吩嗪硫酸钾酯算不算过硫酸盐

LD同工酶琼脂糖凝胶电泳

1.原理：

LD同工酶在一定的电泳条件下在支持物上被分离后，以乳酸钠为底物，NAD+作受氢体，LD催化乳酸脱氢生成丙酮酸，同时使NAD+还原成NADH，NADH将氢传递给酚嗪二甲酯硫酸盐（PMS），PMS又将氢传递给氯化碘代硝基四氮唑盐（INT），使其还原成紫红色甲臜化合物。当有LD活性的区带存在即显紫红色，颜色深浅与酶活性成正比，用光密度扫描仪扫描区带定量。

蛋白质电泳

1.原理

蛋白质分子在溶液中由于其末端氨基、末端羧基及侧链的游离基团而成为带电颗粒，并可在电场内移动，其移动方向取决于蛋白质分子所带静电荷。不同蛋白质分子根据其氨基酸组成及所在溶液的pH值，携带的静电荷不尽相同，致使它们在电场中的迁移率各异，从而达到分理的目的。

现在普遍采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），包括非变性电泳(native PAGE)和SDS-PAGE两种，前者主要是在分离蛋白复合物时经常用到。后者是在凝胶与缓冲系统中加入阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS），蛋白质分子被大量SDS阴离子包裹，消除了它们间原来携带的电荷差别，因而其迁移率仅反映蛋白质分子大小，故广泛用于蛋白质分子量的测定。

材料表面在SBF中形成磷灰石的能力能够反应材料在体内的生物活性，具体检测方法如下：1.SBF配置由于SBF溶液对于磷灰石过饱和，所以配备方法不恰当会导致溶液中磷灰石沉淀产生。整个配备过程需要确保溶液无色、透明，容器表面无沉淀出现，如果过程中产生沉淀，倒去溶液，洗净仪器重新配制。准备一个1000ml的塑料烧杯。首先于塑料烧杯中装好700ml离子交换蒸馏水、一个适当大小磁子，杯口密封以蒸发皿或塑料薄膜。搅拌并调节水温至36.5±1.5C。按表1所列顺序在36.5C恒温下逐个溶解第一到第八个化合物，溶解过程表1配置1000mlSBF溶液时试剂添加顺序、添加量OrderReagentsAmountsContainersPurities（%）Formulaweights1NaCl8.035Weightpaper99.558.44302NaHCO30.355Weightpaper99.584.00683KCl0.225Weightbottle99.574.55154K2HPO4·3H2O0.231Weightbottle99.0228.22205MgCl2·6H2O0.311Weightbottle98.0203.303461.0M-HCl39mlGraduatedcylinder——7CaCl20.292Weightbottle95.0110.98488Na2SO40.072Weightbottle99.0142.04289Tris6.118Weightpaper99.0121.1356101.0M-HCl0-5mlSyringe——2.磷灰石形成能力测试对于密质薄片材料，测出样品尺寸并计算样品表面积精确到2mm应用如下公式计算出SBF用量：Vs=Sa/10,Vs（ml）是SBF的体积量，Sa（mm）表示样品的表面积。对于多孔材料，SBF的用量应大于上式计算量准备好塑料瓶或烧杯，装入计算出的SBF体积量加热到36.5C，然后按示意图往里放置样品。笔记：样品在容器中放置有两种情况，如图1(a)，1(b)。少数情况下，SBF溶液会生成同质磷灰石沉积于样品表面。所以如果样品放置是图A1(b)种情况，表征实验应该检测样品的下表面。四个星期内，分别取出恒温浸透不同时长的各组样品，纯水轻盈洗净。然后将样品放入干燥器中常温干燥。图1SBF中样品浸泡示意图1.四唑盐（MTT）比色法：检测细胞存活和生长的方法除前面所介绍的方法外，还可用四唑盐比色法试验（MTT）。此法的原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，而细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶联免疫检测，以在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反应活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。●0.25%胰蛋白酶消化细胞使其成为单细胞，用含0.1%胎牛血清的RPMI培养基配成1x10^9个/L的但细胞悬液，将细胞接种于96孔培养板中，每孔100ul。●将培养板置CO2培养箱中，在37℃、5%CO2条件下，培养3-5天。●培养3-5天后，每孔加入MTT溶液10ul，继续置培养箱孵育3-6h，终止培养，加10%SDS-HCl100ul/孔，37℃培养数小时，将细胞内与细胞周围的MTT颗粒充分溶解。●用酶联免疫检测仪测定每孔吸光度（OD），选波长490nm。以时间为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。用此法测细胞活力，为保证结果的准确性，最好在试验前测定每种细胞的贴比率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，再确定每孔细胞接种数和培养时间，以保证培养终止时不会过满。另外，实验时设空白对照，比色时，以空白孔调零。3.2.2CCK-8法CellCountingKit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazandye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。●制备细胞悬液：细胞计数●接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。●37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。●加入10ulCCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。●培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。●测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

