三氯乙酸 蛋白质 酶 生物 实验

三氯乙酸是蛋白酶抑制剂，可以使酶失活。

在到达酶反应时间后，加入高浓度三氯乙酸，可以使酶蛋白变性，终止酶反应。

三氯乙酸，有机化合物，又名三氯醋酸，无色结晶，有刺激性气味，易潮解，溶于水、乙醇、乙醚。

一、参考------万婧， 张海德， 韩林《乙醇提取海南番木瓜中木瓜蛋白酶的工艺研究》

1 材料与方法

1.1 主要材料

番木瓜：海南儋州；所用试剂：国产分析纯。

1.2 主要仪器

紫外分光光度计：U V -2450，Shim adzu；恒温

水浴锅：B-260 型，上海亚荣生化仪器厂；精密

pH 计： 320-S 型， M ettler toledo； 冷冻离心机：

H ettich 32R ， Zentrifugen； 分析天平： PB3002-N

型，M ettlertoledo。

1.3 实验方法

1.3.1 木瓜蛋白酶活力测定酶活力单位定义：在

规定条件下，1 m in 内酶水解酪蛋白释放出相当于

μg/m L 酪氨酸在275 nm 波长处的吸收度为1 个活

力单位。以0.1 m ol/L 盐酸溶液作空白，在275 nm

波长处测定空白溶液，待测定液，对照品溶液的

吸光度[4]。

1.3.2 酶活力计算[4]

按下式计算酶活力：

每1m g 木瓜蛋白酶活力单位=A /A s×Cs×

12/2×稀释倍数/W

式中：A 为待测定液的吸光度减去空白溶液

的吸光度；

A s 为对照品溶液的吸光度；

Cs 为酪氨酸对照品溶液的浓度，μg/

m L；

W 为样品质量，m g。

木瓜蛋白酶1 个活力单位相当于释放1 μg 的

酪氨酸。规定酶浓度为1 m L 测定液释放40 μg 的

酪氨酸。

1.4 操作方法

1.4.1 乙醇提取番木瓜中木瓜蛋白酶实验采用海南本地产新鲜青番木瓜，通过在不同实验条件下对番木瓜中木瓜蛋白酶进行提取，并经系列实验后确定出各最佳工艺参数，最终获得酶活性较高的木瓜蛋白粗酶。

提取工艺为：新鲜青番木瓜→取皮切碎→加30%冰水捣碎→过滤→取滤液离心15 min(3500 r/min、4 ℃)→取上清液弃沉淀→加入酶活保护剂→加入一定浓度乙醇(%)→调pH→静置过夜→离心20 min(5500 r/min)取沉淀→测酶活→真空冷冻干燥→粉碎→得粗酶。

1.4.2 木瓜蛋白酶活性的测定[5] 由1.3.2 可知，紫外法测定的吸光值与木瓜蛋白酶活性成正比，本实验将以吸光值反应酶活性大小。

1.4.3 最适酶活保护剂的确定实验采用L-cys 和ED TA 作为酶的保护剂。精确称取L-cys 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 m ol/L 及ED TA 0.002、0.004、0.006、0.008、0.01 m ol/L 分别加入到离心后的滤液中，加入55% 的乙醇并调pH 至8.8 后静置过夜，离心取沉淀，紫外分光光度计测吸光值。

1.4.4 最适pH 的确定实验设计了对pH 值从5.0～9.0 范围内的考察，于不添加任何酶保护剂的离心滤液中加入55% 的乙醇，调pH 分别至5.0、6.0、7.0、8.8、9.0、9.5 后静置过夜，离心取沉淀，紫外分光光度计测吸光值。

1.4.5 最适乙醇浓度的确定实验设计了对乙醇添加量从45% ~95% 范围内的考察，于不添加任何酶保护剂的离心滤液中分别加入45% 、55% 、65% 、75% 、85% 、95% 的乙醇，调pH 至8.8，静置过夜，离心取沉淀，紫外分光光度计测吸光值。

1.4.6 最适酶反应时间的确定在酶活测定过程中考察在反应温度为40 ℃条件下，反应时间分别为0、5、10、15、20、25 m in 时对酶活性的影响。

1.4.7 最适酶反应温度的确定酶活测定过程中酶反应温度分别为30、40、50、60、70、80、90 ℃各反应10 m in 时对酶活性的影响。

1.4.8 金属离子对酶活性的影响实验考察了相同浓度(0.01 m ol/L)不同金属离子对酶活性的影响。

1.4.9 不同浓度Ca2+ 对酶活性的影响重点考察浓度分别为0.01、0.03、0.05、0.07、0.10、0.15、0.20 m ol/L 及不添加情况下对酶活性的影响

