2019-01-11
二硫键,又称S−S键,是2个巯基被氧化而形成的−S−S−形式的硫原子间的共价键,在蛋白质分子的立体结构形成上起着一定的重要作用。为了确定蛋白质的一级结构,首先必须将二硫键打开,使之成为线状多肽链。DTT和TCEP是常用的还原二硫键的试剂,那二者在使用中有什么不同呢?
DTT中文名称为二硫代苏糖醇,是苏糖醇的C-1及C-4位羟基置换成巯基的化合物,常常被用于蛋白质中二硫键的还原,可阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。
DTT有两个巯基基团,其作用能维持3~7天,挥发性不强,使用时可以直接加入到悬滴中去,或通过微透析的方法加入。但DTT往往无法还原包埋于蛋白质结构内部(溶剂不可及)的二硫键,这类二硫键的还原常常需要先将蛋白质变性(高温加热或加入变性剂,如盐酸胍、尿素或SDS)。反之,根据DTT存在情况下,二硫键还原速度的不同,可以判断其包埋程度的深浅。另外,DTT可以使Ni被还原,因此在用Ni柱纯化带有His标签的蛋白时要避免使用DTT,而应该考虑TECP。
二硫键的断裂通常需要有大量的自由巯基和二硫键交换,三价膦系衍生物由于其较强的还原能力和对二硫键的选择还原性得到很多研究者的青睐。这类还原剂的还原是一个定量反应的过程,其原理是其中心原子“P”所带的孤电子对能与氧原子形成配位共价结合而具有还原性。如下式所示:
TCEP,三(2-羰基乙基)磷盐酸盐,是三价磷系衍生物中作用最优的。它是一种无色、无味、易溶于水的弱还原性物质,在水中溶解度能达到310mg/mL。其在空气和水溶液中具有较高的稳定性,受温度和浓度的影响小。TCEP是一种极为合适的部分还原试剂,对还原二硫键选择性极强,除半胱氨酸外,几乎没有与其它氨基酸的副反应,并且能在更宽的pH值范围包括酸性条件(pH值3)下使用,从而有效减少酰胺键的水解。TCEP的反应活性温和、易溶、毒性小,且更容易操作,在酸性、碱性溶液中的稳定性都很好。而且还原能力比DTT强,它的作用可以维持2~3周,是公认的DTT(二硫代苏糖醇)的一种良好替代物。
DTT(二硫代苏糖醇)和TCEP(三(2-羰基乙基)磷盐酸盐)可以相互代替,只是效果不同而已。与DTT相比,TECP还原能力更强,更具有选择性;无论在酸性还是碱性条件下都更加稳定;本身不带有电荷,不影响后续的实验。TCEP不仅是一种高效的二硫键还原剂,而且在某些巯基的交联反应中不需要除掉,因而在蛋白质化学及蛋白质组学研究常常优先选择TCEP。
】 2-氨基-3-巯基丙酸甲酯盐酸盐;盐酸美司坦;methyl-α-amino-β-mercaptopropionate hydrochloride。【性质】 本品为白色结晶或结晶性粉末。在水中极易溶,甲醇中易溶,乙醚中几乎不溶。熔点138~142℃(分解)。有类似蒜的臭气,味酸,有引湿性。可溶解黏痰,有黏膜保护和修复作用。
【质量标准】 吉林省药品标准
指标名称指标
C 4 H 9 NO 2 S·HCl含量/%≥98.0
酸度(pH)2.8~3.8
硫酸盐/%≤0.05
干燥失重/%≤0.5
炽灼残渣/%≤0.1
重金属/10 -6 ≤20
详细信息
【用途】 黏痰溶解液。用于因痰液黏稠而引起的呼吸困难。
用法及剂量 口服:一次200mg,一日3次。
【安全性】 有恶心、呕吐、食欲不振、眩晕、水肿、大便溏薄、肝功能减退和支气管痉挛。心脏病、肝病患者忌用。
阴凉干燥处保存。
外观:无色透明液体。
香气:具有少许硫醇气味。
熔点(℃): -100
沸点(℃): 157~158
相对密度(水=1): 1.1143
相对蒸气密度(空气=1): 2.69
饱和蒸气压(kPa): 0.133(20 °C)
闪点(°C): 73
pKa:Value: 9.64±0.10 (25 °C)
溶解性:易溶于水,乙醇和乙醚等有机溶剂,与苯可以任意比例混溶。
水中溶解度:1 mg/mL 敏感性:对空气敏感,易吸潮 用途用于合成树脂及用作杀霉菌剂、杀虫剂、增塑剂、水溶性还原剂等。 聚合级高纯巯基乙醇可用作氯乙烯、丙烯腈等的调取剂,以及聚合催化剂、聚合物交联剂、固化剂。该品得到美国食品药物管理局的批准,可用作丙烯腈、苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯三元树脂制食品包装用吹塑容器时的添加剂。 生物学应用2-巯基乙醇可以打开蛋白质中存在的二硫键:cysS-Scys + 2 HOCH2CH2SH → 2 cysSH + HOCH2CH2S-SCH2CH2OH
二硫键被打开后可以使蛋白质的四级或三级结构被破坏。[2]由于2-巯基乙醇能够打开蛋白质的结构,它常常被用于蛋白质分析。而2-巯基乙醇也常常被用于保护蛋白质中自由的半胱氨酸巯基之间不会错误形成二硫键。
作为还原剂,2-巯基乙醇常常可以与二硫苏糖醇(DTT)或三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP)互换使用。
2-巯基乙醇是少数几种被发现可以延长小鼠寿命的化合物。[3]在微克量级水平上,2-巯基乙醇被观察到对实验鼠的生命具有多种可能的正面效应。 制备早期采用氯乙醇与硫氢化钠反应制得。环氧乙烷与硫化氢按摩尔比1:3.5配合,以强碱性阴离子交换树脂为催化剂,在42℃左右反应。所得粗品含量约52%,还含少量硫二甘醇(沸点282℃),较易分离获得2-巯基乙醇。2-巯基乙醇可以通过环氧乙烷和硫化氢反应来生成。 危害毒性分级:高毒
急性毒性:口服-大鼠 LD50: 244 毫克/公斤;口服-小鼠 LD50: 190 毫克/公斤
刺激:皮肤-兔子,10毫克/24小时,重度;眼睛-兔子,2毫克,重度
健康危害: 吸入 、摄入或经皮肤吸收后会中毒。中毒表现有紫绀、呕吐、震颤、头痛、惊厥、昏迷,甚至死亡。对眼、皮肤有强烈刺激性。可引起角膜混浊。
环境危害: 对环境有危害,对水体可造成污染。
燃爆危险: 本品可燃,有毒。
危险特性: 遇高热、明火或与氧化剂接触, 有引起燃烧的危险。受高热分解放出有毒的气体。 操作处置与储存安全操作的注意事项:避免接触皮肤和眼睛。 避免吸入蒸气或雾滴。切勿靠近火源。严禁烟火。采取措施防止静电积聚。
