细胞培养箱里无菌水里一定要放硫酸铜吗

1. 培养箱消毒：先用纯水擦洗，再用95的酒精擦洗，再照紫外就可以拉！注意周围环境的清洁就不会那么容易污染的拉！

2. 我的经验是在补充水时最好把水加热一下，达到培养箱的温度。

3. 这么早就养细胞了，我们这里一般是用70％的乙醇擦洗，然后再用0.1％的新洁尔灭擦洗，不放心的话再用高锰酸钾加甲醛1：1比例熏一遍。注意要是熏的话千万注意混合之后马上离开，然后密闭细胞培养室，味道很刺激的。最好在养细胞前消毒，否则，确实没地方放细胞。

4. 我们的方法比较简单，先用75%酒精擦拭内壁，通风10分钟，紫外线照射30分钟即可。

5. 我们的通常处理是先用75%的酒精擦拭内壁，然后用甲醛+高锰酸钾熏蒸一个晚上，然后通风一整天（同时打开紫外线照射）。

6. 我们是把培养箱里的板层拿出来高压一下，箱壁用75％酒精擦一遍，换用诗乐氏擦一遍，再紫外照一夜，效果很好，其他的请高手指教。

7. 熏蒸后吹一天是绝对不够的，最起码要一个星期才可以让甲醛散尽，要不细胞长不好的

8. 有的培养箱能加热内壁到90度，也有的带有紫外线功能。常规应该每周用酒精擦洗内部一次。具体的操作请参考培养箱的手册，或着咨询培养箱技术支持。使用消毒剂应小心，培养箱内有检测温度、湿度和二氧化碳浓度的传感器，腐蚀性消毒剂或有机溶剂有可能损坏某些器件，请慎用。另外，挥发性的甲醛有毒，易燃、易爆。如果在培养箱内残留甲醛的话，细胞会死光光哦（我实验室的真实故事）。总之，先看培养箱手册，再联系技术支持，方可万无一失啊。

9. 常规最好什么也不放！硫酸铜的作用是抑制细菌生长（但多数用在处理污染的孔板）。因为现在的孵箱都有抑菌功能。

10. 我们实验室的做法:把平皿高压灭菌后,在无菌操作台内加入适量的灭菌双蒸水或者生理盐水.再加少量新洁尔灭,浓度没关系.细胞养的都可以.

全封闭无菌试验过滤培养器怎么用

目的 建立健全注射用青霉素钠无菌检查方法，保证检验结果的准确性和可靠性。方法 按中国药典2010年版二部(附录XI H)无菌检查法中的薄膜过滤法进行。

1 试验环境与材料

1．1 试验环境在环境洁净度万级、局部洁净度百级的单向流空气的菌无室中进行。

1．2 仪器智能集菌仪(杭州泰林生物技术设备有限公司)、PY330一次性全封闭集菌培养器(杭州泰林生物技术设备有限公司)、生化培养箱(苏州威尔实验用品有限公司)、霉菌培养箱(苏州威尔实验用品有限公司)、生物安全柜(苏州安泰空气技术公司)

1．3 试药注射用青霉素钠

1．4 试验用菌株金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003l、大肠埃希菌[CMCC(B)44 102]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、生孢梭茵[CMCC(B)64 941]、白色念珠菌[CMCC(F)98 001]、黑曲霉[CMCC(V)98 003]。

1．5 培养基、稀释液及缓冲液1．5．1 干粉培养基 硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、琼脂粉。

1．5．2 细菌稀释液0．9％ 灭菌氯化钠溶液。

1．5．3 冲洗用缓冲液pH7．0氯化钠-蛋白胨缓冲液。

2 方法与结果

2．1 菌液制备按中国药典2010年版附录ⅪH无菌检查法菌液制备法制备 。

2．2 菌落计数取金黄色葡萄球菌菌液、大肠埃希菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液各1 m1分别接种于营养琼脂培养基中，生孢梭菌接种至含1．5％琼脂的硫乙醇酸盐流体培养基中，30~C～35'E生化培养箱培养24～48 h，取白色念珠菌菌液、黑曲霉菌液各1 m1分别接种至改良马丁琼脂培养基中，经23℃ 一28~C霉菌培养箱培养48～72 h，计数。(上述各菌液分别接种两个平板，取平均值，同时设阴性对照)

