三氯乙酸使酶失活原理

三氯乙酸的作用楼上两位已经说得很明白了，我来具体说说它在本实验中作用吧。

土壤中产蛋白酶的微生物，在生长过程中会向细胞外分泌蛋白酶，加入三氯乙酸后，这些细胞外的蛋白酶变性沉淀出絮状物，据此判断该微生物可能是产蛋白酶的。

比如你在液体培养基里养了某菌，然后离心把菌沉淀出来，如果培养基里有足够浓度的细菌分泌出来的蛋白酶，加入10%左右的三氯乙酸后就可以看见絮状沉淀。不过这些沉淀也不一定是蛋白酶，可能只是一般的蛋白质。

呵呵，也许有别的作用，暂时想到这样子。

三氯乙酸与蛋白质之间主要有以下几个方面的作用:

①在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐.

②作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团，使之聚集沉淀.

③随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性越大，TCA可能渗入分子内部而使之较难被完全除去，在电泳前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解而形成碎片，而且随时间的延长这一作用愈加明显； 在电泳时使用TCA对蛋白质样品的浓缩或除盐时，对于分子质量大的蛋白质，要慎重选择TCA.对小分子量蛋白质的浓缩，采用TCA时也有两点需要注意:一是用TCA沉淀后，尽量用丙酮彻底抽提TCA二是样品处理后要尽快进行电泳分析，以免发生聚集及断裂，造成结果分析的不准确。

在多酚氧化酶性质实验中三氯乙酸和硫脲有蛋白质沉淀，使酶失活，失去催化能力作用。

1、聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺（Acrylamide简写为Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N，N1-methylene-bisacrylamide，简写Bis）在催化剂（过硫酸胺或核黄素）的作用下，聚合成含有酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲叉桥交联形成就具有三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。

淀粉遇碘变蓝是淀粉的特性，所以丁是淀粉；三氯乙酸使蛋白质变性后呈浑浊状，说明甲、丙为淀粉酶和蛋白酶，乙为清水；丁丙混合后不变蓝说明淀粉被水解了，根据酶的专一性，可知丙为淀粉酶溶液，所以D选项正确．

故选：D．

生物化学实验——糖酵解中间产物的鉴定一、实验目的

了解糖酵解过程的某一中间步骤及利用抑制剂来研究中间代谢的方法。

二、实验原理

利用碘乙酸对糖酵解过程中3-磷酸苷油醛脱氢酶的抑制作用，使3-磷酸苷油醛不再向前变化而积累。硫酸肼作为稳定剂，用来保护3-磷酸苷油醛是不自发分解。然后用2，4-二硝基苯肼与3-磷酸苷油醛在碱性条件下形成2，4-二硝基苯肼-丙糖的棕色复合物，其棕色程度与2-磷酸苷油醛含量成正比。

三、仪器 原料和试剂

（1）仪器：试管（1.5×1.5cm）、吸量管（1ml、、2ml3ml）、恒温水浴、烧杯（50ml）。

（2）原料：新鲜酵母。

（3）试剂：

①2，4-二硝基苯肼：0.1g2，4-二硝基苯肼溶于水100ml 2mol/L盐酸溶液中，贮于棕色瓶中备用。

②0.56mol/L硫酸肼溶液：称取7.28g硫酸肼溶于50ml水中，这时不会全部溶解，当加入NaOH使pH达7.4时则完全溶解。此液也可用于水合肼溶液配制，可按其分子浓度稀释至0.56mol/L，此时溶液呈碱性，可用浓硫酸调pH至7.4即可。

