酶活性的方法包括哪些

土壤微生物、土壤理化性质、土壤养分等。

根据相关资料查询，土壤脲酶活性实验中存在的误差因素有很多，如土壤生物区系、理化性质、农业植被以及一些人为因素等，其主要影响因素有土壤微生物、土壤理化性质、土壤养分、施肥等农业管理措施等。

土壤脲酶活性实验指《土壤脲酶活性的测定苯酚钠-次氯酸钠比色法》是2020年07月15日实施的一项行业标准。

随着膨化技术在饲料工业中推广普及，越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉，与其它蛋白资源一样，大豆的适度熟化非常重要，熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子，熟化度过高又会导致氨基酸利用率低。判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性。脲酶活性是指:在30±5℃和ph值等于7的条件下，每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。脲酶本身无营养意义，但它与抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标。脲酶活性没有负值，最低为0。在我国现行的国标推荐值为0.3，在美国一般认为以不超过0.2为宜，并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12，当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受。国内很多大企业一般均采用0.2。

实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂，有滴定法和ph增值法两种，已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等。目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性，一般来说，主要有如下两种方法。

一.液态法

1.原理:大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。

2.试剂

2.1尿素:gb696，分析纯。

2.2酚红指示剂

2.2.1称取0.1g酚红，加1.43ml0.1mol/l氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解

2.2.2转移至250ml定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。

3.操作方法

3.1取0.2g粉末样品，置于25ml比色管中。

3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20ml，充分摇匀15s。

3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。

颜色出现时间 脲酶活性

1min 极强

1~5min 强

5~15min 稍有

15min 无

同时作空白对照试验。

样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品)，只有上述空白正常时，即酚红指示剂不改变颜色，试验结果才是可靠的。

一般企业认为7、8分钟变色较为合适。

二、半固态法

1.原理:大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。

2.试剂

2.1稀硫酸(h2so4)0.2n。

2.2尿素一酚红试剂

2.2.1将1.2克酚红溶解于30ml0.2n的naoh中

2.2.2用蒸馏水将之稀释至约300ml

2.2.3加入90g尿素(分析纯)并溶解之

2.2.4用蒸馏水稀释至2l

2.2.5加入14ml 1.0n的h2so4或70ml o.2n的h2so4

2.2.6用蒸馏水稀释至最后体积3l

2.2.7溶液应具明亮的琥珀色。

3.操作方法

3.1在一个150ml的烧杯中倒入少量试剂，注意溶液必须呈明亮的琥珀色。若溶液已转变为深桔红色，滴人稀硫酸溶液并搅拌之，直至溶液再度呈琥珀色。

3.2量一匙粉末样品，放置于培养皿中。

3.在样品上加入两匙试剂，轻轻搅拌，将样品平铺于培养皿中。若仍有干样品斑点，则再加入试剂，直至将样品浸湿。

4.放置5分钟后观察:

a. 没有任何红点出现:再任其放置25分钟，若仍无红点出现，说明大豆粉过熟。

b. 有少量红点:少量尿素酶活性，可用。

c. 样品表面约有25%为红点覆盖:少量尿素酶活性，可用。

d. 豆饼表面约有50%为红点覆盖:尿素酶活性较高，不可以使用。

e. 豆饼表面的75%-100%为红点覆盖:尿素酶活性很高，样品过生，不能使用。

以上两种简易脲酶活性估测方法在国内各饲料厂被广泛采用，尤其是后者在膨化大豆粉生产的在线检测上很普遍。尽管这两种方法原理一样，但是，因其操作过程差异，所以对膨化大豆粉品质的反映内容也不尽相同。

三、液态法和半固态法之比较

首先需要说明的是，这两种脲酶活性快速检测方法没有行业约定俗成的名称，笔者接触过的企业均只采用其中的一种方法，对前者可以称之为“试管法”，后者称之为“表面皿法”，根据其实施的过程及样品的状态，笔者将其区分为“液态法”和“半固态法”。

从实施方法来看，液态法是过程检测，从开始一直到规定时间段结束，而半固态法属于断点检测，是5分钟后看结果液态法通过控制各个体合格，总体自然合格，而半固态法要求的是总体符合统计学上的合格，即允许部分个体不合格。简单地说，液态法要求每一个微粒的熟化程度均要满足5分钟以内不变色，如果一个不合格，整个批次为不合格而半固态法允许部分微粒在5分钟内变色，部分不合格，总体可以是合格的。从这点上来说，液态法对膨化大豆粉的品质要求更高，控制更严格，不仅要求熟化，而且要均匀熟化。举例说明，如果在熟化完全的大豆粉样品中掺入微量(可以是一粒)生大豆粉，液态法会立即变色从而判定为不合格，而半固态法只是增加了一个变色点，总体上仍是合格的。

