三氯乙酸的作用及原理

三氯乙酸10％－15％这种浓度就可以了，不要太高了。对不起TCA法没有用过。你是不是先13000rpm 15min把可能的DNA污染离心下来。再看看你的蛋白是否还粘稠。我觉得不太可能。

土壤中产蛋白酶的微生物，在生长过程中会向细胞外分泌蛋白酶，加入三氯乙酸后，这些细胞外的蛋白酶变性沉淀出絮状物，据此判断该微生物可能是产蛋白酶的。

比如你在液体培养基里养了某菌，然后离心把菌沉淀出来，如果培养基里有足够浓度的细菌分泌出来的蛋白酶，加入10%左右的三氯乙酸后就可以看见絮状沉淀。不过这些沉淀也不一定是蛋白酶，可能只是一般的蛋白质。

呵呵，也许有别的作用，暂时想到这样子。

包括色泽、气味、细度。豆粕经过发酵、干燥后颜色变深，优质的发酵豆粕皆为棕黄色或浅黄褐色。如果颜色浅而与豆粕一致，有可能发酵程度不够或掺入其他浅色蛋白原料如果颜色过深(如深褐色)，则表明干燥过度，发生美拉德反应。发酵豆粕的气味根据菌种和生产工艺的不同，也略有差异，但均应无豆腥味和霉味。一般为酸香味(较浓郁)，酸味较浓的产品是以乳酸菌发酵为主，该类产品损耗低、成本低、有机酸含量较高、诱食效果较好，可部分降解抗营养因子、粗蛋白一般可提高4-5%、消化吸收率较高。发酵豆粕的粉碎粒度不宜过细。粒度越细，产品中的活性成分损失就越多、眼观越不易判断是否产假。

2.2常规理化分析

常规理化指标(蛋白含量、水分、灰分、酸度等)在大多数饲料厂的实验室里都可以完成，根据这几个指标和感官指标，可以初步判定发酵豆粕质量的优劣和稳定性。蛋白含量一般都能够达到标准，建议各厂家检测发酵豆粕中真蛋白质的含量，简单判断是否产假。以去皮豆粕为原料生产发酵豆粕的真蛋白一般在44%～49%之间，但这也跟发酵产品中游离氨基酸的含量有关，游离氨基酸高，真蛋白相应就会低些。厂家一般对发酵豆粕的水分含量不太注重，只要不超出标准就行。其实，不同厂家对制定发酵豆粕的水分含量标准上有很大的不同，可能会给部分用户造成误解。有些厂家灌输“水分低则产品有效物质多”这样的概念，其实不然，比如有两个产品：A水分12%，蛋白50%B水分8%，蛋白50%。假如A将水分降到8%，则蛋白52.27%B将水分升到12%，蛋白47.83%。从这个例子上我们可以看出：水分高并不能代表产品有效物质少，相反，水分低，则需要进一步提高干燥温度或者延长干燥时间，不可避免会对活性物质造成破坏。发酵工艺的不成熟或菌种的选取不当的厂家，一般会以此方法来提高蛋白含量。豆粕通常含有5.5%～6.5%的总灰分。因为在发酵过程中，成品有一定的损耗，所以，发酵豆粕的粗灰分通常会比原料豆粕高一些。一般各厂家发酵豆粕的pH值在5左右，并不是pH越低的产品越好。

2.3酸度

采用滴定法测定，简单快速。发酵豆粕的酸度大于2%，过低则可能发酵程度不足或者发酵控制不当而产氨。

2.4抗营养因子

2.4.1抗原蛋白

大豆抗原蛋白是一种热稳定性抗营养因子，是大豆中对动物(特别是幼龄动物)影响最大的一类物质。按离心时沉降系数和免疫学方法可将大豆蛋白质分为11S球蛋白(大豆球蛋白)和7S球蛋白(β和γ伴球蛋白)，其中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白是免疫原性最强的大豆抗原蛋白，两者共占大豆籽实总蛋白的65%～80% 。根据抗原蛋白特性建立了许多7S球蛋白和11S球蛋白分离及测定的方法，主要有：等电点沉淀法、冷沉淀法、盐析法、按离子强度不同而沉淀的分离法、免疫法。目前发酵豆粕厂家主要是通过SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶电泳的方法，测定蛋白分子量分布大致情况。通过标准分子量图谱比较，可以从一定程度上反映出蛋白类抗营养因子的去除程度。使用ELISA方法和免疫扩散法对抗原蛋白进行定量测定。发酵豆粕的主要目的之一就是降解大豆抗原，但对于饲料厂而言，基本上都检测不了，只能靠厂家提供资料进行判断。就目前市场上发酵豆粕的生产工艺而言，抗原蛋白并不可能完全降解。但是很多厂家宣称其发酵豆粕是“零抗原”或者“无抗原”，标称抗原含量低于1mg/kg，这不符合实际情况。另外，某些发酵豆粕由于干燥温度过高，蛋白质不能提取，上样时蛋白质浓度很低，会出现SDS-PAGE显示蛋白降解很好的假象，此时我们可以通过福林酚法或改良的Lorry法检测水溶性蛋白质的含量，如果水溶性蛋白含量很低，则说明产品有问题。

