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（一）从源头控制污染：

（1）玻璃制品、塑料制品和电泳槽 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染，使用前必须于180 ℃干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的（Fedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次， 并于100℃干烤15分钟（Kumar和Lindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟。上述处理可以除去器甲上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。

用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1 ％DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。

（2）研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时，主有涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套，接触“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此进行RNA实验时应勤换手套。

（3）污染的溶液 用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1％DEPC于37℃至少处理12小时，然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。注：DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因些不能用来处理含有Tris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。

（二）已经污染，可以加入RNA酶的抑制剂

（1）RNA酶的蛋白质抑制剂是 从人胎盘分离的一种蛋白质可与多种RNA酶紧密结合（KI≈3x1010）形成非共价结合的等摩尔复合物，使RNA酶失活。此蛋白质体内可能是血管生成素的抑制剂，血管生成素是氨基酸序列和推测的三级结构与胰RNA酶类似的一种血管生成因子， 几个厂家以不同的商品名出售这种抑制剂，该蛋白质应置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DTT）的50％甘油中，贮存于－20℃。抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用，因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的RNA酶。因此，在使用变性剂裂解哺乳动物(mammalmammalian)细胞这一提取RNA的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂。然而职用更温和的裂解方法时应使用这种抑制剂，并且在后续的所有RNA纯化步骤中均应有此蛋白质存在。由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂，故应在纯化过程中补加几次抑制剂。其最大活性的发挥要求巯基试剂，而且它并不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。

（2）氧钒核糖核苷复合物 这种由氧钒（1V）离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物，是量种过渡态类似物，它能与多种RNA酶结合并几科能百分之百地抑制RNA酶的活性。这4种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中，在RNA提取和纯化的所有过程中，其使用浓度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母细胞中进行翻译， 并能作为某些外酶促反应（如mRNA反转录）的模板。然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译，因此必须用含0.1 ％羟基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有几家公司出售氧钒核糖核苷复合物。

（3）Macaloid（硅藻上）Macaloid是一咱粘土，很多年前就发现它能吸附RNA酶，用缓冲液将其制成浆液，以0.015％（W/V）的终浓度溶解细胞。 这种粘土随同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中（如酚抽提后）经离心去除。

（三）提取核酸时可以加入盐酸胍或硫氰酸胍溶液。盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，从而免受RNA酶的干扰。

常见的汽车有机抗菌剂有季铵盐抗菌剂、胍类抗菌剂两种：

1.季铵盐抗菌剂

铵盐在水中具有一定的正电荷，并对其产生一定的静电吸引，该动力学吸引和这些带有正负电荷的细菌，破坏了细菌组织膜的正常渗透。同时，季铵盐的疏水性长链基团穿透了细胞膜并直接进入到细胞内部，破坏了细胞中正常的新陈代谢。然而，与其他抗微生物剂相比，季铵类抗微生物剂的抗菌和灭菌能力更低，并且对真菌，结核分枝杆菌，亲水性病毒和细菌孢子等微生物作用有限。

当溶液暴露于阴离子去污剂中，它很容易通过季铵盐活性成分阴离子和阳离子的作用而被中和。近年来针对季铵盐研究主要目的是提升其抗菌活性。研究表明，单烷基链的寿命越长，双链季铵盐的化学抗菌活性就越强，而一般来说，短链季铵盐的化学抗菌活性就越强。

磷和氢与氮和它属于同族元素演化周期表盐族中的两个磷和氢而氮和它属于不同族，而且磷和季salts两个盐族都具有一种类似于其他季铵盐的分子结构。

与季铵盐类离子相比，磷酸氢氧化钠季铵离子的运动半径远远地要超过了位于氮酸中的氢氧化钠季铵离子，具有较强的化学极化性和反应抑制作用，并且更容易直接吸附其他盐类带正或带有负极性电荷的盐类微生物。同时，用于对这些织物本身进行高温抗菌和消毒整理的作用同时，也同样能够给这些织物本身带来一定的抗菌防腐和隔热阻燃抗菌性能，在这个现代抗菌产品领域中季盐具有很广泛的市场发展潜力，被人们称为是新的下一代抗菌产品。

2.胍类抗菌剂

在甲二胍酸盐类其他抗菌生物药剂中，最广泛应用的药物是甲二聚六亚基三甲基甲二胍盐酸盐（PHMB）。phmb是一种有机物高效，广谱，低毒的生物抗菌药物，易溶于水，广泛应用于食品，化妆品，游泳池灭菌等领域。因为phmb-基的存在，phmb分子之间带有负电，很容易被人体吸收到各种病原体细菌，它们会经由细胞膜向外扩散，并且会破坏细菌渗透均衡，从而损害细胞。

