ELISA的影响因素有哪些

二巯基丙醇的作用是断裂多肽链之间的二硫键（共价键），故5000的蛋白质由2条多肽链通过二硫键结合而成。盐酸胍的作用断裂蛋白质之间的氢键，而不会破坏蛋白质之间的共价键，改变蛋白质的空间结构。使蛋白质由多聚体变成单聚体。所以该蛋白质的可能结构是：由2条不同的多肽链通过二硫键结合形成分子量为5000的单聚体蛋白，在通过6个这样的单聚体蛋白通过蛋白质之间的氢键，范德华作用力等次级键相互折叠缠绕成分子量为30000的蛋白质。

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常用蛋白标签对比

10 个月前 · 来自专栏 分子生物学

Ivy

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蛋白标签（protein tag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。

常用的蛋白标签有6xHIS、Flag、GST、Myc、eGFP/eCFP/eYFP/mCherryeGFP、HA、SUMO等。

His6：

His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。

使用His-tag有下面优点：

1.标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能；

2.His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性；

3.His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究；

4.His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体；

5.可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；

6.可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。

Flag:

Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：

1.FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。

2.融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。

3.FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

4.融合在N端的FLAG，其可以被肠激酶切除（DDDK），从而得到特异的目的蛋白。因此现FLAG标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。

MBP:

MBP（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签。如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。

纯化：融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。结合亲和力在微摩尔范围。一些融合蛋白在0.2% Triton X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效结合，而其他融合蛋白则不受影响。 缓冲条件为pH7.0到8.5，盐浓度可高达1M，但不能使用变性剂。如果要去除MBP融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。

检测：可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。

GST:

GST(谷胱甘肽巯基转移酶) 标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD。将它应用在原核表达的原因大致有两个，一个是因为它是一个高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用。GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结合的融合蛋白在非变性条件下用10mM 还原型谷胱甘肽洗脱。在大多数情况下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二体。GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。在大多数情况下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。

纯化：该表达系统表达的GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathionesepharose)亲和树脂进行纯化。GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力，因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如：盐酸胍或尿素等。

如果要去除GST融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。

检测：可用GST抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。

HA

HA标签蛋白，标签序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，9个氨基酸，对外源靶蛋白的空间结构影响小, 容易构建成标签蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti－HA抗体检测和ELISA检测。

用HA peptide可实现带HA tag的蛋白洗脱，0.15M Arginine-HCl缓冲液, pH3.0可实现蛋白纯化beads 的重生。

Myc

Myc标签蛋白，是一个含11个氨基酸的小标签，标签序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，这11个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。Myc tag已成功应用在 Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中, 可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。

eGFP/eCFP/eYFP/mCherry

分别是增强型绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/单体红色荧光蛋白,具有不同的激发波长发射波长为，均由野生型荧光蛋白通过氨基酸突变和密码子优化而来。就eGFP而言，相对于GFP，其荧光强度更强、荧光性质更稳定。同时载体中构建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。mCherry是从DsRed演化来的性能最好的一个单体红色荧光蛋白，可以和GFP系列荧光蛋白共用，实现多色标记体内、外实验表明，mCherry在N端和C端融合外源蛋白时，荧光蛋白活性和被融合的目标蛋白功能相互没有明显影响。

这些荧光标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：

1.不用破碎组织细胞和不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针。

2.其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。

3.同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测更显得快速、简便、灵敏度高而且重现性。

4.其低消耗、高灵敏度检测，十分适用于高通量的药物筛选。因此现eGFP 表达标签被广泛地应用于基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。

5.mCherry红色荧光蛋白在标记病毒颗粒，研究病毒和宿主细胞之间更有得天独厚的优势。如用mRFP或mCherry标记HIV病毒颗粒，研究H1V和宿主细胞问的相互作用以及HIV侵染宿主细胞的过程．用mRFP标记慢病毒颗粒，研究慢病毒在小鼠体内的复制过程等。