The MTT assay and the MTS assay are colorimetric assays for measuring the activity of enzymes that reduce MTT or close dyes (XTT, MTS, WSTs) to formazan dyes, giving a purple color. A main application allows to assess the viability (cell counting) and the proliferation of cells (cell culture assays). It can also be used to determine cytotoxicity of potential medicinal agents and toxic materials, since those agents would stimulate or inhibit cell viability and growth.

MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, a yellow tetrazole), is reduced to purple formazan in living cells. A solubilization solution (usually either dimethyl sulfoxide, an acidified ethanol solution, or a solution of the detergent sodium dodecyl sulfate in diluted hydrochloric acid) is added to dissolve the insoluble purple formazan product into a colored solution. The absorbance of this colored solution can be quantified by measuring at a certain wavelength (usually between 500 and 600 nm) by a spectrophotometer. The absorption maximum is dependent on the solvent employed.MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium), in the presence of phenazine methosulfate (PMS), produces a formazan product that has an absorbance maximum at 490-500 nm in phosphate-buffered saline.

MTS-PMS法原理和MTT差不多，下面是MTS检测的试剂盒

CellTiter 96® AQueous 非放射性细胞增殖检测（MTS）顶端产品 包装 目录号 价格(元)

CellTiter 96® AQueous Non-Radiotive Cell Proliferatim Assay 1000次检测 G5421

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单独提供

CellTiter 96® AQueous MTS Powder 1g G1111

250mg G1112

描述：CellTiter 96® AQueous 非放射性细胞增殖检测以比色法确定在细胞增殖、细胞毒性或化学灵敏性检测等实验中的活细胞数目。这个系统由一种新型甲臢化合物[3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（金翁），内盐；MTS]和一个电子偶联剂（吩嗪硫酸二甲酯）PMS组成。MTS被细胞生物还原成一种可溶于组织培养基的甲臢化合物（1）。这种甲臢化合物在490nm的吸收值可以直接在96孔板上测量，而不需要另外作处理（2，3）。新陈代谢活跃的活细胞内的脱氢酶类将MTS转化成液态可溶的甲臢化合物。由490nm测量的吸收值所表示的甲臢产物的数量与培养物中活性细胞的数量成正比。

如果你目前正在使用[3H]-胸腺嘧啶掺入检测，使用MTS/PMS混合液可以替代[3H]-胸腺嘧啶检测。只要在通常加入放射性[3H]-胸腺嘧啶的时刻加入MTS/PMS混合物就行。比较使用CellTiter 96® Aqueous的检测和使用[3H]-胸腺嘧啶掺入的细胞增殖生物分析的数据，显示两者的结果相似。这与使用Promega原始的CellTiter 96® 检测（目录号#G4000）所进行的放射性掺入研究符合（4）。