从上可以看出，这两种检测方法对膨化大豆粉品质的反映内容是不一样的。半固态法反映的是产品符合统计学上的合格，而液态法反映的是完全合格。这两种不同检测方法对膨化设备的要求也是有差别的，液态法要求设备能均匀熟化，而半固态法允许产品出现部分不合格，只要总体上符合就可以，对膨化设备的要求自然要低。

可能会有人疑问，膨化大豆粉出来的不都应该是均匀一致的吗?其实不然，物料在膨化机内受到湿、热、机械剪切的共同作用从而熟化，机械剪切对膨化大豆粉所起的作用大约能占三成多，如果结构设计上缺陷或部件磨损，就会导致熟化不均匀。目前湿法膨化大豆粉的出料温度大都在135度左右(对家禽和猪要求可能低点)，六年前，笔者曾遇到过膨化大豆粉出料温度在170度，用液态法检测仍不合格，出来的料有熟的，有褐变的，还有少许夹生的，如果用半固态法检测，估计就合格了。次年，一膨化厂使用某企业膨化机生产膨化大豆粉，因不熟被退货六十吨，根据大部分企业采用半固态法检测的情况，将其以一定比例掺入熟化料中，最终符合统计学上的合格。上述事件，大概就是这两种不同测定方法的实践意义吧。

脲酶urease(水解酶):

脲酶试验原理:

存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解。脲酶的作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法是测定生成的氨量。

试剂:1)甲苯

2)10%尿素:称取10g尿素，用水溶至100ml。

3)柠檬酸盐缓冲液(ph6.7):184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/lnaoh将ph调至6.7，用水稀释至1000毫升。

4)苯酚钠溶液(1.35mol/l):62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升(a)，存于冰箱中27克naoh溶于100毫升水(b)。将ab溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。

5)次氯酸钠溶液:用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

6)氮的标准溶液:a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液

标准曲线绘制:吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。

取新鲜土壤7份，每份30g，装于棕色广口瓶中，先将1，3-二氯丙烯溶于丙酮(定量)，6份分别加入不同浓度均为1.5ml的1，3-二氯丙烯，使之在土壤中的浓度分别为1、10、50、100、200、500

熟豆粕为黄褐色或黄色，有香味；生豆粕的颜色为淡黄色或灰白色，没有香味或有豆腥味。

豆粕是大豆提取豆油后得到的一种副产品。又称“大豆粕”。按照提取的方法不同，可以分为一浸豆粕和二浸豆粕。其中以浸提法提取豆油后的副产品为一浸豆粕，而先以压榨取油，再经过浸提取油后所得的副产品称为二浸豆粕。

优点

1、易吸收利用：豆粕经益生菌发酵水解，产生大量具有独特生理活性功能的活性肽。分子量低于5000的小肽混合物为产品的主要成分，易消化、吸收快、抗原性低，有效刺激肠道内有益菌的增殖，调节体内微生态菌群的结构，增加整个消化道对饲料营养物质的分解、合成、吸收和利用。

2、防病：发酵豆粕中大量的高效益生菌在动物体内可抑制大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的生长繁殖，保持肠道内微生态环境处于平衡、稳定状态，避免肠道疾病发生。

3、提高饲料利用率：发酵豆粕富含多种微生物酶类如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等，可补充机体内源酶不足，加强了营养物质的消化，提高动物对饲料蛋白质和能量的利用率。

  教保料产品能否在区域内迅速获得养殖企业良好的口碑并稳步上量，关键在于产品是否做到极致和产品做到极致后品质是否保持稳定。那么如何打造极致和稳定的教保料产品呢？制造一个好的产品，除了要有科学的配方和独特的工艺技改和创新技术，最重要的就要掌握教保料原料的筛选与品评技术，原料的筛选与品评技术不过关，使用不达标或品质不过关的原料生产，那么产品最终在猪场只能获得一般或者比较差的终端验证效果，这就是所谓的品质管理逻辑：“成品的品质绝对不会大于原料的品质，决定成品品质的关键因素在于原料的筛选与品评”那么如何筛选与品评教保料原料呢？

  打造优质教保料，我们要严格遵循以下三条教保料原料筛选与品评的核心品管理念：第一、原料新鲜是王道，品尝原料最可靠；第二、原料清洁最重要，精选过筛要做到；第三、品评指标建体系，验收检测要记牢。