Strep-II Tag

Strep-tag技术开发的原理是众所周知的生物素（biotin）和抗生物素蛋白链菌素（streptavidin）之间的结合反应。为了将这种牢固的相互作用用于蛋白质纯化用途，研究者们发现需要一个肽，该肽与重组蛋白质融合后，能够结合在streptavidin的生物素结合口袋，从而作为纯化tag。

由8个氨基酸(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)构成的短序列并称之为Strep-tag II。因为它的分子量很小，只有1.06kDa，所以不会遮盖融合蛋白中其他的蛋白表位和结构域，更不容易改变融合蛋白的功能、分泌或是运输。

Avi Tag

AviTag标签蛋白是一个15 个氨基酸的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和C端。融合表达后，可被生物素连接酶生物素化，为了纯化重组蛋白选用低亲和性的单体抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白质分离纯化，还用于蛋白质相互作用研究。

Avi Tag标签系统具有以下几大优点:

1.无论在体外或者体内，几乎所有的蛋白都可以在一个独特的Avi Tag位点轻易且有效地被生物素化；

2.生物素化是通过酶和底物的反应来实现，反应条件相当温和而且标记的专一性极高；

3.生物素AviTag只有15个氨基酸，对蛋白空间结构的影响非常小。

SNAP-Tag

SNAP-Tag是新一代的蛋白标签技术，不仅专一性极高而且稳定，最大的优点是适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化，如活细胞内、溶液中、或固态相(如SDS-PAGE gels)等。

SNAP-Tag是从人的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移（O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase）获得。无论体内还是体外，SNAP-Tag都能与底物高特异性地共价结合，使蛋白标记上生物素或荧光基团（如荧光素和若丹明）。SNAP所带的活性巯基位点接受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基基团，释放出了鸟嘌呤。这种新的硫醚键共价结合使SNAP所带的目的蛋白携带上了苯甲基基团所带的标记物。苯甲基鸟嘌呤在生化条件下稳定，并且没有其他蛋白会和这类物质作用，所以SNAP标签反应是高特异的。

检测：生物素或各种颜色荧光的底物（如荧光素、若丹明）可渗透进入细胞，方便快捷地进行活细胞内SNAP-Tag融合蛋白的标记与检测。它们也可特异性地标记大肠杆菌，酵母和哺乳动物等细胞抽提液或已经纯化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。

将纯化的或未纯化的SNAP-Tag融合蛋白与表面固定了苯甲基鸟嘌呤的基质混合，蛋白即可特异与底物作用，形成共价键，融合蛋白间接被固定在了基质表面上，可以达到更方便快捷地研究蛋白功能或纯化蛋白的目的。

Halo Tag

HaloTag标签蛋白是一种脱卤素酶的遗传修饰衍生物，可与多种合成的HaloTag配基有效地共价结合。这个分子量为33KDa的单体蛋白能融合在重组蛋白的N端或C 端，并在原核和真核系统中表达。

HaloTag配基是小分子化学物，能够在体外或体内与HaloTag蛋白共价结合（区别于一般tag的非共价结合，其强结合facilitate强的洗脱作用→以去除非特异信号）。这些配基由两个关键组分组成：(1)一个通用的HaloTag反应联结子，结合HaloTag蛋白；(2)一个功能基团,例如荧光染料或亲和媒介。

能够共价和特异性结合多种合成的报告基团和亲和配基的特性，使得HaloTag蛋白能够用于检测和亲和结合或固相化固定目的蛋白。

SUMO

SUMO标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白（Small ubiquitin-likemodifier），是泛素(ubiquitin)类多肽链超家族的重要成员之一。在一级结构上，SUMO与泛素只有18%的同源性，然而两者的三级结构及其生物学功能却十分相似。研究发现SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。

此外SUMO还有一项重要的应用，就是可用于完整地切除标签蛋白，得到天然蛋白。因为SUMO蛋白水解酶（我公司可提供）能识别完整的SUMO标签蛋白序列，并能高效地把SUMO从融合蛋白上切割下来。切除SUMO后，经过亲和层析，去除标签蛋白部分，就得到和天然蛋白一样的重组蛋白。所以SUMO标签也常用于和其他标签一起应用，作为特异酶切水解位点。