2．2 方法学验证

2．3．1 试验组(样品+阳性) 取一次性全封闭集菌培养器(三联装)一套，先用少量pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液润湿滤膜，取样品15瓶溶解于250 ml缓冲液中，按薄膜过滤法过滤，样品过滤完毕后，再用pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每次每管注人冲洗液100 ml，充分振摇，完全排空后循环操作5次，总冲洗量达到500 ml每管。冲洗完毕后在2管中分别注人改良马丁培养基100 ml，另1管中注入硫乙醇酸盐流体培养基100 ml。另取一套集菌培养器(三联装)取本品依上述方法过滤并冲洗后，均注入硫乙醇酸盐流体培养基100 ml，将上述6管集菌培养器移至阳性对照室，于含硫乙醇酸盐流体培养基的集菌培养器中，分别接种金黄色葡萄球菌菌液、大肠埃希菌茵液、枯草芽孢杆菌菌液、生孢梭菌菌液各1 ml，于含改良马丁培养基的集茵培养器中，分别接种白色念珠菌菌液和黑曲霉菌液各1 ml，按前述规定温度培养3～5 d，观察结果。

2．3．2 阳性对照组取一次性全封闭集菌培养器(三联装)二套，4管中分别注入硫乙醇酸盐流体培养基各100 ml、2管中分别注入改良马丁培养基各100 ml，在阳性对照室内将6种菌液分别接种至相应管内，作为阳性对照，按前述规定温度培养3～5 d，观察结果。

2．3．3 阴性对照组取一次性全封闭集菌培养器(二联装)一套，滤过适量缓冲液后分别注入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各100 ml，作为阴性对照，按前述规定温度培养14 d，观察结果。

2．3．4 样品的无菌检查 取样品15支依上述方法同法操作，以500 ml／管的冲洗量冲洗，加入培养基后，按规定温度培养14 d，逐日观察，若培养14 d均澄清；由此判定供试品符合规定。

结果判断 与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。 如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证试验。

讨论 目前，抗生素类药物的应用非常广泛，针对每种抗生素类药物建立严格的质量标准，提高抗生素的质量就显得尤为关键。所以对一个新品种建立无菌检查法时，对其方法进行验证就显得尤为必要。薄膜过滤法作为无菌检查中的一种方法，具有准确、方便、快捷的优点，是无菌检查时所采用的一种重要方法。试验表明上述方法操作方便快捷、结果准确。所以，该无菌检查方法验证对保证结果的可信度和准确性具有重要意义。

加在培养箱的水盘中与加在细胞的培养液中肯定是两码事，我觉得一楼混淆了。

我根本不懂答案，但有网友问过这个问题，我只是把答案中比较靠谱的翻译过来：

网友甲是用的并且认为没问题，用量为0.01-0.05%

网友乙认为不该用，并给出原因有五：

1。 叠氮化钠并非对所有微生物都有效

2。培养箱中会有少量氨气，影响细胞状态

3。 叠氮化钠对人体有毒，使用者若接触到会受到危害

4。叠氮化钠有引发爆炸的潜在危险

5。叠氮化钠如接触到酸将产生剧毒气体

网友乙最后推荐在水盘中使用硫酸铜。

http://www.researchgate.net/post/is_it_advisable_to_put_sodium_azide_in_the_water_which_is_put_in_the_CO2_incubator_for_humidity

细胞状态不好的细胞举例如下：细胞形态：传代越多你就会发现细胞的形态都会有或多或少的变化,会有细胞变异,不规则形状变多.细胞内部会有更多的颗粒出现.然后就是根据细胞的传代时间的变化,多久长满一瓶等等很多小细节来看细胞的状态.

培养箱和无菌操作台这些硬件条件就不说了，养细胞首先要选好血清，不同的细胞要用不同的血清，有的用胎牛的，有的用小牛的。然后就是在传代的时候消化不要过度了，不然细胞很受伤的。还要注意看培养基颜色的变化，不要很长时间不去管细胞。其实，最简单的做法就是把你养细胞的过程和别人的比较一下就知道差别在哪里了，差别所在很有可能就是问题所在。

二氧化碳培养箱为细胞生长提供了理想的生长环境，细胞在培养箱中培养数月甚至数年，如果培养不当导致细胞死亡可能造成极大的科研成果损失。培养箱本身性能的稳定和可靠性固然重要，另外，正确的使用方法和日常保养对实验结果也是至关重要。一般来说可以通过以下三种途径来减少实验室细胞污染：