结论

在提取工艺中，L-cys 和ED TA 添加量分别为0.04 m ol/L 和0.004 m ol/L 时对木瓜蛋白酶活性起到最佳保护作用，乙醇添加量为45% ，pH 为7.0 时能获得最佳提取效果。在测定工艺中，最适酶反应时间为10 m in，最适酶反应温度为80 ℃，能获得较高活性木瓜蛋白酶，同时，通过金属离子对酶活性影响考察得，Cu2+、K + 对木瓜蛋白酶活性有一定的抑制作用，而Ca2+ 则对其活性有一定的激活作用，且在浓度为0.05 m ol/L 时效果最佳。

二、参考----肖 贵 平《木瓜蛋白酶超声法提取工艺及其酶学性质》

1. 3 方法

1. 3. 1 酶液制备 选择新鲜的番木瓜,清洗去皮、籽、瓤后,切块破碎,称取果肉,加入一定量的4 ℃蒸馏

水进行打浆果浆在一定条件下进行超声波处理, 4000 r·min- 1离心15 min除杂过滤后,上清液选用截留

分子质量为20000 u的PP中空纤维膜进行超滤浓缩,收集酶液样品,冰箱保存备用. 为保持样品的活性,

超声波处理前先预冷至0 - 4 ℃,超声波处理时采用冰浴冷却,整个过程中料液的温度尽量控制在低温状

态. 重复3次.

1. 3. 2 蛋白质含量、木瓜蛋白酶活力的测定 蛋白质含量的测定采用Folin - 酚法[ 7 ] ,标准曲线的回归方

程为:

y = 1570. 089x - 65. 181 ( r = 0. 964, n = 9) (1)

式中: y表示蛋白质质量浓度/ (μg·mL - 1 ) x表示D (500 nm).

木瓜蛋白酶活力的测定: 1 mL 酶液在一定温度和pH条件下, 1 min水解酪蛋白产生1μg的酪氨酸为

1个酶活力单位(U). 该酶水解酪蛋白底物,然后加入三氯乙酸终止酶反应,将未水解的酪蛋白沉淀除去,

滤液用紫外分光光度法测定,可根据光密度计算酶活力. 酪氨酸标准溶液的配制见文献[ 9 ] ,标准曲线回

归方程为:

y = 127. 305x - 2. 010 ( r = 0. 996, n = 5) (2)

式中: y表示酪氨酸质量浓度/ (μg·mL - 1 ) x表示D (275 nm).

样品酶活力的测定[ 8, 9 ] :取适当稀释的酶液2. 00 mL在(40 ±0. 2) ℃下预热2 min,加入2. 00 mL已在

(40 ±0. 2) ℃恒温水浴中预热5 min的酪蛋白溶液(10 mg·mL - 1 ) ,摇匀加入时开始计时,反应10 min

后,加入4. 00 mL三氯乙酸,立即摇匀,终止反应从水浴中取出,静置10 min后过滤在275 nm波长下,用

10 mm比色皿,测定滤液的D (275 nm). 酶试样做3个平行试样空白对照试验,先加入三氯乙酸,然后加

酪蛋白溶液. 重复3次.

酶活力的计算:

X =A ×K ×8 /2 ×1 /10 ×n ×E = 2 /5 ×A ×K ×n ×E (3)

式中: X 表示样品酶活力/UA表示试样溶液的D (275 nm) K表示吸光常数n表示稀释倍数E表示

换算系数(0. 50).

木瓜蛋白酶比活力的计算:

木瓜蛋白酶比活力/ (U·g- 1 ) =酶活力/蛋白质含量

1. 3. 3 数据分析方法 回归分析采用SPSS 11. 0软件分析数据.

1. 3. 4 超声波强化提取木瓜蛋白酶 取一定量的木瓜果浆,用200 W功率的超声波分别进行100、200、

300、400 s的超声处理,然后离心,过滤,得到样品溶液,测定蛋白质含量和酶活力.

超声波处理时间为200 s,分别用100、200、300、400、500W的超声波功率对木瓜果浆进行处理,然后

离心,过滤,测定蛋白质含量和酶活力.

称取一定量的木瓜果肉进行打浆,配制成30%、40%、50%不同质量分数的果浆,在200 W、200 s、冰

浴条件下进行超声处理,然后离心,过滤,测定蛋白质含量和酶活力.

正交试验:根据单因素试验的结果,选用正交表L9 (34 )进行试验,并进行方差分析,得出超声波强化

提取木瓜蛋白酶的最佳工艺参数.

1. 3. 5 木瓜蛋白酶酶学性质测定 以酪蛋白为底物,在pH 7. 5条件下,取酶液分别在梯度为5 ℃的30 -

90 ℃水浴中测定其酶活力.