蛋白标签都需要去除吗？

一般为了不影响目的蛋白的后续应用，都会选择一定的方式将表达时带上的各种标签去除。所以在设计构建载体时可以在标签蛋白和外源蛋白之间加上蛋白酶识别位点，这样表达纯化得到融合有标签的目的蛋白后通过蛋白酶切的方式将标签去除，得到完整的目的蛋白。这些常用的蛋白酶位点有：HRV 3C蛋白酶切位点、TEV蛋白酶切位点、肠激酶切位点、SUMO蛋白酶切位点等。但是也有几点需要说明：

1）这些酶切位点特异性都比较高，但切割效率各不相同；

2）除了SUMO蛋白酶之外，其它常用蛋白酶切除标签后都会残留几个氨基酸残基。SUMO蛋白酶识别的是SUMO标签的空间结构，然后将这个标签完整切除，不会留下多余的氨基酸残基；

3）蛋白酶的切割效率也受识别位点附近的氨基酸残基性质的影响，具体可以参见有关文献；

4）有些标签比较小，免疫原性也很弱，一般不用切除，也不会对后续研究和应用产生影响，可以不必切除。但是有些大的标签，如Dsb蛋白、FkpA蛋白、GST蛋白、SUMO标签等等，还是需要切除的。

蛋白标签是加在N端还是C端

N-端或C-端标记的选择还需要根据蛋白结构、定位等特性。例如对于蛋白太小容易被降解的和比较难表达的蛋白，可以利用5’端的蛋白标签。这样既能保证蛋白的稳定性，也对外源蛋白的免疫原性影响也很小，该法适用于表位筛选。如果目的蛋白是分泌蛋白，就会遇到在目的蛋白分泌到高尔基体的过程中，蛋白5’端的信号肽，会被酶切掉的问题。这样，你标签要是装在5’端，就没什么用了。

TEV蛋白酶的使用

TEV Protease(His-tag)是一种在大抽杆菌中重组表达的带His标签(6X His tag)的烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus, TEV)的半胱氨酸蛋白酶，能特异性地识别七肽序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly/Ser，并在Gln和Gly/Ser氨基酸残基之间进行酶切，常用于去除融合蛋白的Glutathione S-transferase (GST)、His或者其它标签的蛋白酶。

建议把GST或His等标签设计在融合蛋白的N端，并在GST或His等标签与目的蛋白之间设计加入TEV Protease专一性识别与酶切的上述七肽序列。这样在GST或His标签被酶切后，在目的蛋白的N端仅有一个额外的Gly/Ser氨基酸残基，从而最大限度地减少了对目的蛋白结构和功能的影响。

TEV Protease的最佳酶切温度是30℃，在29-34℃范围内均具有较高的酶活性，但当温度达到或高于高37℃时，其酶活性会急剧下降。在实际操作过程中，为尽量保留目的蛋白的结构和生物活性，建议在4℃用TEV Protease酶切过夜。TEV Protease在pH6.0-9.0范围内具有活性，而当pH小于或等于5时，会失去酶活性。

TEV Protease还有一个突出的优点是在400mM咪唑中仍有较高活力，因此对于很多用镍柱纯化的His标签目的蛋白，可直接将TEV Protease加入含高浓度咪唑的刚刚纯化的目的蛋白溶液中，在4℃边透析去除咪唑边进行酶切。当然也可以在透析后再用TEV Protease进行酶切以去除His标签。经过酶切的目的蛋白，溶液中带有His标签的本TEV Protease以及切除下来的His标签，都可以通过与镍柱结合而去除。

TEV Protease的酶活性不会被常见的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibtor)如PMSF、AEBSF、bestatin、pepstatin、E-64、TLCK和EDTA所抑制。但靶向半胱氨酸(Cysteine)残基的蛋白酶抑制剂如NEM或IAA等，可以显著抑制TEV Protease的酶活力，因为天然的TEV Protease含有其维持酶活力所必需的Cys151。

C端His标签后未马上终止对His标签特性会不会有影响？

His分离纯化的原理为组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析（IMAC），对重组蛋白进行分离纯化，若C端His标签后未添加终止密码子，多余的氨基酸可能会影响His标签的空间构象从而影响其挂壁效果。