2.4.2.胰蛋白酶抑制因子

豆粕中的胰蛋白酶抑制因子虽是热敏性因子，但豆粕中胰蛋白酶抑制因子活性仍可达到2000TIU/g左右，优质发酵豆粕可以达到400TIU/g以下。一般可采用NY/T1103.2-2006的方法对胰蛋白酶抑制因子进行定量分析。

2.5 发酵豆粕中小分子蛋白的含量测定

发酵豆粕的另外一个主要目的就是：将豆粕中的大分子蛋白降解成为小分子蛋白，甚至降解成多肽和小肽，从而提高其在动物体内的消化吸收率和机体的免疫力。目前各厂家测定小分子蛋白使用的都是三氯乙酸(TCA-N)法，而部分发酵豆粕厂家利用此法测定的小分子蛋白却声称为“小肽”(小于1000道尔顿)，而且未扣除非蛋白氮(NPN)和游离氨基酸，这是混淆概念的。一般用三氯乙酸(TCA-N)法测定的是发酵豆粕中的分子量小于10000Da的小分子蛋白物质，而非生物学家及动物营养学上真正具有“小肽”意义的肽类物质。分子量段在5000Da～180Da之间的称为“肽”，分子量段5000Da～3000Da 之间的肽称为“大肽”，分子量段在3000Da～1000Da之间的肽称为“多肽”，分子量段在1000Da～180Da之间的称为“小肽”、“寡肽”、“低聚肽”，也称为小分子活性多肽，一般由2～6个氨基酸组成。有些厂家为了提高产品粗蛋白含量、降低成本，在发酵前添加一些非蛋白氮(如尿素、蛋白精)类的物质。如果用此法检测小分子蛋白含量时，一定要注意检测非蛋白氮的含量。

试剂配制

（一）母液

1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g

蒸馏水 200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 PH HCl

7.4 约17ml

7.5 约16m

7.6 约15ml

8.0 约10ml

1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g

异丙醇 100ml

溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。

0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4（MW119.98） 12g

蒸馏水至 500ml

溶解后，高压灭菌，室温保存。

0.2mol/LNa2HPO4 Na2HPO·12H2O（MW 358.14） 71.6g

蒸馏水至 1000ml

溶解后，高压灭菌，室温保存。

10％SDS SDS 10g

蒸馏水至 100ml

50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g

超纯水 1.0ml

溶解后，4℃保存，保存时间为1周。

（可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可）

1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g

超纯水 200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。

0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g

超纯水 200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。

40％Acr/Bic（37.5：1） 丙稀酰胺（Acr） 37.5g

甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g

超纯水至 100ml

溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。

20％Tween20 Tween20 20ml

蒸馏水至 100ml

混匀后4℃保存。

（二）使用液

单去污剂裂解液（PMSF）： 1mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5ml

NaCl 0.438g

TritonX-100 0.5ml

蒸馏水至 50ml

混匀后4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。

（一般实际用的比较多的其实是RIPA裂解配方：50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS。至于其中每个要加多少量那就自己去算吧，因为本人已经算好的配方表无意间弄丢了）