1、正确的使用培训；

2、持续的日常保养；

3、适当的摆放位置。

下面来详细介绍以上三种途径是怎么减少实验室细胞污染的。

1、正确的使用培训。

实验室内往往众多实验人员共用一台培养箱，难免有人为操作失误，但会增大交叉污染的风险，因此应对所有实验人员进行培养箱的使用培训。需要注意以下几点：

(1) 设备使用培训

使用培养箱前必须着个人防护装备，按照实验室生物安全等级要求实施实验室管理规范、无菌操作方法、标准操作流程(SOP)。

如实验服袖口需扎进手套内，未扎进的袖口可能接触到洁净的培养基，会增加交叉污染的风险，另外裸露皮肤上的可能潜在的污染源也会增加交叉污染的风险；

手套使用前用70%常用消毒剂消毒；

培养瓶、培养盘、培养皿等在放入培养箱前需做好标记；

从箱子后部依次往前摆放培养基，以免最早放置的被过多干扰；

近期需要取出的材料放至靠近箱门处并做好标记；

带盖的长颈瓶应远离箱门以避免交叉污染；

避免堆叠太多培养基；

为避免干扰尽量少开箱门。

(2) 人员操作培训

建立完善的实验室管理规范：

新进实验员应建立培训流程；

实验室内应定期或不间断进行操作培训；

做好详尽的文件记录，文件记录不仅单纯的记录实验室事件，对设备定期维护、实验数据查找都能起到很好的提示和记录，比如提示每周检查过滤器、开门频率对细胞生长的影响。

2、持续的日常维护保养

培养箱日常维护保养对其性能的保障非常重要，甚至比操作技术失误对实验结果的影响更大。做好培养箱的日常维护不仅减少对实验结果的影响更能延长培养箱的使用寿命，降低实验室成本。

(1) 完善的文件管理

厂商提供的操作维护说明书是很好的参考文件，会列举日常使用及保养需注意的要点，可以作为实验室培养箱维护文件的参考。制定维护保养文件时需全面考虑培养箱使用频率、实验室环境洁净度、使用人员的数量、以及培养细胞的类型等，综合各方面情况列出合理的方案。

(2) 箱体的定期清洁

培养箱内外部的定期清洁频率取决于培养细胞的类型和实验室环境。

外部清洁必须定期去除灰尘及长期附着在表面的污染物，这些污染物在开门时很可能随空气流动潜入箱体内。培养量大的实验室建议每周清洁一次，培养量小的实验室建议每月清洁一次。使用较温和的家用清洁剂或蒸馏水清洁即可。

不锈钢内胆建议每月清洁一到两次，圆角的设计可以减少污染物的产生，可使用70%异丙醇、酒精或其它无腐蚀性的消毒剂擦拭，切记不可使用卤素类消毒剂(次氯酸、漂白粉)。门口垫圈处很易滋生污染物，需注意加强清洁，或拆下进行高温灭菌。

(3) 水盘的清洁

水盘的清洁和换水是培养箱日常维护很重要的项目，至少一周需清洁一次，频繁加水以保障饱和湿度。水盘加水使用蒸馏水或去离子水，可以加少剂量的硫酸铜溶液抑制污染物。

(4) 防止干燥

如果培养环境湿度不足，培养基中的水分会蒸发造成环境干燥影响细胞生长。至少每周加一次水对保持培养箱湿度非常重要。

(5) 污染风险降到最低

细菌、霉菌、病毒或支原体污染是细胞生长最大的威胁。现代的培养箱的设计和特点可以适当减少污染发生。

(6) HEPA过滤器

闭环HEPA过滤器是减少污染发生的一个重要设计。HEPA过滤器持续提供箱内洁净的空气。但为保证HEPA过滤的有效性，HEPA需要定期更换，每周或每两周应定期检查过滤器。进气过滤器的寿命一般在3-6个月。建议供气过滤器每使用5瓶气或已变黄时更换一次，大的囊性过滤器每两年需更换一次。

配备HEPA过滤器的培养箱类似一个微型洁净间，箱内持续过滤的空气使箱体空气洁净度达到百级。每一次开箱门都可能造成污染物的侵袭，培养箱每20分钟换气一次，使污染物快速被过滤，箱体内空气洁净度达ISO 5级。

(7) 循环灭菌

一些实验室潜在病原微生物如HIV病毒，需要145℃干热循环灭菌才能有效灭杀。145℃灭菌程序需要持续8-14小时，可选择在夜间运行。145℃灭菌需要按照实验室SOP根据实际需要运行，并且不能代替日常的清洁保养。

3、放置适当位置

培养箱需要放置在实验室内合适的位置：远离走廊，环境温度需稳定，远离水源，远离通气设备以免空气污染，远离窗口避免阳光直射，远离其它热源如高压蒸汽灭菌器，以及离电源近的位置。

