求食品添加剂化学检测方法过程
防腐剂是指能防止食品腐败、变质，抑制食品中微生物繁殖，延长食品保存期的物质。目前，我国允许使用的品种主要有苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐、对羟基苯甲酸乙酯和丙酯、丙酸钠、丙酸钙、脱氢乙酸等。1苯甲酸及苯甲酸钠的测定苯甲酸及苯甲酸钠是目前我国使用的主要防腐剂之一。它属于酸型防腐剂，在酸性条件下防腐效果较好，特别适用于偏酸性食品(pH4.5～5)。我国《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760—1996)规定：苯甲酸及苯甲酸钠在碳酸饮料中的最大使用量为0.2g/kg，低盐酱菜、酱菜、蜜饯、食醋、果酱(不包括罐头)、果汁饮料、塑料装浓缩果蔬汁中最大使用量为2g/kg(以苯甲酸计)。1.1 酸碱滴定法1.1.1原理于试样中加入饱和氯化钠溶液，在碱性条件下进行萃取，分离出蛋白质、脂肪等，然后酸化，用乙醚提取试样中的苯甲酸，再将乙醚蒸去，溶于中性醚醇混合液中，最后以标准碱液滴定。1.1.2仪器和试剂(1)仪器①碱式滴定管。 ②300ml烧杯。③250ml容量瓶。④500ml分液漏斗。⑤水浴箱。⑥吹风机。⑦分析天平。⑧锥形瓶。(2)试剂①纯乙醚：置乙醚于蒸馏瓶中，在水浴上蒸馏，收取35℃部分的馏液。②盐酸(6mol/L)。 ③氢氧化钠溶液(100g/L)：准确称取氢氧化钠100g于小烧杯中，先用少量蒸馏水溶解，再转移至1000ml容量瓶中，定容至刻度。④氯化钠饱和溶液。⑤纯氯化钠。⑥95％中性乙醇：于95％乙醇中加人数滴酚酞指示剂，以氢氧化钠溶液中和至微红色。⑦中性醇醚混合液：将乙醚与乙醇按1：1体积等量混合，以酚酞为指示剂，用氢氧化钠中和至微红色。⑧酚酞指示剂(1％乙醇溶液)：溶解1g酚酞于100ml中性乙醇中。⑨氢氧化钠标准溶液(0.05 mol/L)：称取纯氢氧化钠约3g，加入少量蒸馏水溶去表面部分，弃去这部分溶液，随即将剩余的氢氧化钠(约2g)用经过煮沸后冷却的蒸馏水溶解并稀释至1000 ml，按下法标定其浓度。1.1.3操作步骤(1)样品的处理①固体或半固体样品：称取经粉碎的样品100g置250ml容量瓶中，加入300ml蒸馏水，加入分析纯氯化钠至不溶解为止(使其饱和)，然后用100g／L氢氧化钠溶液使其成碱性(石蕊试纸试验)，摇匀，再加饱和氯化钠溶液至刻度，放置2h(要不断振摇)，过滤，弃去最初l0ml滤液，收集滤液供测定用。②含酒精的样品：吸取250ml样品，加入100g/L氢氧化钠溶液使其成碱性，置水浴上蒸发至约100ml时，移入250ml容量瓶中，加入氯化钠30g，振摇使其溶解，再加氯化钠饱和溶液至刻度，摇匀，放置2h(要不断振摇)，过滤，取滤液供测定用。③含脂肪较多的样品：经上述方法制备后，于滤液中加入氢氧化钠溶液使成碱性，加入20～50ml乙醚提取，振摇3min，静置分层，溶液供测定用。(2)提取吸取以上制备的样品滤液100ml，移入250 ml分液漏斗中，加6mol/L盐酸至酸性(石蕊试纸试验)。再加3ml盐酸(6mol/L)，然后依次用40、30、30ml纯乙醚，用旋转方法小心提取。每次摇动不少于5min。待静置分层后，将提取液移至另一个250ml分液漏斗中(3次提取的乙醚层均放大这一分液漏斗中)。用蒸馏水洗涤乙醚提取液，每次10ml，直至最后的洗液不呈酸性(石蕊试纸试验)为止。将此乙醚提取液置于锥形瓶中，于40～45℃水浴上回收乙醚。待乙醚只剩下少量时，停止回收，以风扇吹干剩余的乙醚。(3)滴定于提取液中加入30ml中性醇醚混合液，10ml蒸馏水，酚酞指示剂3滴，以0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴至微红色为止。4)结果计算1.2高效液相色谱法本法可同时用于苯甲酸及山梨酸的测定。1.2.1原理 样品加温除去二氧化碳和乙醇，调pH至近中性，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。1.2.2仪器和试剂(1)仪器 高效液相色谱仪(带紫外检测器)。