0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4） 0.2 mol/L NaH2PO 19ml

0.2 mol/L NaHPO4 81ml

NaCl 17g

蒸馏水至 2000ml

（如果用TBST进行洗膜的话，其实PBS用得很少，大可不必自己配制，向试剂公司购买20×的PBS浓缩液即可，500ml的浓缩液不到50元，很方便）

G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用） 考马斯亮蓝G250 100mg

95％乙醇 50ml

磷酸 100ml

蒸馏水至 1000ml

配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。

0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44） 0.877g

蒸馏水至 100 ml

高温灭菌后，室温保存。

100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA） BSA 0.1g

0.15 mol/L NaCl 1ml

溶解后-20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，-20℃保存。

10％分离胶和4％浓缩校

10％分离胶（两块胶，10ml） 4％浓缩胶（两块胶，5ml）

超纯水 4.85ml 3.16ml

40％Acr/Bic（37.5：1） 2.5ml 0.5ml

1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 2.5ml －

0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） － 1.26ml

10％SDS 100 μl 50 μl

10%AP（过硫酸胺） 50 μl 25 μl

TEMED 5 μl 5 μl

加TEMED后，立即混匀即可灌胶。

（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2-3倍，根据实验当时的温度适当调整）

还原型5XSDS上样缓冲液 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2.5ml

二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g

SDS 0.5g

溴酚蓝 0.025

甘油 2.5ml

混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。

电泳液缓冲液 Tris（MW121.14） 3.03g

甘氨酸（MW75.07） 18.77g

SDS 1g

蒸馏水至 1000ml

溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。

（电泳液可以回收重复利用，一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鲜的电泳缓冲液）

（可以配制成10×电泳液缓冲液进行保存，稀释10倍使用）

转移缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 2.9g

Tris（MW121.14） 5.8g

SDS 0.37g

甲醇 200ml

蒸馏水至 1000ml

溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。

（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难）

（可以配制成2×转移缓冲液进行保存，稀释后使用）

10X丽春红染液 丽春红S 2g

三氯乙酸 30g

磺基水杨酸 30g

蒸馏水至 100ml

使用时将其稀释10倍。

TBS缓冲液 1 mol/L Tris·HCl（pH7.5） 10ml

NaCl 8.8g

蒸馏水至 1000ml

（可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用）

TBST缓冲液 20％Tween20 1.65ml

TBS 700ml

混匀后即可使用，最好现用现配。

封闭液 脱脂奶粉（国产，光明牌） 5g

TBST 100ml

最好现用现配。

洗脱抗体缓冲液 14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巯基乙醇) 700 μl（通风厨里加）

SDS 2g

0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） 12.5ml

超纯水至 100ml

配制时，在通风厨内进行。4℃保存。可重复使用1次。

（可用可不用）

显影液（5X） 自来水（加热至50℃） 375ml （以下药品加到温水中）

米吐尔 1.55g

亚硫酸钠（无水） 22.5g

碳酸钠（无水） 33.75g

溴化钾 20.95g

补水至 500ml

配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4℃保存。使用时用自来水稀释至1倍。

（不需要自己配制，有钱的直接买柯达的显影液，上千；没钱的到专业的照相器材市场购买即可，很便宜，一包5毛钱左右）

定影液 自来水（50～60℃） 700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）

硫代硫酸钠 240g

亚硫酸钠（无水） 15g

冰乙酸 12.6ml

硼酸 7.5g

钾明矾 15g（水温冷至30℃以下时再加入）

加水定容至1000ml，室温保存。

（不需要自己配制，有钱的直接买柯达的定影液，上千；没钱的到专业的照相器材市场购买即可，很便宜，一包5毛钱左右）

抗体 用TBST稀释至一定浓度使用，建议使用杂交袋（小商品市场购买，很便宜，可以多

买一点，但是务必注意质量，千万不能漏，不然抗体就浪费了，在使用之前先检查一下杂交袋的完整性）。

化学发光试剂 分A和B两种试剂，有钱可以购买Amersham、Pierce或者Santa Cruz的，没钱的话碧云天的ECL也能凑合。

操作步骤

（一） 蛋白样品制备

（1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：

1、 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

2、 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

3、 按1ml裂解液加10 μ PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）

4、 每瓶细胞加400 μ含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5、 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）

6、 于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）

7、 将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于-20℃保存。

（个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100-200μ的裂解液，按照上述操作，直接用200μ裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强）

（2） 组织中总蛋白的提取：

1、 将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

2、 加400 μ单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。

3、 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。

4、 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。

（3） 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：

由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：

1、 将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。

2、 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。

3、 用枪洗干上清后，加100 μ裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。

4、 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。

（二） 蛋白含量的测定

（1） 制作标准曲线

1、 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。

2、 取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。

3、 按下表在各管中加入各种试剂。

0μg

2.5μg

5.0μg

10.0μ

20.0μg

40.0μ

1mg/ml BSA

－

2.5μl

5.0μl

10.0μ

20.0μl

40.0μ

0.15mol/L NaCl

100μl

97.5μ

95.0μ

90.0μ

80.0μl

60.0μ

G250考马斯亮蓝溶液

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

4、 混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计上比色分析。

（2） 检测样品蛋白含量

1、 取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。

2、 取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 μl，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。

3、 弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。

4、 取一管考马斯亮蓝加95 μl 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5μ待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。

注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 μl样品含的蛋白量。

（上述方法只是一家之言，可以自我变通，本人就不是按照上述方法进行的）

（三） SDS－PAGE电泳

（1） 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

（2） 灌胶与上样

1、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边，五分钟后重复一次，这样可以保证基本不漏胶）

2、 按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。）

3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

4、 按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩

减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶（其实说经常有点过了，补1-2次就行了，不补胶问题也不大）。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

5、 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（冲洗的话个人感觉可以使用5ml的针筒，当然操作不能太粗暴了）

6、 测完蛋白含量后，计算含20-50μ蛋白（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）的溶液体积即为上样量。取出上样样品至200μl的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度可加20μ样品）（其实大一点的垂直电泳槽每孔最大上样量可以达到40μl，胶做得很好的话50μ也是问题不大的）上样前要将样品于沸水中煮5-10min使蛋白变性。（本人心得：可以使用PCR仪进行变性，加快速度，这样就不用将水煮沸了，同时在水中煮蛋白样品有下面弊端：1.EP管容易炸开，样品丢失、2.容易进水，使样品体积增加，超过电泳最大上样量）