③5%葡萄糖溶液。

④10%三氯乙酸溶液。

⑤0.75mol/LNaOH溶液。

⑥0.002mol/L碘乙酸溶液。

四、操作步骤

（1）取小烧杯3只，分别加入新鲜酵母0.3g，并按下表分别加入各试剂，混匀。

杯号 5%葡萄糖加入量/ml 10%三氯醋酸加入量/ml 碘乙酸加入量/ml 硫酸肼加入量/ml 发酵时起泡多少

1 10 2 1 1

2 10 -- 1 1

3 10 -- -- --

（2）将各杯混合物分别倒入编号相同的发酵罐内，放入37℃保温1.5h，观察发酵管产生气泡的量有何不同。

（3）把发酵管中发酵液倾倒入同号小烧杯中并在2号和3号杯中按下表补加各试剂，摇匀放10min后和第一只烧杯中内容物一起分别过滤，取滤液进行测定。

杯号 10%三氯乙酸/ml 碘乙酸/ml 硫酸肼/ml

2 2 -- --

3 2 1 1

（4）取3个试管，分别加入上述滤液0.5ml，并按下表加入试剂和处理。

管号

滤液/ml 0.75mol/L

NaOH/ml

室温放置

10min 2，4-二硝基苯肼/ml

38℃水浴保温19min 0.75mol/L

NaOH/ml

观察结果

1 0.5 0.5 0.5 3.5

2 0.5 0.5 0.5 3.5

3 0.5 0.5 0.5 3.5

五、思考题

实验中哪一发酵管生成的气泡最多？哪一管最后生成的颜色最深？为什么？

￥

5.9

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生物化学实验糖酵解中间产物的鉴定

生物化学实验——糖酵解中间产物的鉴定

一、实验目的

了解糖酵解过程的某一中间步骤及利用抑制剂来研究中间代谢的方法。

二、实验原理

利用碘乙酸对糖酵解过程中3-磷酸苷油醛脱氢酶的抑制作用，使3-磷酸苷油醛不再向前变化而积累。硫酸肼作为稳定剂，用来保护3-磷酸苷油醛是不自发分解。然后用2，4-二硝基苯肼与3-磷酸苷油醛在碱性条件下形成2，4-二硝基苯肼-丙糖的棕色复合物，其棕色程度与2-磷酸苷油醛含量成正比。

三、仪器 原料和试剂

（1）仪器：试管（1.5×1.5cm）、吸量管（1ml、、2ml3ml）、恒温水浴、烧杯（50ml）。

（2）原料：新鲜酵母。

（3）试剂：

①2，4-二硝基苯肼：0.1g2，4-二硝基苯肼溶于水100ml 2mol/L盐酸溶液中，贮于棕色瓶中备用。

②0.56mol/L硫酸肼溶液：称取7.28g硫酸肼溶于50ml水中，这时不会全部溶解，当加入NaOH使pH达7.4时则完全溶解。此液也可用于水合肼溶液配制，可按其分子浓度稀释至0.56mol/L，此时溶液呈碱性，可用浓硫酸调pH至7.4即可。

③5%葡萄糖溶液。

④10%三氯乙酸溶液。

⑤0.75mol/LNaOH溶液。

⑥0.002mol/L碘乙酸溶液。

四、操作步骤

（1）取小烧杯3只，分别加入新鲜酵母0.3g，并按下表分别加入各试剂，混匀。

三氯乙酸是一种有机酸，使多糖提取液中的蛋白质与有机酸作用而变性沉淀。 该法是 在多糖水提液中滴加 5 %～10 %与多糖水提取液等体积的三氯乙酸，混匀静置过夜，离心除 去胶状沉淀，重复以上的操作直至溶液不再继续混浊为止，得无蛋白质的多糖。 三氯乙酸浓度越大，除蛋白质效果越好，但对多糖的影响也越大，可能是三氯乙酸对多糖结构具有破坏作用，使多糖降解，而且这种破坏作用随着三氯乙酸浓度增大而增强。 植物多糖常采用三氯乙酸法除蛋白质，也可先用蛋白水解酶，使样品中的蛋白质部分降解后再用 Sevag 法效果更好；微生物多糖去除蛋白常采用 Sevag 法、三氟三氯乙烷法；也可用盐析法、有机溶剂萃取等方法除蛋白。