编辑于 2022-03-04 08:26

有没有双向奔赴的小甜文？

樱胡柰朱

跟童养夫独处第一晚就停电。黑暗中，我踹了他一脚：「我要洗澡。」洗澡水兑好后，我懒洋洋地扯住他袖子：「……不许走，我怕黑。」1一觉醒来，重回十八岁。未来的便宜老公正帮我对高考答案，看着满页的红叉，他眉头紧皱：「……你就这样去报 S 大？」没管报不报 S 大，我歪着头凑近他，好奇地问道：「宋涧生，你是不是喜欢我啊。」唰——钢笔在试卷上划出长长的一条直线，宋涧生死死地盯着我，眼中惊讶与羞恼交织翻滚。半晌，他嘲讽道：「所以呢？」啧，十九岁的他到底是太年轻，还藏不住什么情绪。我「哦」了一声，埋下头去看草稿纸，假装刚才什么也没发生。漫不经心地数完纸上做错的题目，半晌，耳边传来宋涧生低沉压抑的嗓音，似乎已忍耐许久。「许皎皎。」他咬了咬牙，眼神凶戾：「……你别招惹我。」闻言，我转过头看着他，神色少有的认真：「宋涧生——」宋涧生捏紧了手中的笔。我：「饿了。」宋涧生腾地站起身，冷冷地看我一眼，然后——去了厨房。我没忍住，笑出了声。2被我爸领回家那年，宋涧生只有十四岁。他身影清瘦，穿着不合身的旧衬衫，鞋子脏脏的，抿着嘴站在客厅里，极力地藏起眉眼间的局促不安。我站在楼梯上，对视几秒后，他率先撇开了头。阴郁敏感，自尊又自卑。这就是我对他的第一印象。对于他的到来，我说不上欢迎，也说不上排斥。只要不是我爸的私生子，一切都没问题。宋涧生只比我大一岁。其实他早就该上大学了，但是因为我，他多念了一个高三。我和他勉强也算青梅竹马。结婚后的宋涧生，人忙话少技术好，除了没有爱情，我们俩可以说是完美婚姻。契约婚姻的第十年。我偶然间发现，他好像暗恋我很久了。而就在发现这个秘密的第二天，我一觉醒来，回到了高考结束后的暑假。怎么说呢？看着端着小蛋糕的宋涧生，身量挺直，侧脸清俊。我不打算换个老公。踢掉鞋子，我用脚尖去勾他的腰。「好累。」我懒洋洋地靠在椅背上，张了张嘴：「……我要你喂我。」宋涧生的眼神很冷。与我对视良久，他率先败下阵来。小蛋糕喂到一半，宋涧生浑身一震，抓住我乱动的脚，他声音又凶又冷，带着浓浓的警告。「许皎皎。「你最好老实点。」好吧。我耸耸肩，收回脚尖。宋涧生平复了一下情绪，然后冷着一张脸，继续给我喂小蛋糕。我伸手推开，歪头看着他：「你也吃啊。」宋涧生默了默，拿着勺子的手指修长有力，一口一口地吃着剩下的蛋糕，他喉结耸动，嘴角沾上一点奶油。真可口。我不是在说蛋糕。恶劣地笑了笑，我好奇地看着他：「宋涧生，你用了我的勺子……这是不是间接接吻呢？」宋涧生捏紧勺柄，满脸隐忍：「许皎皎。」我没理他，自顾自地说道：「不，不是。」探过身，将他嘴角的奶油舔净，我满意点头：「……这才是间接接吻。」宋涧生背脊僵硬，俊脸上，一丝羞恼的神色飞快闪过。他的忍耐力，可真好。即便到了这种程度，他也只是眼神变凶，却没有任何反应。哦不。其实也有反应。我选择了收敛，开始君子动口不动手。「你好凶啊，宋涧生。「明明你也很喜欢啊，不是吗？」宋涧生绷紧了脸：「……这就是你对待我的态度？」「许皎皎。」他的脸色有点难看，「我不是你的玩具。」啧，十九岁的宋涧生，真不经逗。偏偏我忍不住就想使坏。「你当然不是玩具。」我收敛了眼里的笑意，神情认真起来：「你分明……是我的童养夫啊。」很好，宋涧生成功被我气跑。看着他走路时的别扭姿态，我总算舒服了一点。其实我还在生气。他喜欢我，却从来没有告诉过我。看着他的背影，我冷笑一声。行。那就继续憋着吧。3其实宋涧生不用担心，我的分数并没有他预计的那么低，完全可以去 S 大。重来一次，我也没换专业。从前我以为，他固执地要我去 S 大，是为了向我爸妈表现自己的价值。但现在我突然明了。或许，他只是单纯地想把我捆在身边呢？填完志愿的第三天，宋涧生打算回一趟家乡，毕竟他离开了五年，也确实该回去看一看。记忆重叠。但不同的是，这一次多了一个我。天南地北，跨越大半个中国，我赖着他，来到了一个叫作恩镇的地方。一个旧旧的小村镇。