液氮研磨后的样品如何提取酶液成分
液氮研磨后的样品提取酶液成分方法如下：
1、取500ul裂解液，转入1点5离心管中，加入50ul混匀备用。
2、液氮中研磨适量植物组织成细粉后，取50mg细粉转入上述装有RLT和PLANTaid的离心管，立即用手剧烈振荡20秒，充分裂解。
3、用带钝针头的一次性1ml注射器抽打裂解物10次，直到得到满意匀浆结果，剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。
4、将裂解物13000rpm离心5到10分钟，沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid，将所有裂解物上清转到一个新离心管。
5、较精确估计裂解物(上清)体积，加入0点5体积的无水乙醇，此时出现沉淀，不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
6、将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，除去漂洗液，免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
7、预期RNA产量30ug，加30到50ulRNasefreewater重复，合并两次洗脱液，使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍。
8、洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15到百分之三十，浓度要低，用户根据需要选择。
1． 称取2～5g 新鲜菠菜幼嫩组织或小麦黄花苗等植物材料，用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面，用滤纸吸干水分备用。叶片称重后剪成1cm 长，置研钵中，经液氮冷冻后研磨成粉末。待液氮蒸发完后，加入15mL 预热（60～65℃）的CTAB 提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于65℃水浴保温，0.5~1h，不时地轻轻摇动混匀。
2．加等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。
3．将锥形瓶中的液体倒入离心管中，在室温下4 000r/min 离心5min，静置，离心管中出现3 层，小心地吸取含有核酸的上层清液于量筒中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。
4．根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。
5．收集上层清液，并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入1～2 倍体积预冷的95％乙醇，边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀（主要为DNA）迅速缠绕在玻棒上。小心取下这些纤维状沉淀，加1～2 mL 70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙醇，即为DNA 粗制品。
6．上述DNA 粗制品含有一定量的RNA 和其它杂质。若要制取较纯的DNA，可将粗制品溶于TE 缓冲液中，加入10mg/mL 的RNase 溶液，使其终浓度达50μg/mL，混合物于37℃水浴中保温30min 除去RNA。重复步骤2～5 的操作，可制得较纯的DNA 制品。
7．将DNA 制品溶于250μL 的TE 缓冲液中，完全溶解DNA 样品。
8．加入1/10 倍体积的3mol/L NaAc（pH6.8）和2 倍体积的95％乙醇，沉淀DNA，重复步骤5。最后，将DNA 溶于250μL 的TE 缓冲液中。
9．在751 型分光光度计上测定该溶液在260nm 紫外光波长下的光密度值。代入下式计算DNA 的含量。
结果计算
式中OD260nm 为260nm 处的光密度；L 为比色杯光径（cm）；0.020 为1μg/mL DNA 钠盐的光密度。
DNA 的紫外吸收高峰为260nm，吸收低峰为230nm，而蛋白质的紫外吸收高峰为280nm。上述DNA 溶液适当稀释后，在751 分光光度计上测定其OD260nm、OD230nm 和OD280nm。如OD260nm/ OD230nm≥2OD260nm/ OD280nm≥1.8，表示RNA 已经除净，蛋白含量不超过0.3％。
附 注
如果植物样品不经液氮处理，提取液中的CTAB 浓度需要提高到4%（W/V）。在许多情况下，使用0.1%（V/V）巯基乙醇，并不能完全抑制叶片中的氧化作用，但是，这种氧化作用不会影响限制性内切酶的活性。如果使用的巯基乙醇浓度高于0.1%（V/V），则会大大降低DNA 的得率。
1．制备的DNA 在：（1）含有螯和剂如EDTA 中较稳定，因为EDTA 能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase；（2）在pH5～9 之间较稳定，否则过酸过碱会破坏DNA 的结构；
（3）有一定离子强度（强度越高, DNA 越稳定）的溶液中较稳定。
（TE 满足以上要求, 但如需对所得DNA 进行酶切, EDTA 浓度不可过高, 一般用0.1×TE 或0.2×TE）。
2．为了保证植物DNA 的完整性：（1）整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）；这样可防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解；（2）当DNA 处于溶解状态时，要尽量减弱溶液的涡旋，动作要轻柔；在进行DNA 溶液转移时用大口（或剪口）吸管，尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏
1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。
2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。
3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
4、提取上清液，样品制备完成。
蛋白质提取液：300ml
1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml
2、甘油（Glycerol）75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g
这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！
二、植物组织蛋白质提取方法
氯醋酸—丙酮沉淀法
1、在液氮中研磨叶片
2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。
3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。
4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。
5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。
药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。
这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！
三、植物材料：水稻苗，叶鞘，根
1、200毫克样品置于冰上磨碎
2、加lysis buffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清
3、重复离心5min
lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40
四、蛋白质样品制备
秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。
100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，15000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
按每mg干粉加入20μl（可调） UKS液[9.5 M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃温育30min，期间搅动几次，28度 （温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000 r/min离心15 min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存
五、植物根中蛋白质的抽取
(1) sample, 液氮研磨
(2) 装1.5 ml centrifuge 用tube
(3) 加 1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul
(4) 12000 rpm, 4度, 10-15minite
(5) 取上层液，蛋白质就在里面
用真空冷冻干燥机。如果没有的话可以考虑冰浴。
浸渍法：浸渍法是将原料用适当的溶剂在常温或温热条件下浸泡出有效成分的一种方法。具体做法是: 取适量粉碎后的原料，置于加盖容器中，加入适量的溶剂并密盖，间断式搅拌或震摇，浸渍至规定时间使有效成分浸出。取上清夜，过滤，压榨残渣，合并滤液和压榨液， 过滤浓缩至适宜浓度， 可进一步制备流浸膏， 浸膏，片剂，冲剂等。