(2)试剂①甲醇：优级纯，经滤膜(0.5μm)过滤。②稀氨水溶液(1+1)：氨水加水等体积混合。③乙酸铵溶液(0.02mol/L)：称取1.54g乙酸铵，加水至1 000ml，溶解，经滤膜(0.45μm)过滤。④碳酸氢钠溶液(20g/L)：称取2g碳酸氢钠(优级纯)，加水至100ml，振摇溶解。⑤苯甲酸标准储备溶液：准确称取0.1000g苯甲酸，加碳酸氢钠溶液(20g/L)5ml，加热溶解，移入100ml容量瓶中，加水定容至100ml，摇匀。此溶液每毫升含苯甲酸1mg。⑥山梨酸标准储备溶液：准确称取0.1000g山梨酸，加碳酸氢钠溶液(20g/L)5ml，加热溶解，移入100ml容量瓶中，加水定容至100ml，摇匀。此溶液每毫升含山梨酸为1mg。⑦苯甲酸、山梨酸标准混合使用溶液：吸取苯甲酸、山梨酸标准储备溶液各10.0ml，放人100ml容量瓶中，加水至刻度。此溶液含苯甲酸、山梨酸各0.1mg/ml经滤膜(0.45μm)过滤。1.2.3操作步骤(1)样品处理①汽水：称取5.00～10.0g样品，放入小烧杯中，微温搅拌除去二氧化碳，用氨水(1+1)调pH约7。加水定容至10～20ml，经滤膜(0.45μm)过滤。②果汁类：称取5.00～10.0g样品，用氨水(1+1)调pH约7，加水定容至适当体积，离心沉淀，上清液经滤膜(0.45μm)过滤。③配制酒类：称取10.0g样品，放入小烧杯中，水浴加热除去乙醇，用氨水(1+1)调pH约7，加水定容至适当体积，经滤膜(0.45μm)过滤。(2)高效液相色谱分析参考条件①色谱柱：YWG—C18 4.6mm×150mm 5μm，或其他型号C18柱。②流动相：甲醇+乙酸铵溶液(0.02mol／L)(5+95)。③流速：1.0ml/min。④进样量：10μL。⑤检测器：紫外检测器，波长230nm，灵敏度0.2AUFS。根据保留时间定性，外标峰面积法定量。 1.2.4结果计算 式中：X—样品中苯甲酸或山梨酸的含量，g/kg； m1—进样体积中苯甲酸或山梨酸的质量，mg； V2—进样体积，ml； V1—样品稀释液总体积，ml； m—样品质量，g。2山梨酸及山梨酸钾的测定山梨酸与山梨酸钾是目前国际上公认的安全防腐剂,已被很多国家和地区广泛使用。我国《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760—1996)规定：山梨酸及山梨酸钾用于肉、鱼、禽类制品时的最大使用限量为0.075g/kg；水果、蔬菜及碳酸饮料为0.2g/kg,胶原蛋白肠衣、低盐酱菜类、蜜饯、果汁饮料、果冻等为0.5g/kg；果酒为0.6g/kg；塑料桶装浓缩果蔬汁、软糖、鱼干制品、即食豆制品、糕点、面包、乳酸菌饮料等为1.0g/kg。当山梨酸与山梨酸钾同时使用时，以山梨酸计，不得超过最大使用量。2.1.硫代巴比妥酸比色法2.1.1原理利用自样品中提取出来的山梨酸及其盐类，在硫酸及重铬酸钾的氧化作用下产生丙二醛，丙二醛与硫代巴比妥酸作用产生红色化合物，其红色深浅与丙二醛浓度成正比，并于波长530nm处有最大吸收，符合比尔定律，故可用比色法测定。2.1.2仪器和试剂(1)仪器① 721型分光光度计。②组织捣碎机。③10ml比色管。(2)试剂①硫代巴比妥酸溶液：准确称取0.5g硫代巴比妥酸于100ml容量瓶中，加20ml蒸馏水，然后再加入10ml氢氧化钠溶液(1mol/L)，充分摇匀。使之完全溶解后再加入11ml盐酸(1mol/L)，用水稀释至刻度。此溶液要在使用时新配制，最好在配制后不超过6h内使用。②重铬酸钾-硫酸混合液：以0.1mol/L重铬酸钾和0.15mol/L硫酸以1：1的比例混合均匀配制备用。③山梨酸钾标准溶液：准确称取250mg山梨酸钾于250ml容量瓶中，用蒸馏水溶解并稀释至刻度，使之成为1mg/ml的山梨酸钾标准溶液。④山梨酸钾标准使用溶液：准确移取山梨酸钾标准溶液25ml于250ml容量瓶中，稀释至刻度，充分摇匀，使之成为0.1mg/ml的山梨酸钾标准使用溶液。2.1.3操作步骤(1)样品的处理 称取100g样品，加蒸馏水200ml，于组织捣碎机中捣成匀浆。