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提取dna的苯酚浓度

糟糕的蜜蜂
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2023-01-27 17:16:54

提取dna的苯酚浓度

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2026-01-23 19:34:49

提取dna的苯酚浓度是(μg/ml)=OD260×40μg/ml。高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合,接着通过透析来获得DNA。DNA具有储存生命基因的重要作用,酚抽的提法是用蛋酶K和SDS来破碎细胞消化蛋白。玻璃棒缠绕法来提取DNA:将裂解物铺于乙醇上,接着用盐酸胍裂解细胞,用带钩玻璃棒在界面轻轻搅拌,使得DNA沉淀液绕于玻棒之上。可以采用甲酰胺解聚法破碎细胞,异丙醇沉淀法和酚抽的提法基本相似,区别在于仅用二倍容积异丙醇来替代乙醇,目的是去除小分子RNA,加热法是能够快速获得DNA。一般加热96度-100度,然后进行离心后取上清,就可以提取dna。

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2026-01-23 19:34:49

苯酚、氯仿、异戊醇抽提DNA的原理是通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质,再加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.

使用苯酚抽提细胞 DNA 时,苯酚的作用是使蛋白质变性,同时抑制了 DNase 的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与 DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶.蛋白分子溶于酚相,而 DNA 溶于水相.

氯仿的作用是克服酚的缺点;加速有机相与液相分层.最后用氯仿抽提:去除核酸溶液中的迹量酚.(酚易溶于氯仿中)

用酚-氯仿抽提细胞基因组 DNA 时,通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇,为什么?因为异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡.异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡 产生.另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含 DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定.

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2026-01-23 19:34:49
Tris饱和酚用于DNA的提取。其中,酚是强的蛋白变性剂,可以使细胞或组织中的蛋白质变性析出。 而Tris的主要作用是防治止酚类氧化,若酚类氧化,则会形成醌(两个苯环),醌含有强自由基,会破坏核酸结构。 同时,由于PH值大于7,在碱性环境中DNA处于水相,RNA处于有机相。从而分离上清,即可得到DNA。

RNA不稳定,易分解。可以加胰RNA酶去除。

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2026-01-23 19:34:49
酚抽提通常用来对DNA 或RNA 样品进行蛋白质的去除。酚与水不互溶,当它们混合时会形成两相,水相和酚相。当含有DNA 的水溶液与酚混合时,蛋白质会进入酚相,再将含DNA 的水相取出进行再抽提和乙醇沉淀浓缩。

一、材料

抗有机溶剂的塑料管,尝试尽可能小的体积,大多数的抽提可以在微量离心管中进行。

TE 饱和的酚:氯仿:异戊醇(25 : 24:1)

氯仿:异戊醇(24 : 1)

移液器和移液头

二、步骤

DNA样品中加入等体积的TE饱和的酚氯仿,对于1.5 ml 的微量离心管,总体积不应超过500 μI 。

剧烈振荡20 s 。

样品在室温离心5 min, 分相,这个步骤不需要很高的转速,但是通常用最高转速比较方便。小心地从离心机中取出样品,不要搅动分开的两相

在不搅动蛋白质层的情况下,用移液器小心地将尽量多的水相转移到新的离心管中。

向水相中加入等体积的氯仿,重复步骤2 、3 和4 。

做好标签,现在就准备用乙醇沉淀浓缩

为了提高产量: 如果觉得没有得到足够的水相,可以在酚相加入与酚相等体积的pH 7.5 的TE, 对酚相再次抽提、振荡、离心。如果两次抽提的体积小于500 μl, 可以将它们合并,但是最后你会发现在这个管子里几乎没有DNA。一般对酚相进行常规的酚抽提是不值得的。

为了提高纯度: 如果你觉得可能已经混入了蛋白质层,那么可以加入与水相等体积的酚氯仿再次抽提水相、振荡、离心。如果发现DNA 的酶反应不能正常进行,那么DNA 样品必须进行2 次抽提。