它没有 S 市的灯红酒绿，纸醉金迷，只有几条窄窄的马路，和几盏不明亮的路灯。宋涧生拿着行李，停在一处老屋前。这个老屋很大，也很宽敞，我知道这是他外婆家。因为至亲走得都太早，他很小就被皮球似的踢来踢去，在别人家里讨生活。所以第一次见面时，他才会那么狼狈。宋涧生忙进忙出，将屋子收拾得很干净。我躺在藤椅上，摇来摇去，打量着房梁上的木质雕花。我许皎皎十指不沾阳春水。宋涧生却是穷人家的孩子早当家。老屋很久没住人我理解，但和宋涧生独处的第一晚就停电，是我属实没想到的。黑暗中，我没忍住踹了他一脚：「我要洗澡。」宋涧生知道我的习惯，每天都要洗澡，停电也阻止不了。他找到蜡烛，点燃后默默地去给我烧洗澡水。兑好洗澡水，他转身就要离开，我懒洋洋地扯住他袖子：「……不许走，我怕黑。」宋涧生举着蜡烛的背影一僵。四周极其安静，隐隐约约，我似乎听到了他咬牙的声音：「……许皎皎，你知道你在说什么吗？」「知道啊。」我脱下百褶裙，漫不经心地扔到旁边的木盆里：「……我说我怕黑啊。」衣物擦过皮肤，发出细碎的动静。宋涧生的呼吸明显加快许多，再开口时，他声音里已经带上了警告：「许皎皎！」啧。听见了听见了，两只耳朵都听见了。喊得这么凶，却保持着背对的姿势，动也不敢动。我理了理头发，没心思管他。舀起一瓢水，从肩膀上淋下。别的先不说，兑洗澡水这活儿，宋涧生干得是真不错。不过听见水声，他都快疯了。嘻嘻。可能是没想到我真敢这么干吧。4我承认这几天欺负宋涧生的次数，确实有点频繁。他好像每天都在生气。不过我早习惯了。和他纠缠了那么多年，宋涧生从来就没对我笑过，不管是结婚前还是结婚后，他都是连名带姓地喊我「许皎皎」。这实在叫人不爽。院子里，宋涧生坐在桂花树旁，正在洗衣服。他手臂上有着不太夸张的肌肉，洗衣液捣出的黏糊糊泡沫沾在上面，莫名透出一丝贤惠的意味。他看起来很健康，肤色不白，却也不算黑，很有少年的朝气，眼神却凶郁。十年后的宋涧生，我确实玩不过。但眼前的这个宋涧生，他只有十九岁，鲜嫩多汁，浑身都泛着青涩的气息，倔犟得像一匹小野马，除了尥蹶子，什么都不干。如果我是十八岁的许皎皎，那还真拿他没办法。可我不是。慢悠悠地向桂花树走去，我在他身后停住脚步，然后理直气壮地趴在了他背上。搂住宋涧生的脖颈，我忍不住在他耳边抱怨：「……宋涧生，我真的很不喜欢你连名带姓地叫我名字。」我眼神苦恼：「你怎么不叫我皎皎呢？「实在不行，宝贝也不错啊。」宋涧生背硬得像钢板，他右手紧紧捏着一团布料，手背上已经绷出了青筋。深呼一口气，他站了起来。「许皎皎！」又来了又来了。我充耳不闻，仍旧挂在他身上晃荡，蹭了蹭他的脸颊，我继续逗他：「……宋涧生，你叫我一声姐姐好不好？我给你买糖吃啊。」宋涧生不敢碰我的腿，只敢口头警告道：「许皎皎，你别太过分！」许皎皎，你别招惹我。许皎皎，你最好老实点。许皎皎，你别太过分。他常对我说的话，翻来覆去，也就这么三句。不过我向来是充耳不闻。搂着他的脖子，我不依不饶：「宋涧生，你不许对我这么凶，我不喜欢！」宋涧生没理我。你看你看，他又在生气了。宋涧生也不伸手接我一下，就任凭我这么吊着他，径直走进屋子里后，他一手掰开我的双手，将我扔在了床上。一点都不怜香惜玉。不满地在床上滚了两圈，我勾起床边轻薄布料的带子，扔到了他怀里，语气神态是十足的理所当然：「……一起洗了吧。」宋涧生完全是下意识地接住了它，看了一眼手里的布料，脸色青红交加。我一脸无辜：「我不能碰冷水，你又不是不知道。」忍了又忍。他仍旧是转身，乖乖往往院子里走了。「宋涧生。」我拿起床边的书，唤住了他。翻到昨晚折叠的那一页，我不忘提醒他：「……左手那玩意儿，别和我的混在一起洗。」皱了皱鼻子，我神色认真极了。「唔……石楠花的味道太重了，我不喜欢。」「许皎皎！」宋涧生被惊得转身，他脖子上泛起红意，不可置信地看向我：「你到底有没有羞耻心？！」哦？这是恼羞成怒了？我歪头，看向他左手那团淡蓝色布料。「其实——「我比较喜欢你穿三角的。」虽然他穿这个款式，应该会有点不舒服。但这关我什么事呢……对吧？