称取此匀浆100g，加蒸馏水200ml继续捣碎1min，称取10g于250ml容量并中定容摇匀，过滤备用。（2）山梨酸钾标准曲线的绘制 分别吸取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml山梨酸钾标准使用溶液于200ml容量瓶中，以蒸馏水定容(分别相当于0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg/ml的山梨酸钾)。再分别吸取2.0ml于相应的10ml比色管中，加2.0ml重铬酸钾-硫酸溶液，于100℃水浴中加热7min，立即加人2.0ml硫代巴比妥酸溶液，继续加热l0min，立即取出迅速用冷水冷却，在分光光度计上以530nm测定吸光度，并绘制标准曲线。(3)样品的测定 吸取样品处理液2ml于10ml比色管中，按标准曲线绘制的操作程序，自“加2.0ml重铬酸钾-硫酸溶液”开始依次操作，在分光光计530nm处测定吸光度，从标准曲线中查出相应浓度。 2.1.4结果计算式中： X1—样品中山梨酸钾的含量，g/kg； X2—样品中山梨酸的含量，g/kg； c—试样液中含山梨酸钾的浓度，mg/ml； m—称取匀浆相当于试样的质量，g； 2—用于比色时试样溶液的体积，ml； 250—样品处理液总体积，ml 1.34—山梨酸钾换算为山梨酸的系数。2.2.紫外分光光度法2.2.1原理样品经氯仿(三氯甲烷)提取后，再加人碳酸氢钠，使山梨酸形成山梨酸钠而溶于水溶液中。纯净的山梨酸钠水溶液在254nm处有最大吸收，经紫外分光光度计测定其吸光度后即可测得其含量。2.2.2仪器和试剂(1)仪器①紫外分光光度计。②组织捣碎机。(2)试剂①三氯甲烷：以三氯甲烷体积50％的碳酸氢钠(0.5mol/L)提取2次，而后以无水硫酸钠干燥，过滤备用。②0.5mol/L碳酸氢钠：称取21g碳酸氢钠于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解，移至500ml容量瓶中加水定容至刻度。③0.3mol/L碳酸氢钠。④山梨酸标准溶液：准确称取250mg山梨酸，用0.3mol/L的碳酸氢钠定容至250ml⑤山梨酸标准使用液：准确吸取山梨酸标准溶液25.00ml，用0.3mol/L的碳酸氢钠定容至250ml，即为100μg/ml的标准使用液。2.2.3 操作步骤(1)样品的处理：称取50.0g样品，加450ml蒸馏水于组织捣碎机中，粉碎5min，使成匀浆。称取10.0g此匀浆于50ml容量瓶中，并以水定容。移取l0ml此溶液于250ml分液漏斗中，用100ml氯仿提取1min。静置分层。将氯仿层分至125ml锥形瓶中，加人5g无水硫酸钠，振荡后静置。(2)标准曲线的绘制：分别吸取山梨酸标准使用液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于100ml容量瓶中，用0.3mol/L碳酸氢钠定容(分别相当于0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg/ml的山梨酸)。于紫外分光光计中254nm处测定吸光度，以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。(3)样品的测定：移取样品氯仿提取液50ml于125ml分液漏斗中，用25ml碳酸氢钠(0.3mol/L)提取1min。静置分层后，小心弃去氯仿层。将碳酸氢钠提取液于紫外分光光计中254nm处测定吸光度。从标准曲线上查出相应的山梨酸含量。2.2.4结果计算式中：X—山梨酸的含量。g/kg；m1—试液中山梨酸的含量，mg/ml； V1—试样碳酸氢钠提取液总量，ml； V2—吸取试样氯仿提取液体积，ml； V3—试样氯仿提取液总体积，ml； m—用于测定的试样水提取液相当于样品的质量，g。2.3.气相色谱法2.3.1原理样品经酸化后，用乙醚提取山梨酸和苯甲酸，再用带氢火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分离测定，然后与标准系列进行比较定量。