一、硅基质离心柱制备DNA和RNA的工作原理

1. 裂解

裂解方法可能会根据需要DNA或RNA而有所不同，但其共同点是含有高浓度离液盐的裂解缓冲液。

杂化使氢键不稳定，范德华力和疏水相互作用。蛋白质不稳定，包括核酸酶，核酸与水的结合被破坏，为核酸与硅机制结合创造条件。

离液盐包括盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素和高氯酸锂。

除了离液盐，裂解缓冲液通常还含有洗涤剂，有助于蛋白质的溶解和裂解。

根据样品类型，也可以使用酶进行裂解。蛋白酶k就是其中之一，实际上蛋白酶k在裂解缓冲液中起着非常好的作用；蛋白酶k的作用就越好，蛋白质变性越完全。然而，溶菌酶在裂解缓冲液的变性条件下不起作用，因此，通常在加入变性盐之前进行溶菌酶处理。

对于质粒的制备，裂解方式与提取RNA或基因组DNA有很大不同，因为必须先从基因组DNA中分离出质粒。

如果加入离液盐，将立即释放胞内物质，并且无法从高分子量染色体中区分出小的环状质粒。

因此，在质粒制备中，直到裂解后，才加入离液盐，并用于结合硅基质。

2. 结合硅基质（Binding）

离液盐对裂解和硅基质的结合至关重要。

为了增强核酸与硅基质的结合，在结合阶段还加入了乙醇。通常是乙醇，但有时可能是异丙醇。

乙醇的浓度和体积对结合有很大影响，浓度或体积太多会带来大量降解的核酸和小片段，进而影响UV260的读数，使核酸浓度降低。浓度或体积太少，可能很难洗掉膜上的残留盐。

重要的一点是，乙醇会影响结合，并且添加的量对于任何试剂盒都是优化的。修改该步骤有助于获得核酸提取的效果，因此如果遇到问题并希望排除原因，则可以进一步评估该步骤。

另一种问题的诊断方法，保留离心后过柱滤液，并进行沉淀操作，看是否有核酸。如果在裂解过程中使用SDS的表面活性剂，试着用NaCl作为沉淀剂，以避免污染DNA或RNA。

3. 洗涤步骤

裂解液通过硅胶膜离心，现在DNA或RNA与柱结合，杂质，蛋白质和多糖则通过。

但是，膜仍然会被残留的蛋白质和盐弄脏。如果样本来自植物，膜上仍会残留多糖，可能还有一些色素，或者如果样本是血液，膜可能呈棕色或黄色。

清洗步骤有助于去除这些杂质。通常有两种清洗方式，但因样本类型而异。第一次洗涤通常会用少量的离液盐来去除蛋白质和有色污染物。然后用乙醇清洗以除去盐。如果样本本身没有太多蛋白质，如质粒准备或PCR产物纯化，那么只需要乙醇清洗即可。

4. 离心柱的干燥

乙醇洗涤后，大多数操作步骤都有离心来干燥离心柱。这是为了去除乙醇，是清洁洗脱的必要步骤。当10mM Tris缓冲液或水填充到膜上进行洗脱时，核酸会水合并从膜上释放。如果柱上还有乙醇，那么核酸就不能完全再水化。

跳过干燥步骤会导致乙醇污染和核酸产量降低。

这个问题的主要迹象是当试图把样品加载到琼脂糖凝胶上时，即使在存在染料的情况下，DNA不会下沉，而是漂浮在缓冲液中。乙醇污染的另一个迹象是，如果你把样品放在-20摄氏度，它不会结冰。

5. 洗脱

最后一步是从硅基质中释放出纯DNA或RNA。对于DNA的处理，通常使用pH值在8-9之间的10 mM Tris。DNA在稍微碱性的pH下更稳定，在缓冲液中溶解更快。即使是DNA颗粒也是如此。水往往趋向于低pH值，低至4-5，在短时间内洗脱时，高分子量DNA可能不完全水化。通过让缓冲液在离心前在膜中停留几分钟，可以最大限度地洗脱DNA。

另一方面，RNA在弱酸性pH值下稳定，因此水是首选洗脱液。RNA很容易溶于水。

6. 离心柱操作时容易出问题的事儿

核酸回收率低：因素有很多，通常是裂解问题，或者是过柱结合时条件出现了问题。

确保使用新鲜的优质乙醇（100%）稀释缓冲液或添加到过柱结合步骤。

质量差的乙醇或者长期储存的乙醇可能吸水，导致乙醇浓度发生变化，如果洗脱缓冲液的配置出现问题，DNA或RNA就会被清洗时流失。

低纯度：如果样品被蛋白质污染（低260/280），那么可能是因为样品太多，蛋白质没有完全去除或溶解。如果样品的260/230比率很低，则问题通常是来自结合缓冲液或洗涤缓冲液中的盐。确保使用最高质量的乙醇来制备洗涤缓冲液，如果问题仍然存在，则提取是增加洗涤次数。