CellTiter 96® MTS粉末是用比色法在细胞增殖，细胞毒性或化学灵敏性检测中确定活性细胞数目的一种新型甲臢化合物。它以粉末形式提供。

特点

● 易于使用：混合MTS和PMS溶液，加入到细胞中，孵育然后读取吸光度值。

● 快速：在96孔板中进行检测，不需洗涤或收获细胞。也不需要溶解步骤。因为MTS甲臢产物可溶解在组织培养基中。

● 非放射性：不需液闪混合液，不需处理放射性废物（不像[3H]-胸腺嘧啶）。

● 灵活：平板被读数后还可以放回温箱继续颜色反应（不像MTT）。

● 安全：不需要挥发性有机溶剂来溶解甲臢化合物（不像MTT）。

应用

● 细胞增殖

● 化学灵敏性

● 细胞贴附确定

● 细胞毒性

● 趋化性

● 凋亡结果

用碱洗或用氨水处理。

硫酸二甲酯，是一种有机化合物，结构式为(CH3O)2SO2。为无色或微黄色，略有葱头气味的油状易燃性液体。

低温时微溶于水，常温时易溶于水，易溶于乙醚、乙醇、氯仿等有机溶剂。冷水中缓慢分解，随着温度上升而加速，50℃时形成未分解的硫酸二甲酯雾，极易水解成硫酸和甲醇，188℃完全分解。属于高毒类。

具有强烈的刺激和腐蚀性，并有迟发性生物效应。遇热、明火或氧化剂可燃。常作为甲基化试剂使用，硫酸二甲酯是可使DNA甲基化的试剂。经甲基化后，DNA可在甲基化位置被降解。

将无水甲醇加入冷至-10℃的氯磺酸或发烟硫酸中，在减压下经蒸馏而制得。

在农药制造业、有机化工原料制造业、染料制造业、催化剂及助剂制造业、塑料制造业、日用化学产品制造业、医药工业等有广泛用途。

研究简史：

第一次世界大战时，德、法帝国主义曾先后用硫酸二甲酯作为为军用毒气，名为“D-stoff”或“Rationite”（法国用作扰乱剂）；后来由于其毒性太大，对自己人也会造成损伤，从第二次世界大战后各国早就不使用了。

1915年，英国科学家霍沃斯（Ha-Worth,Walter Norman）发现了用硫酸二甲酯和碱来制备糖类甲基醚的新方法。

中国自20世纪60年代初投入较具规模的工业化生产。

2012年12月19日，欧盟ECHA将硫酸二甲酯列入第8批高关注度物质（SVHC）。

2015年9月2日，中国印发《危险化学品目录（2015 版）》，规定硫酸二甲酯为危险化学品，受管制。

以上资料参考：百度百科-硫酸二甲酯

一、量气法

在封闭的反应系统中如有气体变化，通过测量变化后的气体体积或压力很容易计算出气体变化量，这是量气法的基本原理。曾在检验科广泛应用的Van-slyke测二氧化碳结合力的方法就是量气法的一个典型例子。Warburg进一步加以发展，设计出专用于测定酶活性的华勃呼吸仪。这种仪器特别适用于测定那些在反应中产生或消耗气体的酶，例如氧化酶反应涉及到O2的消耗，脱羧酶会产生CO2。但也不仅限于这些酶，科学家采用与CO2气体保持平衡过的重碳酸盐体系，可用来测定各种产生H+的酶反应，如各种还原酶，可使NADH变为NAD和H+，而H+会促使反应体系中重碳酸盐变为CO2气体。

二、比色法与分光光度法

在20世纪上半个世纪华勃仪得到研究实验室广泛的应用，并在酶学上得到丰硕的成果。但此法操作烦琐，技术要求高而且灵敏度低。临床常规中很少使用。多使用简单易行的比色法测酶活性。在上半个世纪建立了一些适用于常规工作的测酶活性浓度的方法，如测定淀粉酶的Somogyi法，碱性磷酸酶的Bodansky法、King法等等。这些方法都是在酶和底物作用一段时间后停止酶反应，加入各种化学试剂与产物或基质反应呈色，用比色计在可见光处比色，同时将被测物质作标准管或标准曲线，比较后计算出在此段时间内产物生成量或底物消耗量，从而求得反应速率v。