2.3.2仪器和试剂(1)仪器 气相色谱仪(具有氢火焰离子化检测器)。(2)试剂①乙醚：不含过量氧化物。②石油醚：沸程30～60℃。③盐酸。④无水硫酸钠。⑤盐酸(1：1)：取100ml盐酸，加入稀释至200ml。⑥氯化钠的酸性溶液(40g/L)：于氯化钠溶液(40g/L)中加少量盐酸(1：1)，使之酸化。⑦山梨酸和苯甲酸标准储备液：准确称取山梨酸和苯甲酸各0.2000g，置于100ml容量瓶中，用石油醚-乙醚(3：1)混合溶剂溶解后，稀释至刻度，1ml此溶液相当于200mg山梨酸或苯甲酸。⑧山梨酸和苯甲酸的标准使用液：吸取适量的山梨酸和苯甲酸的标准溶液，以石油醚-乙醚(3+1)混合溶剂稀释至每毫升相当于50、100、150、200、250mg山梨酸或苯甲酸。2.3.3操作步骤 (1)样品的处理 称取2.50g事先混合均匀的样品，置于25ml带塞量筒中，加0.5ml盐酸(1：1)酸化，依次用15ml和10ml乙醚提取，每次振摇1min后，将上层乙醚提取液吸人另一个25ml带塞量筒中，合并乙醚提取液。用3ml氯化钠的酸性溶液(40g/L)洗涤2次，静置15min，用滴管将乙醚层通过无水硫酸钠滤人25ml容量瓶中，加乙醚至刻度，混匀。准确吸取5ml乙醚提取液于5ml带塞刻度试管中，置于40℃水浴上挥干，加入2ml石油醚-乙醚(3：1)混合溶剂溶解残渣，备用。 (2)色谱参考条件①色谱柱：玻璃柱，内径为3mm，长为2m，内装涂以5％(质量分数) DEGS+l％(质量分数)H3 PO4固体液的60～80目ChromosoybWAW。②载气：载气为氮气，气流速度为50ml/min(氮气、空气及氢气按各仪器型号不同，选择各自的最佳比例条件)。③温度：进样品温度为230℃，检测器温度为230℃，柱温为170℃。(3)测定①进样2μL标准系列中各浓度的标准使用液于气相色谱仪中，测得不同浓度的山梨酸和苯甲酸的峰高。以浓度为横坐标，以峰高值为纵坐标，绘制标准曲线。山梨酸和苯甲酸的标准色谱图如图8—1所示，山梨酸的保留时间为173s，苯甲酸的保留时间为368s。图8—1山梨酸和苯甲酸标准色谱图②进样2μL样品溶液，测得峰高，然后与标准曲线比较定量。2.3.4结果计算 式中：X—样品中山梨酸或苯甲酸的含量，g/kg； m1—测定用样品溶液中山梨酸或苯甲酸的质量，μg； V1—加入石油醚-乙醚(3+1)混合溶剂的体积，ml： V2—测定时进样的体积，μL； m2—样品的质量，g； 由测得苯甲酸的量乘以1.18，即为样品中苯甲酸钠的含量。3过氧乙酸的测定过氧乙酸又叫过醋酸，是过氧化氢、醋酸与微量硫酸的混合水溶液。过氧乙酸对细菌繁殖体、芽孢、真菌、病毒都具有高度杀灭效果，是一种广谱、高效、速效的杀菌剂。3.1原理在酸性条件下，过氧乙酸中含有的过氧化氢(H2O2)用高锰酸钾标准滴定溶液滴定，然后用间接碘量法测定过氧乙酸的含量。 3.2仪器和试剂3.2.1仪器①250ml碘量瓶。②50ml棕色滴定管。③分析天平。3.2.2试剂①硫酸溶液(1+9)：量取1ml硫酸与9ml水混合。②碘化钾溶液(100g/L)。③硫酸锰溶液(100g/L)。④钼酸铵溶液(30g/L)。⑤高锰酸钾标准溶液[c(1/5KMnO4)=0.1mol/L]。⑥硫代硫酸钠标准滴定溶液[c(Na2S2O3)－0.1mol/L]。⑦淀粉指示液(10g/L)。3.3操作步骤称取约0.5g试样(或称取相当于含过氧乙酸约0.07g的试样)，精确至0.000 1g，置于预先盛有50ml水，5ml硫酸溶液和3滴硫酸锰溶液并已冷却至4℃的碘量瓶中，摇匀，用高锰酸钾标准溶液滴定至溶液呈稳定的浅粉色。随即加入10ml碘化钾溶液和3滴钼酸铵溶液，轻轻摇匀，于暗处放置5～10min，用硫代硫酸钠标准滴定溶液滴定，接近终点时(溶液呈淡黄色)加入1ml淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并保持30s不变为终点。记录消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积数。