7、 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染）

（3） 电泳：电泳时间一般4～5 h，电压为40V较好，也可用60V。（本人为了加快速度，浓缩胶时用80-100V跑，到分离胶以后用150-200跑，结果也不错，总时间2h左右）电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（如果目的条带比较大的话，最好使用可视的蛋白marker，Fermentas的0441和0671比较好，就是有点贵。一般要让目的条带跑过分离胶的1/3比较好，不要局限于此说明）。

（四） 转膜

（1） 转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水）（个人感觉其实转膜之前浸湿一下就ok了，没有多大问题，可能按照上述操作结果会更好）

（2） 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。

（3） 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上，注：个人感觉就垫1张滤纸也没问题呀），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

（4） 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬（应该边撬边用流水缓缓冲洗）。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上

另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通）（最后做成的“三明治”千万不能形成短路，不然有可能会短路烧坏转膜装置（价格不菲，尤其是进口的），第一次做的应请老手指教）

（5） 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60V转移2 h或40V转移3 h。（1.实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时最好垫两块硝纤膜，以免转膜过头，因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了，第二张膜上还有蛋白质可以进行检测；对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点，一般80-100V，时间也要延长一点，开始最好也用两块膜，特别是务必注意加强降温措施。当然转膜是要摸条件的，最好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。如果由于时间原因来不及做下面实验，可以在4度下12V转膜过夜）（2.硝纤膜建议使用0.22μ的小孔径膜，不容易转膜过头）（3.不同的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换用转膜装置，最好再摸个条件）（4.转膜时电极方向注意是膜正胶负）

（6） 转完后将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。 将膜晾干备用。（一般不需要做这步）

（五） 免疫反应（个人建议：还是使用杂交袋进行一抗和二抗的孵育，节约抗体）

（1） 将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。

（2） 将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。

（3） 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。

（六） 化学发光，显影，定影

（1） 将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。

（2） 在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。（如果使用柯达的显影定影液，时间很快的，显影结束后最好先用事先准备好的自来水洗一下片子，然后再放到定影液中进

行定影，这样可以延长定影液使用时间，从而节约定影液）

应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。

（七） 凝胶图象分析：将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

常用的去除多糖中蛋白质的方法有：Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法，这些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀，其中Sevag方法脱蛋白效果较好，它是用氯仿：戊醇或丁醇，以4：1比例混合，加到样品中振摇，使样品中的蛋白质变性成不溶状态，用离心法除去。

(1)Sevage 法：利用蛋白质在三氯乙烷等有机溶剂中变性的特点，将提取液与 Sevage试剂[氯仿：正丁醇=5：1（V/V）]5：1 混合，振荡，离心，变性后的蛋白质介于提取液与 Sevage 试剂交界处。此法的优点是条件温和，不会引起多糖的变性。

(2)三氯醋酸法。于样品液中加入适量的三氯醋酸，混匀后静置过夜，离心过滤弃去滤渣，收集滤液，测定糖浓度和蛋白质浓度"。

实验一多酚氧化酶（PPO）的分离提取

一、原理与目的

多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，是组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以伤口醌类物质出现是植物防止伤口感染的愈伤反应，因而受伤组织一般这种酶的活性就会提高。多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。

PPO的存在是水果、蔬菜褐变及营养丧失的主要原因之一。PPO氧化内源的酚类物质生成邻醌，邻醌再相互聚合成醌或蛋白质、氨基酸等作用生成高分子络合物而导致褐色素的生成，色素分子量愈高，颜色愈暗。多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。

本实验将采用马铃薯为主要材料，通过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。

通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。

二、材料与试剂

（1）马铃薯（大约每小组100-200g）

（2）试剂：

0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配×10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005MgCL2）配置时配

（3）实验器械与仪器设备：

试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；

过滤纱布；植物组织匀浆器；pH计和pH试纸；GL-20C高速冷冻离心机；

DL-7A大容量低速冷冻离心机

三、操作步骤

1：粗酶提取：

水果肉组织按1：1（W/V）比例与003M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆4层后纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。

2：盐析分级沉淀：

在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液在加入固体硫酸铵达到70%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清夜，收集粗酶沉淀。

四、实验结果

获得PPO粗酶液。

实验二 PPO粗酶液的纯化

一、原理

1.葡聚糖凝胶Sephadex G-200凝胶柱层析利用大分子不能进入凝胶颗粒内部最先流出柱外，而小分子物质进入凝胶颗粒内部，流速慢而最后流出柱外，凝胶层析法能将不同分子大小的物质分离开。（G-200能分离800-80000D分子量的蛋白质）

2.利用离子交换法，选取DEAE-阴离子纤维素DE52柱材料，因为PPO是带有阳离子的蛋白质，在层析时会吸附在柱材料上，而杂蛋白会洗下。后用NaCl梯度洗脱PPO，（NaCl为强离子交换剂，能将弱吸附在柱材料上的PPO置换下来）。粗酶液从而得到纯化。