比色法从50年代起逐步被分光光度法所取代。这是因为分光光度法有以下几个显著优点：一是测定范围不只局限在可见光，还可扩展到紫外和红外部分。这就为扩大测定酶范围提供了可能性。二是提供了寻找一类不需停止酶反应就可直接测定产物生成量或底物消耗量方法的可能性。例某一酶催化下列反应A－＞B＋C，A、B、C三种物质用分光光度法的吸收光谱如图17-1所示。

图17-1 A、B、C三种物质的吸收曲线

可以看到C在560nm处有一吸收峰，而A和B在此处无吸光度变化因此无需停止酶反应，只要在560nm处测定吸光度变化就很容易计算出C的变化速度，而且C物质比A、B二物质有更高的吸收峰，即灵敏度最高。

这类方法中最成功的是Warburg在50年代利用NAD（P）H和NAD（P）吸收光谱差异建立的测酶活性浓度方法。NAD（P）H在340nm处有一吸收峰，而NAD（P）在此波段却毫无吸光性。因此建立了一类和原来比色法截然不同方法。不需停止酶反应，在340nm根据吸光度变化，就可观察到酶反应变化全过程。

第三个优点是不需要如比色法那样，作标准管或标准曲线，因为分光光度计使用近似单色光的光源，在此条件下，某一特定物质的吸光度为常数，即人们所熟悉的摩尔吸光度（molar absorbance）。根据此值从吸光度△A/△T不难计算出酶催化反应速度v。

分光光度计的这些简便、准确等特点使它在近年来已逐步取代比色法而成为目前最流行的方法。其缺点是需要精确带恒温装置的分光光度计，在经济不发达地区尚难推广。

分光光度法的技术多样化。设计得当可用于各种酶的测定。表17-2是一些可用于分光光度法的氧化还原物质特性。

除了前述的NAD(P)H系统可用于脱氢酶测定外，可利用黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）来测定各种含这二个辅基的酶。它们的氧化型在450nm有一很强吸收峰，而还原型的吸光度很低，同样细胞色素还原型在可见光有一个非常明显和很窄的吸收峰，都使人们很容易用分光光度法研究这些酶的作用。上述物质主要用于氧化还原酶的测定。

科学家还设计出一系列人工合成酶的底物，用于其它酶的分光光度法测定。例如合成了很多对硝基酚的衍生物，用于各种水解酶的测定。碱性磷酸酶底物磷酸对硝基酚就是一个成功例子。又如测芳香基硫酸酯酶，可使用人工合成的硫酸对硝基酚为底物，其分解产物的吸收峰由原来的278nm变为318nm，Webb成功地在330nm进行此酶监测

表17-2 一些氧化还原物质的特性

物质 波长（nm） 克分子吸光度

还原型 氧化型

NAD，NADP 340 6300 0

FMN 450 12200

FAD 450 11300

细胞色素C 550 29500 8300

亚甲蓝（等消光点） 610 0 41000

二氢酚吲哚酚 600 0 21000

吩嗪甲酯硫酸 388 1500 22000

抗坏血酸 265 15100

连二亚硫酸盐 314 8000 0

氰化铁（亚铁） 420 0 1020

分光光度法的上述原理还可以用于其它酶的测定，如烯醇化酶、延胡索酸水解酶的底物由于含不饱和键，在330nm处有很强吸收峰，而酶作用产物无此不饱和键。则不难在330nm处对这些酶进行直接测定。

此后在分光光度法的发展过程中又导入了酶偶联技术。使得分光光度法几乎能测定所有的酶。因此临床实验室工作者如不能很好掌握分光光度法的技术，不了解各种影响因素，要作好酶的测定是很困难的。