与其他样品相比，一些样品含有更多的抑制剂。环境样品特别容易出现纯度问题，因为在提取过程中腐殖物质会被溶解。腐殖质类似于DNA，很难从硅胶柱中除去。对于这种类型的样品，在过柱步骤之前需要使用去除蛋白质和腐殖质的专门技术。

降解： 主要是RNA，降解是由于样品储存不当或者裂解效率过低造成的，不过前提是用不含RNase的水洗脱，对于DNA预处理来说，降解并不是一个大问题，因为对于PCR来说，DNA有降解，扩增依旧可以良好进行。但如果不希望DNA剪切过于严重，那么不要使用太强的裂解方法。  PCR纯化注意事项： PCR纯化是所有硅基质离心柱技术中最简单的，因为它只需要添加高浓度的结合盐（通常在每个PCR反应体系中添加3-5倍体积）并离心柱体。因此，当PCR纯化试剂盒操作失败时，可能会特别令人沮丧。所以纯化前，最好在凝胶上检测一下扩增结果。

PCR反应体系中太多物质可在UV260处有吸收峰： 核苷酸、洗涤剂、盐和引物。PCR纯化试剂盒操作失败多数是因为没有获得扩增产物。

如果确定反应体系中，有PCR产物且浓度不低，可以保留过柱后的液体，如果DNA没有发生结合，还可以进行挽救，重新进行纯化。

二、DNA连接酶工作原理

DNA连接酶（EC 6.5.1.1）以共价方式将DNA的磷酸骨架与平末端或配对的粘性末端连接起来，其作用是修复DNA分子中断裂的双链。

在分子生物学中，它通常用于将限制性内切酶产生的DNA片段插入载体。商业连接酶提供含有ATP和Mg2+的反应缓冲液，这两种物质对连接酶活性都是必不可少的。

由于反复的冻融可能会破坏ATP，所以最好将溶液进行分装。

链接反应本身有两个基本步骤。首先，DNA末端必须偶然碰撞，并保持在一起足够长的时间，以便连接酶连接它们。

低温反应更容易。所有的分子在更高的温度下移动得更快，如果它们在低温下轻轻地漂浮在溶液中，而不是像在更高的温度下那样呼啸而过，那么两个DNA末端碰撞并保持在一起会更容易。对于粘性末端，较低的温度稳定了互补核苷酸之间的氢键，有助于保持性对位置。

第二步是酶促反应：DNA连接酶通过两步催化3′-OH与5′-磷酸基团连接。首先，与酶活性部位的赖氨酸残基相连的AMP核苷酸被转移到5′-磷酸。然后磷酸腺苷键被3′-OH攻击，形成共价键并释放腺苷酸。为了让酶进行进一步的反应，酶活性部位的AMP必须由ATP补充。

DNA连接酶在25℃时具有最佳活性，因此连接反应在使DNA末端连接在一起的最佳温度（1℃）和酶反应（25℃）之间的权衡温度下进行。通常在16℃下1小时是可以的，但是由于将DNA末端连接在一起是反应中最不有效的部分，因此通过将温度降低到4℃来促进这一点可以提供更高的效率。 然而，酶在这个温度下工作非常缓慢，因此需要很长的（如过夜）反应时间。

三、比色分析的工作原理

1.对硝基苯基磷酸酯—分析机制

对硝基苯磷酸酯（pNPP）作为一种合成底物广泛应用于各种磷酸酶的催化活性测定。pNPP的磷酸基团被酶裂解生成对硝基苯酚，由于对硝基苯酚在水中电子激发的最大波长为318nm，因此对硝基苯酚也是无色的。然而，在碱性条件下，对硝基苯酚转化为对硝基苯酚阴离子，导致向400nm左右的深色偏移（根据溶液条件将化合物的吸收峰改变为较长波长）。这是电磁光谱的蓝色边缘，但是由于我们看到反射光的颜色（与吸收光相反），溶液看起来是黄色的。

要记住的事情：

铬酸盐转移是分析的关键因素。

举例来说，如果酶的活性要求在酸性范围内有一个最佳的pH值，那么酸性磷酸酶的情况正好如此。

在这种情况下，为了获得所需的黄色，必须在终点添加强碱（例如氢氧化钠或氢氧化钾）。

2.孔雀绿—分析机制

对硝基苯磷酸测定是很好的，但是如果你最喜欢的磷酸酶不能有效地代谢pNPP呢？另一种市面上可买到的磷酸酶测定法是孔雀绿测定法。这种简单的测定方法是基于孔雀绿、钼酸铵和游离正磷酸盐（又称无机磷酸盐，pi）在酸性条件下形成的络合物。