二、材料与试剂

试剂：0.02M Tris-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001M EDTA)配制时配×10倍浓缩液1000mlNaCL聚已二醇；DEAE-纤维素DE52；葡聚糖凝胶Sephadex G-200兰葡萄糖－40、70、100等；

实验器械与仪器设备：试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等；试剂瓶、层析柱、pH计和pH试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C高速冷冻离心机、DL-7A大容量低速冷冻离心机

三、操作步骤

1．葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡

（1）柱材处理

称取一定量的Sephadex G-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。

（2）装柱

将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm处，停止装柱，剪一与柱内径相等的滤纸片覆盖于凝胶上。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。

（3）平衡

在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中，用0.002M Tris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001M EDTA)，平衡Sephadex G-200凝胶。

2．上样：将粗酶液上柱。

3．洗脱：用0.02M Tris-HCL缓冲液Ph7.4（内含0.001M EDTA）洗脱，收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。

4．DEAE－纤维素的处理及装柱

（1）处理

本实验采用的是DEAE－纤维素DE 52 是弱酸型阴离子交换剂，具体处理方法为：先将DE52阴离子交换剂干粉浸泡于蒸馏水中，去除杂质；再在0.5N的HCL溶液中浸泡1－2h,再用无离子水或蒸馏水洗至pH值中性或PH4以上，并将其在抽滤漏斗中抽干；将抽干的离子交换剂浸泡在0.5N的NaOH溶液中1－2h，再用无离子水或蒸馏水将其洗至中性。

（2）装柱

将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的柱材，轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降再层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5－2cm处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。

（3）平衡

在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中，用0.002M Tris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001M EDTA)，预先将DE-52柱进行平衡。

5．上样：

将洗脱酶液上样，用0.02M Tris-HCL缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）洗脱杂蛋白。

6．洗脱：

用含NaCL(0.2-0.6M)的0.02M Tris-HCL缓冲液pH7.4(内含0.001M EDTA)进行梯度洗脱。

7．测定酶活性和蛋白质浓度

实验三 PPO活性测定

一、原理与方法

PPO催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。

其方法是：在含有4mlPH5.8的0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入0.05ml0.05M邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预热后加入0.05ml酶液，反应5分钟，在分光光度计410nm处读取吸光值。在上述条件下，以A410读数，以每分钟增加0.01O.D.值定义为一个酶活性单位（U）。

二、仪器与试剂

（1）样品：

多酚氧化酶粗酶液

硫酸铵沉淀组分

DE-52洗脱组分

葡聚糖凝胶洗脱组分

（2）底物：

邻苯二酚：O.01M邻苯二酚溶液

（3）反应体系：

0.2M邻酸二氢钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8

（4）器皿与仪器：

试管、恒温水浴等

分光光度计

三、酶蛋白的比活性

比活性＝酶活单位（U）/mg蛋白质

四、实验结果与分析

1. Sephadex G-200的洗脱组分的相对浓度（OD590）和相对酶活（OD410）

结果列表

试管号 蛋白质浓度 PPO酶活 试管号 蛋白质浓度 PPO酶活

空白 0 0 3 0.16 0.09

粗酶液 0.20 0.14 4 0.03 0.03

1 0.00 0.01 5 0.03 0.01

2 0.13 0.09 6 0.02 0.02

分析:2和3试管中含绝大部分所需蛋白,保存进行下一步纯化。

2. DE-52的洗脱组分的相对浓度（OD590）和相对酶活（OD410）

结果列表

试管号 蛋白质浓度 PPO酶活 试管号 蛋白质浓度 PPO酶活

空白 0 0 3 0.03 0.05

粗酶液 0.22 0.16 4 0.09 0.05

1 0.00 0.00 5 0.07 0.02

2 0.03 0.02 6 0.03 0.00

分析:酶活性高低不一定与蛋白含量高低成正比,3和4试管中含较多所需蛋白。

实验四胰酶分离提取

一、原理与目的

提取制备酶的经典方法，多采用硫酸铵分级沉淀，胰酶在75%饱和度硫酸铵中沉淀，其它杂蛋白一般在10%硫酸铵饱和度下被沉淀而除去。经此多次提取，最后在PH8.0硼酸缓冲液中得到结晶。

胰酶在PH3.0时最稳定，可在低温下储存较长的时间而不失活；低与此PH酶易变性；高于PH5时，酶易自溶而失活。因此提取制备胰酶的全部操作过程应在低温和低PH下进行。胰酶以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。胰蛋白酶原在正常生理条件下可被肠激酶和钙离子所激活或自我环化成为有活性的酶。猪胰蛋白酶原分子量约24000－25000，而猪胰酶分子量为23400。在酶原活化的过程中，酶原N端Lys与Ile之间的一个肽链被断裂，丢失一个6肽，分子构象发生改变，PI变成10.8。