安全储存条件: 使容器保持密闭,储存在阴凉、干燥通风处。打开了的容器必须仔细重新封口并保持竖放位置以防止泄漏。建议贮存温度 2- 8 oC。 其他2-巯基乙醇可以与醛或酮反应,生成相应的氧硫杂环化合物,这使得2-巯基乙醇可以作为羰基的保护基。
The lysate was clarified by centrifugation and was batch bound to 100 ml of nickel-NTA agarose (QIAGEN) overnight at 4°C. The next day the resin was packed into a 5-cm-diameter column and washed sequentially with the following buffers: (i) 25 mM HEPES (pH 7.5)–1 M NaCl, 20 mM imidazole–5 mM TCEP and (ii) 25 mM HEPES (pH 7.5)–500 mM NaCl–40 mM imidazole–5 mM TCEP. The washes were carried out until a baseline at 280 nm was reached as determined by UV absorbance monitor. The protein was eluted from the column using 25 mM HEPES (pH 7.5), 250 mM NaCl, 200 mM imidazole, and 5 mM TCEP. After elution, the protein was concentrated to 300 ml and loaded onto a Superdex 200 resin column (14 by 100 cm). The column was run at 40 ml/min using 10 mM HEPES (pH 8.0)–150 mM NaCl–1 mM TCEP. Fractions were assayed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE), and the PPAT fractions were pooled.
To remove bound CoA from the protein, the protein solution was buffer exchanged into 10 mM citrate (pH 5.0)–1 mM TCEP by using an S1Y10 spiral cartridge (Millipore). After buffer exchange the protein was concentrated to 300 ml and run on a column of Superdex 200 resin (14 by 100 cm) which had been equilibrated with 10 mM HEPES (pH 8.0), 150 mM NaCl, and 1 mM TCEP. The column was run as described above, and the fractions were checked by SDSPAGE. PPAT fractions were pooled and concentrated to _10 mg/ml. The pooled protein was divided into aliquots and stored at _80°C.
Throughout the manuscript, PPAT concentrations represent the concentration of monomers unless otherwise noted.
细胞粘贴( 600克,湿重)是resuspended以1.8升在25毫米hepes ( pH值7.5 ) , 1 % ,在Triton X - 100 ,氯化钠250毫米, 5毫米咪唑, 5毫米氯化镁, 2毫米的三( 2 -羧)膦盐酸盐( t cep) 。 benzonase ( 80 _l 预订行业)补充说,和细胞溶解,由两个通道,通过一个dyno -轧机类型kdl (格伦米尔斯)用600毫升会议厅和500毫升的0.25至0.5毫米的玻璃珠。叶轮的速度是4200每分钟转速,流速为100毫升/分钟。
该试剂是澄清的离心是一批势必100毫升的镍-国家旅游局琼脂糖( qiagen )一夜之间在4 ℃的温度第二天树脂装入一个5厘米直径柱和水洗顺序符合以下缓冲器: (一) 25毫米hepes ( pH值7.5 ) -1米氯化钠, 20毫米的咪唑5毫米tcep及( ii ) 25毫米hepes ( pH值7.5 ) -500毫米氯化钠40毫米咪唑5毫米tcep 。该洗进行,直到基线在280 nm的达成所定的紫外吸光度监察。蛋白质被洗脱,从柱使用25毫米hepes ( pH值7.5 ) ,氯化钠250毫米, 200毫米咪唑,和5毫米tcep 。后洗脱,蛋白集中到300毫升装上superdex 200树脂柱( 14 100公分) 。该栏是运行在40毫升/分钟使用10毫米hepes ( pH值8.0 ) -150毫米氯化钠1毫米tcep 。组分测定十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳( sdspage ) ,以及ppat馏分被汇集。
删除约束,农委会从蛋白质,蛋白质的解决办法是缓冲交换到10毫米,柠檬酸( pH值5.0 ) -1毫米tcep使用s1y10螺旋墨盒( millipore ) 。后缓冲交流的蛋白质集中在300毫升和运行的一列superdex 200树脂( 14 100厘米)已平衡与10毫米hepes ( pH值8.0 ) , 150毫米,氯化钠,和1毫米的tcep 。栏运行如上文所述,和馏分检查由sdspage 。 ppat馏分被汇集和集中_10毫克/毫升。该汇集蛋白被分成aliquots和存放在_80 ℃ 。
整个手稿, ppat浓度代表浓度单体除非另有说明。