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Hedge

补充：FLAG-tag由8个氨基酸残基组成，序列是Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys （D-Y-K-D-D-D-D-K）。因为它的分子量很小，只有1.01kDa，所以不会遮盖融合蛋白中其他的蛋白表位和结构域，更不容易改变融合蛋白的功能、分泌或是运输。但是实验表明FLAG-tag和特异性的抗体结合力没有His-tag和Ni2+-NTA或是其他一些亲和标签和检测系统的结合力那么牢固，融合蛋白的纯度只能达到90%左右 (Terpe,2003)。不过可以把三个FLAG-tag设计在一起（DYKDHDG-DYKDHDI-DYKDDDDK），增加和抗体的结合以及检测的敏感度。

2022-06-07

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4

Ivy

作者

感谢补充[赞]

2022-06-08

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1

Hedge

​Ivy作者

相互学习[握手][握手]

2022-06-20

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骊山

his标签如果有残留 有相关的法规要求残留量或者其他要求吗

2022-04-19

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分泌蛋白007

请问一下蛋白表达出来干嘛，注入模型，看它的功能吗？还有别的功能吗

2022-04-07

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一个著名的按键

作蛋白很多为了研究机制，注入模型看功能的应该是做疫苗跟生物药的方向吧。

2022-04-15

​

1

Ivy

作者

我们一般是研究蛋白功能，所以自己表达纯化一个重组蛋白。或者已知蛋白有生物活性，表达纯化出来用作干细胞分化等等

2022-06-20

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1、机械破碎

2、超声破碎

3、化学方法破碎 可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在pH>9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。

变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定，一般不要超过pH1.0。有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。 通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。

复性中常采用

稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。

透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。

柱上复性：是研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，如华北制药的G-CSF复性据说是通过柱上复性进行的。常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。 还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫键慢慢形成。但是由于二硫键的形成并不是蛋白质正确折叠所必须的，可以考虑在变性剂完全去除之后，在去除还原剂使已经按照正确的结构相互接近的巯基间形成正确的二硫键。