以酪蛋白为底物,在pH 7. 5条件下,将酶液分别在温度梯度为10 ℃的30 - 90 ℃的温度下水浴一定

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第3期肖贵平:木瓜蛋白酶超声法提取工艺及其酶学性质

时间(5、15、30、45、60 min)后,取出冷却,于40 ℃下测定其酶活力. 以未经热处理的酶液为对照,并作为原

始酶活力来计算残余酶活力.

以酪蛋白为底物,分别用pH值为4. 8、5. 4、6. 0、6. 6、7. 2、7. 8的缓冲液配制底物溶液和稀释酶液,测定

酶活力. 反应缓冲系统:在pH为3. 6 - 5. 8时,采用0. 02 mol·L - 1 HAC - NaAC缓冲系统在pH为5. 8 -

8. 0时,采用0. 02 mol·L - 1NaH2 PO4 - Na2HPO4 缓冲系统. 在不同pH条件下, 40 ℃水浴保温1 h后测定酶

活力.

配制浓度为0. 025 mol·L - 1的KCl、NaCl、CaCl2、MgSO4、CuSO4、ZnCl2、EDTA、Cys、Vc试剂溶液. 分别

取9 mL酶液与1 mL上述试剂混合摇匀,试剂浓度为0. 0025 mol·L - 1 ,室温下反应15 min后,以酪蛋白为

底物,在pH 7. 5条件下,测其相对酶活力.

以20 mg·mL - 1的酪蛋白溶液为母液分别配制含量梯度为2 mg·mL - 1的2 - 14 mg·mL - 1的底物溶

液,在40 ℃、pH 7. 5条件下,反应10 min,测定光密度值(表示生成物的量) ,计算Vo,求出米氏常数Km和

最大反应速度Vm,得出米氏方程.

最佳提取工艺条件为超声波功率300W,超声处理时间200 s,果浆质量分数30%经超声波强化提取,酶活力提高到原先的1. 71倍在以酪蛋白为底物、pH 7. 540 ℃条件下,木瓜蛋白酶的Km值和Vm值分别为1. 4709 mg·mL - 1和5. 5252μg·mL - 1 ·min- 1 最适温度为70 - 80 ℃,最适pH值为5. 4 - 6. 6该酶在40 ℃以下, pH为5. 4 - 6. 0时酶活力相对稳定EDTA、Cys和Vc对酶活力具有激活作用, CuSO4 和ZnCl2 具有抑制作用,而KCl、NaCl、CaCl2、MgSO4 对酶活力

的影响不大.

1.三氯乙酸：蛋白酶抑制剂，使酶失活。

碘乙酸：抑制剂，抑制3-磷酸甘油醛脱氢酶。

硫酸肼：稳定剂，防止3-磷酸甘油醛自然分解。

2.三氯乙酸的作用：主要用于有机合成和制备医药、也可用作化学试剂、杀虫剂。

碘乙酸的作用：用作分析试剂，染料制备，有机合成与酶的抑制剂。

硫酸肼的作用：用作分析试剂，如作沉淀剂、还原剂。还用于有机合成。

淀粉遇碘变蓝是淀粉的特性，所以丁是淀粉；三氯乙酸使蛋白质变性后呈浑浊状，说明甲、丙为淀粉酶和蛋白酶，乙为清水；丁丙混合后不变蓝说明淀粉被水解了，根据酶的专一性，可知丙为淀粉酶溶液，所以D选项正确．

故选：D．

我也不明白为毛要加TCA，我做了不加TCA的，吸光度在增加；但是加TCA，测吸光度要么没变化，要么降低的超级少。去问老师吧，应该是呈下降的。实验室好几个人只有一个人测出来是下降的，而且重复不出来。心累

在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4·2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，使最终的酸浓度为2mol/l左右。

不过后来我加了盐酸进去，也没有沉淀生成，应该是酪蛋白出问题了:cry:wujia115(站内联系TA)也许是酪蛋白没有溶解。溶解酪蛋白时要加碱才好溶。例如：0.5%酪蛋白溶液：称取酪蛋白（干酪素）0.25g放入50mL容量瓶中，加入约20mL水，再准确加入1mol/L NaOH 5mL，当酪蛋白溶解后，准确加入1mol/L乙酸5mL，最后加水稀释定容至50mL，充分摇匀。erping80(站内联系TA)ls，我加了0.1mol/L NaOH 10mL,用磷酸缓冲液定容的apple2001(站内联系TA)建议测下pH。友情提醒，不要沾到三氯乙酸了，小心蜕皮：）bulebird(站内联系TA)配制酪蛋白溶液时，测酸性蛋白酶要加入几滴乳酸在沸水浴中进行溶解，一定要溶解至澄清状，溶解冷却至室温后要调节一下pH，要与所用缓冲液的pH基本一致。如果溶解充分，再加入三氯乙酸后还没有沉淀沉声的话，那肯定就是酪素的问题了。酪素有几种，并不是所有的酪素都适合用来测蛋白酶活性的，一定要选好了。