三、荧光法和同位素法

分光光度法有一个缺点，即灵敏度较低。有些标本中酶浓度很低时往往测不出来。此时可考虑改用荧光法，可将测定灵敏度提高2-3个数量级。如科学家合成了一系列甲基伞形酮的衍生物，可取代对硝基酚衍生物做为一些水解酶的底物，由于水解产物甲基伞形酮有强烈荧光，大大提高测定的灵敏度，就是分光光度法中最常用的NAD(P)H反应系统，也可改用荧光法，在340nm紫外线激发下NAD(P)H产生强烈的蓝色荧光，而NAD(P)不被激发。此外，还可使用在荧光法基础上发展起来的时间分辨荧光法，例如北京医院就曾利用此种灵敏度极高方法测定很难用其它方法检测的脑脊液中微量的烯醇化酶。荧光法不易掌握，对所用的试剂、容器和仪器都要求很高，否则易产生非特异荧光干扰测定，或者引起荧光的淬灭使测定不准，故此种方法多用于研究实验室，少用于常规实验室。为提高灵敏度，还可使用同位素标记的底物进行酶测定，例如，有人以C12标记的乙酰胆碱为底物测定胆碱酯酶，在酶作用后以离子交换法分离出含C14的乙酸。同位素方法由于对人体有害，操作麻烦，目前已很少使用。

四、其它方法

离子选择电极法，旋光法等有时用于测定特定的酶，当酶反应牵涉到有酸碱变化时，很容易用pH仪直接观察酶反应过程中H+的变化。直接用pH仪测酶反应有两个缺点：一是随pH变化，会偏离酶作用的最适pH值，不可避免地引起酶反应速度变慢。其二是如测定的标本不是纯酶时标本中其他蛋白及其它有缓衡能力的物质将会影响所测pH变化的程度。此时如改用电位滴定仪则更为适合。此仪器可在酶反应过程中不断向反应体系中加入酸或碱以维持反应体系pH的恒定，而加入的酸碱量只与体系中H+变化量相关，和反应体系中缓衡能力无关。

同样如酶反应中有O2变化，可使用氧电极来监测酶反应过程，这可用来测定葡萄糖氧化酶活性，Chappell还成功地将此技术用于测线粒体的氧化能力。还曾有人尝试用二氧化碳和氨电极测酶，由于这些电极反应时间较慢，不利于检测酶反应速度。有些酶的反应物为光学异构体，则可根据旋光度变化来追踪酶反应。某些反应物如羟基酸本身虽无旋光性，但与钼结合后产生很高的旋光性。根据此特性建立了测定延胡索酸水合酶的方法。还有个别酶的测定使用了极谱法、高效液相色谱法等。总之，实验室工作者完全可以根据实验室现有仪器和技术，创造性地建立一些新的测活性浓度的方法。

富马酸一钠

分子式：

C4H3NaO4

分子量：

138.06

产品性状：

白色晶体粉末，有特殊酸味，溶于水。

适用范围：作为酸味剂、调味剂和抗氧化助剂，用于配制酒、清凉饮料、糖食制品、水果罐头、果冻等。

含量(干基计) % ≥98.0-102.0

干燥失重 % ≤0.5

硫酸盐(以SO42-计) % ≤0.01

砷(以As计) % ≤0.0002

重金属(以Pb计) % ≤0.001

琥珀酸脱氢酶能通过一系列人工电子受体，如与PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐），DCPIP（2，6-二氯酚靛酚）等发生反应催化琥珀酸的氧化，而借助这些中间产物的颜色变化，通过分光光度计检测即可加以定量反映，其反应式为：①Succinate+PMS→Fumarate+PMSH2；②PMSH2+DCPIP→PMS+DCPIPH2。DCPIP呈蓝色，标准的吸收光谱在600nm处，这种色泽可因其还原而渐次变淡，从而600nm处的光密度的变化与DCPIP含量成正比，测定2.6-DPIP的还原速度可以推算出SDH的活力。一分子DCPIP被还原，即代表一分子琥珀酸被氧化。故可测定此反应系统在600nm处的吸收光度变化，来计算SDH的活性。SDH活性计算：（标准－测定）/标准=μmol/min/mg。

铁氰化钾[K3Fe（CN）6]还原法

以铁氰化钾[K3Fe（CN）6]和琥珀酸钠为底物，使琥珀酸脱氢酶催化反应将铁氰化钾还原为亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6]，K4Fe（CN）6再与Fe3+作用生成普鲁士蓝，在700nm波长测定吸光值，以检测普鲁士蓝之生成量，作为琥珀酸脱氢酶的还原力，吸光值愈高表示琥珀酸脱氢酶活力愈强。