常用的氧化方法有：

空气氧化法：在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势。

氧化还原电对（redox）：常采用GSSG/GSH，通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势，也可以在添加了还原剂如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG，如：5mMGSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1）。 1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。

2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。

3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。

4、0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。

5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在%5-30%。

6、一定的盐浓度，可能是为了降低某些带电集团间的斥力，有利于蛋白质的折叠。

7、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。

8、色谱法：通过将目标蛋白结合到层析柱上，减少蛋白分子间的相互影响，该方法得到越来越多的应用，常用的色谱有SEC、HIC、IEC、IMAC等。

当然，虽然有很多所谓的理性的复性方案设计，复性工作更多的是一个经验的过程，没有一种通用的方法可以套用。 根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。

1、凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。

2、光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。

3、色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。

4、生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。

5、黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。

6、免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。 1、MHCⅡ JBC 269(47）：1994

增溶：16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037度1hr.

复性：8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein.

2、增溶：10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mMGlucine pH8.5.

复性：10倍稀释到10mM DTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTris pH8.0.对起始缓冲液密闭透析16hr，开口透析8hr，对150mMNaCl,10mM Tris pH8.0透析48hr。

3、Bovine Prethrombin-2,JBC 270⑴：1990 四对二硫键。

增溶：7M GdnHCl,10mMTris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml.

复性：稀释到100mM Na2HPO4,2 mM EDTA,0.1% PEG,0-4M GdnHCl,0.1 mM GSSG,0.2 mM GSH,pH7.4,0.025 mg/ml Protein.RT 24hr.对4L 25mM sodiumphosphate,2mM EDTA,0.1%PEG,pH7.4 透析3次，温度4度。 一般说来，复性液的体积较大，为了减少处理体积，在进行柱纯化以前可以先进行硫酸铵沉淀，沉淀在低速离心收集后复溶的盐浓度较高，可以直接进行HIC纯化，目标峰经适当稀释后（cond<5mS/cm）进行IEX纯化，然后通过SEC脱盐，更换缓冲液，除菌过滤后，在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。

当然在复性浓度较高的情况下，也可以直接将复性液进行IEX纯化，优点是在纯化的同时进行体积的浓缩，为以后的精制创造条件。

从生产的角度看，由于每增加一步纯化工序便降低很多收率，所以可过两到三次柱纯化，工艺越简单越有利于收率的提高。当然这只是一个一般的原则，对于纯度要求较高的产品如重组人白蛋白，不得不进行多次纯化。 1. 真核细胞表达外源蛋白质的缺点

一些蛋白质需要翻译后的修饰，如糖基化，则必须选用真核细胞。但是无论是正在临床的还是市场上的蛋白质药物，主要的是以大肠杆菌作为宿主细胞。

1982年第一次选用大肠杆菌作为表达重组DNA的宿主细胞，表达的产物是人胰岛素。选择原核细胞作为表达载体，因为真核细胞表达外源蛋白质有其缺点：⑴真核细胞的天然蛋白质的表达和外源蛋白质的表达，表达量相当少，即使有的蛋白质表达量高时，容易出现蛋白质的无活性的现象，或者形成聚集体；而原核细胞表达的蛋白质量比真核细胞大很多；

⑵相对于大肠杆菌，人类对于真核细胞的基因的了解还是有限的，而对大肠杆菌的基因了解的相当透彻，并能进行熟练的基因重组等操作对大肠杆菌的基因进行改造；

⑶真核细胞生长到高密度需要更长的时间（7天左右），并且细胞的最终浓度低，所以需要较大的培养容器，而大肠杆菌可以在几个h以内达到108cells/mL；

⑷动物细胞生长的培养液的造价较高，并且大部分使用血清作为生长液的添加剂，从而提高了产品的造价并且不利于以后的纯化步骤；

⑸原核细胞的坚硬的细胞壁，可以使用简单的搅拌的方法完成传热、传质过程，而大部分的真核细胞需要温和的培养方法及复杂的操作以达到其对培养基的要求。

基于以上的原因，真核细胞尤其是哺乳动物细胞表达外源蛋白质大部分处在研究阶段，大部分重组蛋白质使用的表达载体是大肠杆菌细胞。大肠杆菌表达的外源蛋白质量相当大，有时达到细胞内蛋白质总量的5-20%，甚至达到50%以上。但是，大肠杆菌表达的蛋白质，当含量相当大时，有时由于原核细胞缺少分泌到胞外的机制或者折叠的机制，最后表达的蛋白质往往以无活性的包涵体的形式存在。