最好在养细胞前消毒，挥发性的甲醛有毒。因为现在的孵箱都有抑菌功能，不放心的话再用高锰酸钾加甲醛1，请慎用，然后再用0,浓度没关系，味道很刺激的。 10:把平皿高压灭菌后. 我的经验是在补充水时最好把水加热一下. 我们的方法比较简单。注意要是熏的话千万注意混合之后马上离开，再照紫外就可以拉，然后用甲醛+高锰酸钾熏蒸一个晚上，确实没地方放细胞。 3. 熏蒸后吹一天是绝对不够的. 常规最好什么也不放.再加少量新洁尔灭。使用消毒剂应小心。 6。 9！注意周围环境的清洁就不会那么容易污染的拉，通风10分钟，也有的带有紫外线功能：1比例熏一遍. 有的培养箱能加热内壁到90度、易爆，然后通风一整天（同时打开紫外线照射），易燃，培养箱内有检测温度，箱壁用75％酒精擦一遍！ 2.1％的新洁尔灭擦洗，腐蚀性消毒剂或有机溶剂有可能损坏某些器件。另外，再紫外照一夜. 我们是把培养箱里的板层拿出来高压一下。 5。 7！硫酸铜的作用是抑制细菌生长（但多数用在处理污染的孔板）。常规应该每周用酒精擦洗内部一次，达到培养箱的温度，其他的请高手指教1，细胞会死光光哦（我实验室的真实故事），要不细胞长不好的 8. 我们实验室的做法，我们这里一般是用70％的乙醇擦洗，先用75%酒精擦拭内壁，再联系技术支持。总之。具体的操作请参考培养箱的手册：先用纯水擦洗，最起码要一个星期才可以让甲醛散尽，效果很好，否则，换用诗乐氏擦一遍. 这么早就养细胞了，再用95的酒精擦洗. 我们的通常处理是先用75%的酒精擦拭内壁，先看培养箱手册。 4，然后密闭细胞培养室。如果在培养箱内残留甲醛的话，或着咨询培养箱技术支持,在无菌操作台内加入适量的灭菌双蒸水或者生理盐水、湿度和二氧化碳浓度的传感器. 培养箱消毒，方可万无一失啊，紫外线照射30分钟即可.细胞养的都可以

培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之；有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室和二氧化碳培养箱(若发现真菌污染，可在污染孔内加入1mol/L氢氧化钠或硫酸铜溶液处理)(具体操作方法可参考细胞培养污染的预防)，复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采用5～10倍于常用量的抗生素冲击，加入高浓度抗生素后作用24～48h，再换入常规培养液，有时可能奏效。细胞培养中常用的抗生素及用量见下表。

常用抗生素用量和效应

抗生素抗菌谱浓度（量/mL）

细菌真菌支原体

青霉素G+ 100～1000u

链霉素G- 100～1000μg

庆大霉素G+ /G- +50～200μg

四环素G+ /G- +10～50μg

卡那霉素G+ /G- +100～1000μg

两性霉素 + 常用2μg/mL

制霉菌素 + 常用25μg/mL

+表示效应程度

高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

1.在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。

2.分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

3.每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。

4.确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2～3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2～3代。

5.在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

6.重复步骤4。

7.在无抗生素的培养基中培养4～6代，确定污染是否以已被消除。

培养箱应放置无菌室,水中应加适量的叠氮钠(防腐)或者硫酸铜,注意空气消毒.

消毒培养箱的常用方法有两种：

把细胞移出，记住拧紧瓶盖，通常放在超净台内，室温一两个小时，问题不大。如培养室有空调，也可将空调打开。然后先用75%酒精棉球擦拭培养箱内壁，注意不要漏掉任何一个角落。擦拭两遍后用一蒸水或二蒸水清洗内壁，可多清洗几遍。最后用消过毒的棉球或75%酒精棉球把内壁再擦拭一遍即可。整个操作没有

必要在无菌条件下。最后可在培养箱的水里加上亚甲基蓝，混匀即可。亚甲基蓝溶液可起到一定的抑菌杀菌作用。待培养箱内酒精几乎挥发完时，将细胞放入培养箱中。

还有一种办法就是直接用蒸馏水清洗完，然后再用紫外灯照(最好是那种培养箱里就带有紫外灯的，就方便多了。)

通常培养箱是需要定期清洗的，我们实验室是1-2月清洗一次，当然这要根据细胞养的多少和培养箱使用的频繁程度来决定的。