  第一、原料新鲜是王道，品尝原料最可靠。为什么我们首要突出了“新鲜”和“品尝”这两个词语呢？因为如果真正想把教保料品质做到极致离开新鲜原料将是天方夜谭，这个新鲜不是指原料的蛋白、脂肪、小肽和氨基酸含量有多高，而是指原料的口感、气味、色泽、质地是否达标。现在有不少饲料企业为了快速检测原料指标购置了近红外扫描等先进的快检设备，这些设备确实对饲料营养指标的快速分析带来很大的便利，但是在教保料指标的筛选与品评过程中却不能过度的依赖这些快检分析设备，因为有些原料虽然看起来营养指标正常但是实际上并不是好原料，例如鱼粉和蛋氨酸，营养指标和正常鱼粉、蛋氨酸做的非常类似，从指标分析上根本看不出任何瑕疵，但是从感官分析中却能够发现问题。

  第二、新鲜的原料才是最好，好原料必须新鲜。教保料做的好不好最终还是由猪来验证，也就是说我们饲料企业的研发、采购、技术、品控、仓储、生产、物流、销售都必须以猪为本，根据猪的生理生化特点来研发、采购、品评、仓储、生产和运输教保料。那么猪的特点是什么呢？我们来看猪的嗅觉：猪对任何气味都能嗅到和辨别清楚。这是因为猪鼻发达，嗅区广阔，嗅粘膜的绒毛面积大，分布的嗅神经密集。猪宝宝在出生后几小时就能鉴别气味并以此来寻找乳头，三天内就能固定乳头哺乳，绝不会错乱。猪能依靠嗅觉寻找埋藏在地下很深的食物，能准确地找出地下一切异物。据测定：猪大脑中负责嗅觉的部分同负责听觉和视觉的两个部分加在一起同等大小，所以猪的嗅觉发达程度高于狗数倍，比人高7-8倍。因此我们使用的原料是否新鲜这种味道猪很轻松就能闻到，比如膨化大豆，出厂后3天内使用要优于出厂后7天内使用，出厂后7天使用要优于出厂后15天使用，未来我们这个行业的饲料企业谁能抓住这种优势进行精益高效的生产谁的产品就占据优势。

  第三、品评原料必须品尝，品尝是验证原料最好的杀手锏。在原料的筛选与品评过程中，水分、品种、色泽、气味、口感、脲酶活性、流散性、水溶性、碱溶性、容重、陈化度、PH值等都是都是非常重要的品评指标，但是为什么我们非常强调口感呢？因为口感才是验证原料品质好坏的最有效手段之一，人的味蕾感受不好不喜欢吃的原料猪怎么喜欢吃？与人相比猪的味蕾数更多，例如杯状味蕾猪 >10000个而人类只有6000个，叶状味蕾猪4800个而人类3000个，猪菌状味蕾5000个而人类1600个。可见，猪的味觉比人要敏感得多。作为饲料企业的技术、研发、采购和品控人员，掌握不同原料的口感，并通过口感鉴别原料品质的技能是十分重要的，一个原料好不不好最直接的手段就是品尝并写下感受建立档案，不同批次原料口感的不同一定代表这个原料品质有变化。例如鱼粉到底是新鲜的鱼片味道还是含而不化酸辣苦涩味？低蛋白的乳清粉到底是淡淡的奶香味略有咸味还是没有一点奶香味只有蔗糖的甜味？通过不断的品尝不断的总结感悟福宏饲料的原料筛选与品评手段会越来越高，同时通过不断的总结创新福宏饲料的教保料品质会逐渐达到炉火纯青并走向极致。2018.08.14日

各种酶有各自最佳的酶活性温度和pH等，不能一概而论。一般而言的话，土壤酶的活性大概都保持在4℃左右，所以建议在4℃左右的环境下进行测定。

研究土壤酶活性，一般都测定酶的种类有：

1、土壤脲酶活性；常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况

2、土壤磷酸酶活性测定；

3、土壤蔗糖酶活性测定：一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高.

4、土壤纤维素酶活性测定；

5、土壤纤维素酶活性测定；

每种酶的测定方法都不同，所以可根据不同酶的测定方法具体进行研究。

作用如下

乙醇可显著增强土壤脲酶活性,二者关系达到显著正相关随乙醇作用时间延长,土壤脲酶活性增加的幅度减小随土壤肥力升高,乙醇影响脲酶的定浓抑制率绝对值减小,而脲酶的变浓变化率则差别不大,达到最大表观脲酶活性所需的最适时间缩短。该结果揭示出土壤肥力对外源物质与土壤脲酶活性的关系有重要影响。