2. 包涵体表达蛋白质的优越性

为了研究基因的功能，可以把体内的基因转移到其他表达宿主中，研究基因表达性状以确定基因的功能。但是，外源基因的表达，特别是真核生物基因在大肠杆菌中的表达，由于宿主菌缺乏此种基因表达的调控机制，细胞内的化学环境与其天然环境差异，如氧化还原环境、胞内pH、自由水的浓度，以及外源基因的导入，使得表达目的蛋白质的细胞在非正常状态下生长，表达的蛋白质多数以无活性的包涵体的形式存在。

在下游生产过程中特别是在医药生产中，以包涵体形式表达的蛋白质具有一些优越性。

⑴ 异源表达的蛋白质很容易被宿主细胞内的蛋白质酶降解，如果重组蛋白质以包涵体形式表达，由于包埋了酶攻击的位点，可以最大限度地抵抗蛋白质酶的攻击；

⑵ 包涵体表达的蛋白质没有活性，细胞破碎和以后的纯化步骤不用考虑蛋白质的失活问题；

⑶ 包涵体形式表达的蛋白质与宿主细胞的其他蛋白质的分离比可溶蛋白质的分离方法简便，造价低，使用简单的离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白质成分进行有效的分离；

⑷ 有些表达的外源蛋白质对细胞有毒性或者致死，大量表达时会导致细胞的死亡，最终的细胞数量和产物相当低；而包涵体形式的蛋白质由于丧失了生物活性从而可以高效大量地表达；

⑸ 对于以包涵体形式表达的产物可以比较容易进行在线观测定性，含有包涵体蛋白质的细胞有较大的折射率，不必像可溶的蛋白质需要细胞破碎后使用酶学或者电泳学的方法进行鉴定。

包涵体的形成和蛋白质在等电点或者高盐情况下的沉淀是不同的。在沉淀过程中，分子是通过分子表面的相互作用而形成的分子的聚集，无论在聚集的沉淀状态还是在天然状态，没有明显的构象的变化。因此，当溶液中的pH重新改变，或者沉淀重新溶解的时候，蛋白质的结构和活性会重新获得。蛋白质的包涵体形式的聚集则不同于蛋白质的沉淀，把包涵体蛋白质直接溶解在天然的缓冲液中得不到天然的构象，无活性的聚集体与其天然活性形式之间没有自然的平衡转化的过程。包涵体的形成是由于范氏引力、疏水作用力和二硫键等作用力形成的，破坏这些作用力比较困难，溶解包涵体需要加入强的变性剂破坏多肽链之间的作用力，说明聚集体的多肽链之间的作用力远远大于普通的沉淀的分子间的作用力。当变性剂溶解的包涵体只是简单地通过稀释或者透析除去变性剂，而不是寻找合适的复性的条件的话，聚集体会重新形成，并且，不同于沉淀溶解的100%的活性的保留，包涵体的复性水平往往很低。所以，蛋白质沉淀是活性的天然蛋白质之间的作用力形成的，而包涵体的形成是在细胞内新合成的蛋白质肽链中间体而形成的，体外折叠时的聚集体是折叠过程中折叠中间体形成的。这些折叠的中间体并不一定是形成高级天然结构的中间体，从天然结构也不能推论出折叠中间体的构象。

1、同一个人相同试剂两次实验结果差距较大。

这种情况可能发生，你可以再重复2次试验，观察一下

2、相同浓度包板结果CV值大，总是会出现一两个孔反常现象

是一次还是2次试验结果呢，如果仅是1次这样，很正常

3、倍比稀释后包板出现某两个浓度之间OD值差距达到两倍左右