正磷酸盐被磷酸酶分解后从磷酸化底物中释放出来，在硫酸溶液中与钼酸铵形成络合物。孔雀绿磷钼酸盐络合物的形成，在620-650nm处测量，与游离正磷酸盐浓度直接相关。因此，有可能量化蛋白质磷酸酶底物的磷酸化和磷酸释放。

要记住的事情：

这种方法仅测量无机游离磷酸盐；在测量之前，必须首先水解和中和有机磷酸盐（脂质结合或蛋白质结合磷酸盐）。了解不同种类的有机磷酸盐及其各自不同的水解自由能有助于优化分析条件。高能有机磷酸酯（缩醛磷酸酯、酸酐等）具有不耐酸的磷酸基团，可在低pH下孵育释放到溶液中。另一方面，低能有机磷酸盐（磷酸酯）在酸性溶液中稳定，需要更苛刻的条件（如热分解）才能用这种方法检测。

在大量孔雀绿存在下，3:1离子缔合物[(MG+)3(PMo12O40 3-)]容易在酸性水溶液中形成和沉淀。为了稳定水溶液中的1:1离子缔合物，在溶液中加入聚乙烯醇。

在分析过程中要考虑的另一件事是任何可能干扰分析的氧化还原反应的可能性。钼是一种过渡金属，因此存在于多种氧化状态。在钼酸盐阴离子中，它具有+6的氧化状态。通过有机化合物，如抗坏血酸和还原糖（即葡萄糖）或无机化合物（如SnCl2）还原酸化的Mo（VI）溶液，生成颜色为蓝色的Mo（IV）物质。

四、实验室级用水是如何纯化的？

1.蒸馏：像山丘一样古老的技术（或者至少像隐藏在山丘里的静物一样）。水被加热到沸点，然后冷凝成液体。这样可以除去许多杂质，但沸点等于或小于水的杂质也会被带入蒸馏液中。

2.微滤：在这项技术中，利用压力迫使水通过孔径为1至0.1微米的过滤器，以去除颗粒物。直径小于0.2微米的过滤器可去除细菌，即所谓的冷杀菌。

3. 超滤，使用更小的孔径（小于0.003微米）。这些基本上都是分子筛，用来去除直径大于孔径的分子。它可以用来清除病毒、内毒素、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶。

4.反渗透。反渗透过滤器的孔径小于0.001微米，这使得它们能够根据直径筛选离子。这是用来脱盐的水。

5.通过活性炭床过滤，有助于去除吸附在炭表面的氯离子和有机化合物等物质。

6.紫外线辐射。紫外线是一种很明显的去除水中微生物的方法。它还可以通过将某些有机化合物分解成危害较小的产物用来净化水。

7. 去离子/离子交换。将水通过含有阳离子和阴离子树脂混合物的树脂床来去除水中的离子。水中的正离子被阴离子树脂颗粒所吸引，而负离子被阳离子树脂所吸引。其结果是从树脂床的另一端流出去离子水。

销售纯水水或净水系统通常将使用这些技术的组合。水的纯度越高，使用的技术就越多。

五、为什么酶有最适温度

每个生物学家都熟悉酶反应速率与温度的关系，如图所示。

我们知道来自大肠杆菌或温血动物的酶在37℃左右有一个最佳温度，而来自热排气细菌的酶有更高的最佳温度。

为什么酶有一个最佳温度分布？化学家有一个经验法则，温度升高10℃会使反应速度加倍。这个规则是从Arrhenius方程推导出来的。

基本上，随着温度的升高，反应物的动能也随之增加。这种动能的增加意味着反应物更容易与足够的能量发生碰撞，从而使反应发生，因此温度越高，反应速率越高。

温度上升：反应速率曲线的第一部分，其中速率随着温度的升高而增加，遵循Arrhenius方程。如果这种酶即使在高温下也完全稳定，反应速度也会随着温度的升高而继续增加，直到发生其他事情，比如其中一种反应物变得受限。

平衡：反应速率开始趋于平稳，这是由于温度接近该酶变性温度（因此失去活性）。

温度下降：在更高的温度下，酶完全变性，失活。

变性发生的温度取决于酶的结构，而这又与酶的进化起源有关。大肠杆菌的酶已经进化到可以应对37℃左右的温度，而来自热喷口细菌的酶则被迫进化到可以在更高温度下保持稳定的程度。

因此，酶的最佳温度是基于Arrhenius模式对温度的依赖性（反应越热，反应速度越快）和酶接近变性温度时的不稳定性之间的权衡。