3.4结果计算 式中：X—过氧乙酸的质量分数，％；V—消耗的硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积，ml；c—硫代硫酸钠标准滴定溶液浓度，mol/L；m—试样的质量，g；M—与1.00ml硫代硫酸钠标准滴定溶液(c=1.000mol/L)相当的过氧乙酸的摩尔质量(M=0.03803g/mol)；取2次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果之差不得大于0.3%。4对羟基苯甲酸酯类的测定对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲丁酯，又名尼泊金乙酯、尼泊金丙酯和尼泊金丁酯。三者均为苯甲酸的衍生物。我国《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760—1996)规定：对羟基苯甲酸乙酯、丙酯和丁酯用于果蔬保鲜时的最大使用量(以对羟基苯甲酸计)为0.012g/kg；食醋0.10g/kg；碳酸饮料、蛋糕、蛋黄馅0.20g/kg；果汁饮料、果酱(不包括罐头)、酱油等为0.25g/kg；糕点馅为0.5g/kg。4.1.高效液相色谱法4.1.1原理样品中对羟基苯甲酸酯类，用乙腈提取，经过滤后进高效液相色谱仪进行测定，与标准比较，以保留时间定性，以峰高定量。4.1.2仪器和试剂(1)仪器①组织捣碎机。②离心机。③高效液相色谱仪(带紫外检测器)。(2)试剂①乙腈。全玻蒸馏。②对羟基苯甲酸酯类的标准溶液：称取50mg相应的对羟基苯甲酸酯，溶于100ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，混匀。分别吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml上述溶液，置于100ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度。该系列标准溶液中每毫升分别含5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μg的对羟基苯甲酸酯。4.1.3操作步骤(1)样品提取 称取约20g样品，粉碎。准确称取2g样品于10ml具塞离心管中，加入5.0ml乙腈，塞上塞子。振摇30s后，于500r/min离心5min，将上清液转移至25.0ml容量瓶中，重复操作3次，用乙腈稀释至刻度。用0.45μm滤膜过滤，供色谱测定用。(2)高效液相色谱分析参考条件①色谱柱：μBondapak C18 30cm×4.6mm。②流速：1.4ml/min。③检测波长：254nm。(3)测定分别进样10μL对羟基苯甲酸酯标准系列中各浓度的标准溶液，以浓度为横坐标，峰高为纵坐标绘制标准曲线。同时进样10μL样品溶液，与标准曲线比较定性、定量。对羟基苯甲酸甲酯、丙酯的保留时间分别约为4.2min和7.6min，其标准色谱图如图8-2所示。4.1.4结果计算 式中：X—样品中对羟基苯甲酸酯类的含量，mg/g m1—被测样品液中对羟基苯甲酸酯类的含量，μg/ml m—样品的质量，g；25—样品溶液的体积，ml。4.2.气相色谱法4.2.1原理样品经酸化后，对羟基苯甲酸酯类用乙醚提取浓缩后，用具氢火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分离测定，与标准系列比较定量。4.2.2仪器和试剂(1)仪器①K-D浓缩器。 ②气相色谱仪：具氢火焰离子化检测器。(2)试剂①乙醚，重蒸。②无水乙醇。③无水硫酸钠。 ④饱和氯化钠溶液。⑤碳酸氢钠溶液(1g/100ml)。⑥盐酸(1+1)：量取50ml盐酸，用水稀释至100ml。⑦对羟基苯甲酸乙酯、丙酯的标准溶液：准确称取对羟基苯甲酸乙酯、丙酯各0.050g，溶于50ml容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，该溶液每毫升相当于lmg对羟基苯甲酸乙酯、丙酯。