本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备实验样品。

二、材料与试剂

1．仪器

紫外光分光光度计、恒温水浴、离心机、组织捣碎机、PH计、显微镜、秒表、剪刀、镊子、搪瓷盆、乳钵、大玻璃漏斗、抽滤瓶，塑料小桶、纱布、PH试纸，滤纸、玻璃器皿等。

2．材料：新鲜猪胰脏

3．试剂及溶液配制

pH2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M.NaOH溶液、5M NaOH溶液、01M HCL溶液、0.025M HCL溶液、0.01M HCL溶液、0.4M pH9.0硼酸缓冲液（母液为0.8M，用时稀释一倍）、Tris、硫酸铵。

0.8M pH9.0硼酸缓冲液：取20ml0.8M四硼酸钠溶液，混合后用PH计校正。

三、操作步骤

1．胰蛋白酶原的提取与分离：

（1）称取1－1.5Kg新鲜猪胰脏，在冰浴下剥除脂肪和结缔组织，在低温下用绞肉机绞碎胰脏（或用高速组织匀浆机捣碎）加1－2倍体积以预冷却的PH2.5-3.0乙酸酸化水溶液提取（按1g组织相当于1ml体积计算，以此类推）。检查提取液中PH，若高于PH3.0时应及时用10％乙酸调节，使提取液维持PH2.5－3.0之间。在冷室5℃左右搅拌提取18－24h，而后用4层纱布过滤，尽量拧挤出滤液，滤液呈乳白色，用约300mlpH2.5乙酸酸化水再提取残渣一次（时间约为1－2h），合并滤液，此时滤液PH值较高，可用5M H2PO4溶液调整PH至2.5－3.0，放置 3－5h后，浑浊滤液冷却后，用玻璃漏斗进行自然过滤，滤液呈黄色透明液体，收集滤液，量其总体积，弃去沉淀物。

(2)盐析：滤液加固体粉状硫酸铵进行盐析，使溶液至75％饱和度。盐析溶液放冷室中过夜，次日用4000r/min离心机离心，或用布氏漏斗抽滤，滤饼经压干后称重，可得约20g胰蛋白酶原粗制品。

（3）胰蛋白酶原得激活：将胰蛋白酶原粗制品用10倍体积得冷蒸馏水，分多次加入使滤饼溶解，溶液呈乳白色，量其体积，取出1ml溶液用于测定，溶液中硫酸铵得含量（约为滤饼重得1/4）。因为硫酸铵可以与活化剂钙离子结合，生成硫酸钙，如果钙离子过少会直接影响胰酶原的激活过程，按浓度量计算，将已研细的固体CaCL2慢慢加入酶原溶液中，边加边搅拌均匀。用5MNaOH溶液调PH至8.0。在酶溶液加入约5mg结晶猪胰蛋白酶，轻轻搅拌均匀，置5℃冰箱中使酶原活化。

（4）纯化：去除杂蛋白，量取胰蛋白酶溶液体积后，用5M硫酸溶液调节滤液PH至2.5－3.0，抽滤除去硫酸钙沉淀，滤液体积约1000ml，加入已经研细的硫酸铵粉末，使其溶液达40％饱和度（每升滤液加242g硫酸铵）。放置5℃冰箱中5－8h,抽滤除去沉淀。

实验五卵清蛋白分离提取

一、实验目的与原理

鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子酶的分子比为1:1。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中较不稳定。

由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白做亲和配基配制纯化胰酶的亲和材料。

二、材料与试剂：

1．材料：新鲜鸡蛋2只

2：仪器：抽滤瓶500－1000ml、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器

3：试剂：

10％TCA，用固体NaOH调调PH至1.05－1.10，需要50ml、5N HCL、5N NaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M，PH8.0Tris-HCL缓冲液（每ml含0.34BAEE和2.22mgCaCL2），50ml

pH8.0,0.1M Tris-HCL缓冲液

三、操作步骤

1，取两只新鲜鸡蛋，得蛋清50ml，置于烧杯中，外用温水浴25℃－30℃，在不断搅拌条件下，缓慢加入等体积得三氯乙酸－丙酮（1:2V/V），立即出现大量白色絮状沉淀，加完后最终PH约3.5，再继续搅拌30min，然后在4℃冰箱中放置过夜。

2,次日用布氏漏斗抽滤，得黄绿色清液。

3，边搅拌边加入4℃预冷的丙酮200ml沉淀蛋白，在4℃放置2h之后将上清液小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于4000rpm离心5min，收集沉淀。

4，将沉淀溶于10ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4h，换水两次，再对碳酸钠缓冲液透析过夜，4000rpm离心10min ,去除不溶物。

实验六亲和层析纯化胰酶

一、实验目的与原理

生物大分子化合物的重要特征之一是具有与某些相对应的分子通过次级键或共价键专一结合的能力即亲和力。例如酶与抑制剂之间，抗原与抗体之间，结合的双方不仅是专一的，而且结合以后可以在不丧失生物活性的基础上用物理或化学的方法进行解离。根据这一特性，如果把具有亲和力的一对分子的某一方连接于水不溶的固体载体上作为固定相，那么另一方随着流动相流经该固定相的时候，双方便亲和结合为一个整体。然后只有改变某种物理条件或化学条件使结合的双方解离，即能得到于固定相有特异亲和力的某一特定物质。这种利用生物分子和相对应分子之间亲和结合和解离性质而建立起来的层析方法称之为亲和层析。

本实验通过将胰蛋白酶抑制剂－鸡卵粘蛋白与Sephadex-G75偶联及亲和层析纯化胰酶的操作，以了解亲和层析的基本原理，掌握亲和柱材活化偶联及亲和层析操作的基本过程和技术。

二、仪器与试剂

1.鸡卵粘蛋白制备

2．Sephadex-G75的活化和偶联

2．5g干重的葡聚糖凝胶Sephadex-G75 、0.05M NaCL溶液 50ml、纯化的鸡卵粘蛋白87.5mg、 5% K2CO3、0.27gKBH4 （溶于20ml水）

3．亲和层析

0.1M Tris-HCL pH7.5(含0.5M KCL,0.05M CaCL2) 200ml、粗胰蛋白酶约50ml 、0.1N甲酸钾、0.5M KCL pH2.5 100ml

仪器器材：抽滤瓶500－1000ml、层析柱、紫外分光光度计、紫外蛋白检测仪、烧杯漏斗、移液管、磁力搅拌器

三、操作步骤

1、鸡卵粘蛋白的制备

2、Sephadex-G75的活化及偶联

2.5g干重的葡聚糖凝胶Sephadex-G75溶胀洗涤数次，缓慢搅拌，加入0.05M NaCL溶液50ml ,30min，蒸馏水洗涤数次，抽干备用，活化凝胶，纯化的鸡卵粘蛋白87.5mg 溶于35ml水，加入活化葡聚糖凝胶，75％K2CO3，调pH7.5-9.0,缓慢搅拌3h。反应过程随时加入5％K2CO3,以维持pH的稳定。0.27gKBH4 溶于20ml水，缓慢搅拌加入上述体系反应5h，pH维持在6.5-7.5，洗涤。

3、胰蛋白酶的亲和层析

卵类粘蛋白在pH7－8的条件下能与胰蛋白酶专一地结合，而在pH2－3时又能解离，因而掌握好上柱地PH条件和洗脱缓冲条件，便可将胰蛋白酶从含杂蛋白地粗酶液中选择性地结合于柱上，待洗去不结合或非专一性结合地杂蛋白后，改变PH值便可将胰蛋白酶洗脱下来。从而达到纯化地目的。由于亲和层析结合地专一性，上柱体积可以比较大，得到浓缩的提纯产品。

(1)亲和层析

将鸡卵粘蛋白－Sephadex-G75装柱（1×10cm）,用pH7.5,0.1M含 0.5M KCL,0.05M CaCL2的缓冲液平衡，平衡约2－3倍的柱体积。将粗胰酶液上柱层析。用紫外蛋白监测仪280nm处检测蛋白质吸收峰，随着上柱和流出的杂蛋白量的平衡，吸收峰达到稳定，一旦上柱的胰蛋白酶量超过柱的负荷时，则胰蛋白酶溢出，使吸收峰升高，此时应停止样品上样，改用pH7.5的平衡缓冲液冲洗出杂蛋白，待洗出液的吸收回到基线后，改用0.1N的甲酸钾0.5M KCL,Ph2.5的洗脱液解析，柱的流速维持在1.5ml/min左右，收集洗脱下来的蛋白峰蛋白，测总蛋白量及比活性，并根据上柱样品的总蛋白量和比活性计算经亲和层析后胰蛋白酶比活性提高的倍数，总蛋白回收率，胰蛋白酶量。

当胰蛋白酶峰洗出，待紫外吸收回到基线后，重新用缓冲液平衡，亲和层析柱可以反复使用。

（2）胰酶蛋白和活性测定

实验七 SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定

一、实验目的与原理

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。1967年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(SDS),大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质结合1.4g的SDS－复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与蛋白质所带的电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。

本实验的目的是对多酚氧化酶的纯化度鉴定及分子量的测定，通过实验，学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质纯度和分子量的鉴定。

二、仪器与试剂

1．材料：

硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品、DEAE-纤维素DE52柱层析的样品，Sephadex G-100柱层析的样品。

2．试剂：

（1）丙稀酰胺(Acr母液)：30％Acr （Acr/Bis）

（2）10％的SDS溶液

（3）10％的过硫酸铵溶液

（4）四甲基乙二胺（TEMED）

（5）分离胶缓冲液：1.5M Tris,PH8.8

（6）浓缩胶缓冲液：1.0M Tris,PH6.8

（7）电极缓冲液：10×30g Tris,125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml,pH8.3

（8）样品缓冲液：0.2M Tris,PH6.8,1%SDS,30%甘油，巯基乙醇及溴酚兰

（9）染色液：0.15％考马斯亮蓝R250，溶于脱色液

（10）脱色液：50％的甲醇，7％的冰醋酸的水溶液

（11）标准分子量蛋白。

3．仪器设备：

电泳仪，垂直电泳槽等。

三、操作步骤

1, 凝胶制备：

用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏胶），垂直放置。将配制好的分离胶溶液，倒入，滴加入无离子水，待凝胶聚集后，倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒入浓缩胶，再插入梳子。

2, 上样：

分别取样品若干ml于离心管中，按1/1-1/5比例加入5×样品缓冲液，再沸水浴中加热3－5min，取出待用。用微量注射器分别吸取不超过30ul不同浓度的标准蛋白样品和试验样品注入样品槽。点样结束后，调节电泳仪电流到10mA（2－3mA/em），保持电流稳定不变，当溴酚蓝迁移到离分离胶底1－2cm时，即可停止电泳。

3, 染色：

电泳完毕后，取出凝胶板，浸入染色液中，在37℃温箱中保温过夜。倒掉染色液，24h后，即可看到清晰的蛋白质条带。

四、结果 （略）

五、注意事项

1、 SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白质），如果比例不当，就不能得到准确的数据。

2、用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。

3、有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。

4、有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。

5、如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。

等电聚焦电泳（IEF）分离蛋白及测定蛋白质等电点

一、原理

等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。

在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以“聚焦”.

二、仪器与试剂

1．材料：蛋白样品

2．试剂：

聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100

电极液：1M磷酸（阳极液）、1M氢氧化钠（阴极液）

固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml

染色液：0.35g考马斯亮蓝R－150溶于300ml脱色液中，加热到60－70℃，加入0.3g硫酸铜。

脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水

样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素

三、操作步骤：

1, 样品制备：

用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。充分溶解后，离心去除不溶杂质。

2,制模具：

洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。

3, 配胶：

胶液组成：6ml胶母液（10％，19/1）

6－8％尿素

1ml Ampholine (pH3.5-10)

60-80ul 10%AP

5 ul TEMED

4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具

5, 电泳：

等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。在胶面上任意位置上放上小擦镜纸片，在纸片上加样，盖上盖子，横功率25W电泳，约10min后，暂停电泳，取下纸片，继续电泳约30min，待电流达4mA以下，停止电泳。

6, 表面电极测定蛋白质的pI

7, 固定：取出塑料片，放入固定液中15min

8, 染色：取出塑料片放入染色液中65℃染色，直至条带出现

9, 可脱色至背景消除后干燥保存。

四、结果 （略）

五、注意事项

1、两性电解质是等电聚焦的关键试剂，它的含量2％-3％较合适，能形成较好的pH梯度。

2、 丙烯酰胺最好是经过重结晶的。

3、 过硫酸铵一定要新配置。

4、 所有水用重蒸水。

5、样品必须无离子，否则电泳时样品带可能走歪，拖带或根本不成带。

6、 平板等电聚焦电泳的胶很薄，当电流稳定在8mA，电压上升到550V 以上，由于阴极飘移，造成局部电流过大，胶承受不了而被烧断。

三氯乙酸，有机化合物，又名三氯醋酸 ，无色结晶，有刺激性气味，易潮解 ，溶于水、乙醇、乙醚 。主要用于有机合成和制医药、化学试剂、杀虫剂。

2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，三氯乙酸在2B类致癌物清单中

1.健康危害

侵入途径：吸入、食入、经皮吸收。

健康危害：吸入本品粉尘对呼吸道有刺激作用，可引起咳嗽、胸痛和中枢神经系统抑制。眼直接接触可造成严重损害，重者可导致失明。皮肤接触可致化学性灼伤。口服灼伤口腔和消化道，出现剧烈腹痛、呕吐和虚脱。

2.毒理学资料及环境行为

毒性：属低毒类。

应急处理

（1）泄漏应急处理

隔离泄漏污染区，周围设警告标志，建议应急处理人员戴好防毒面具，穿化学防护服。不要直接接触泄漏物，将地面洒上苏打灰，然后用大量水冲洗，经稀释的洗水放入废水系统。如大量泄漏，收集回收或无害处理后废弃。

（2）防护措施

呼吸系统防护：空气中浓度超标时，应该佩带防毒口罩。必要时佩带自给式呼吸器。

眼睛防护：戴化学安全防护眼镜。

防护服：穿工作服(防腐材料制作)。

手防护：戴橡皮手套。

其它：工作后，淋浴更衣。注意个人清洁卫生。

（3）急救措施

皮肤接触：脱去污染的衣着，立即用水冲洗至少15分钟。若有灼伤，就医治疗。

眼睛接触：立即提起眼睑，用流动清水或生理盐水冲洗至少15分钟。就医。

吸入：迅速脱离现场至空气新鲜处。保持呼吸道通畅。必要时进行人工呼吸。就医。

食入：误服者立即漱口，给饮牛奶或蛋清。就医。

灭火方法：雾状水、泡沫、二氧化碳、砂土。