⑧对羟基苯甲酸乙酯、丙酯的使用溶液：吸取适量的对羟基苯甲酸乙酯、丙酯标准溶液，用无水乙醇分别稀释至每毫升相当于50、100、200、400、600、800μg的对羟基苯甲酸乙酯、丙酯。4.2.3操作步骤(1)样品的提取与净化。①酱油、醋、果汁等：吸取5g预先均匀化的样品于125ml分液漏斗中，加入1ml盐酸(1+1)酸化，l0ml饱和氯化钠溶液，摇匀，分别以75、50、50ml，乙醚提取三次，每次2min，放置片刻，弃去水层，合并乙醚层于250ml分液漏斗中，加10ml饱和氯化钠溶液洗涤一次，再分别以碳酸氢钠溶液(1g/100ml)30、30、30ml洗涤3次，弃去水层。用滤纸吸去漏斗颈部水分，塞上脱脂棉，加10g无水硫酸钠于室温放置30min，在K—D浓缩器上浓缩近干，用吹氮除去残留溶剂。用无水乙醇定容至每毫升含1mg对羟基苯甲酸乙酯、丙酯供气相色谱用。②果酱：称取5g预先均匀化的样品于100ml具塞试管中，加入1ml盐酸(1+1)，10ml饱和氯化钠溶液，摇匀，用50、30、30ml乙醚提取3次，每次2min，用吸管转移乙醚至250ml分液漏斗中，以下按上法操作。(2)气相色谱分析参考条件。①色谱柱：内径3mm，长2.6m，内涂以3%SE-30/Chromoserb W AWI)-MCS，60～80目。②检测温度：柱温170℃，进样口和检测器温度220℃。③气体流速：氮气，40ml/min；氢气，50ml/min；空气，500ml/min。(3)测定 进样1μL对羟基苯甲酸乙酯、丙酯标准系列中各浓度标准使用液于气相色谱仪中，测定不同浓度对羟基苯甲酸乙酯、丙酯的峰高。以浓度为横坐标，峰高为纵坐标绘制标准曲线。同时进样1μL样品溶液，测定峰高并与标准曲线比较定量。4.2.4结果计算 式中：X—样品中对羟基苯甲酸酯类的含量，g/kg；A—测定样品中对羟基苯甲酸酯类的含量，μg；V1—样品制备液体积，ml；V2—样品进样体积，μL；m—样品质量，g。
沉淀DNA时，用到的醋酸铵溶液pH在8左右，略微碱性。
DNA的沉淀：
采用无水乙醇沉淀DNA是实验室的常用方法。
在DNA溶液中，DNA分子与水分子呈水合状态，当加入乙醇后，乙醇可以夺去DNA分子周围的水，从而使得DNA分子失水而易于聚合。 乙醇的优点是可以任意比和水融合，而且不会和DNA发生化学反应，DNA分子在乙醇中能够稳定保存，因此可以作为沉淀DNA的良好试剂。
一般用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA,使乙醇最终含量为67%左右（关键）。当沉淀RNA时一般用2.5倍的体积。因此也可以用95%的乙醇等代替，但是此时终体积将会较大，且DNA在溶液中会有一定的损耗。因此当多次沉淀时，做好采取折中的方法，即初次用95%的乙醇沉淀后，之后采用无水乙醇代替。
另外也可以用0.6倍体积的异丙醇（IPA）沉淀。与乙醇相比，异丙醇比较疏水，极性较弱，因此盐离子会与DNA分子共沉淀，不利于去盐，但却因此可以去除蛋白质、糖等杂质（高浓度的盐可以使糖存在于溶液中从而去除）。而乙醇可以有效去除盐离子。另外，乙醇易挥发，所以通常会先用异丙醇沉淀，再用乙醇多次洗去盐。
沉淀时间一般是15-30分钟即可。
沉淀过程中一般会加入醋酸钠或氯化钠，因为在pH为8时，DNA分子带负电荷，盐释放的正电荷可以与其反应，从而促进其聚合沉淀。当然盐离子浓度也不可太高，否会影响后续反应，如酶切等，故得多次脱盐。
一、实验原理
从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。
盐溶法是提取DNA的常规技术之一。在制备核酸时，通常是用研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。利用DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液而RNA能溶于0.14mol/L 的NaCl溶液这一性质可以将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品破碎细胞液中分开。
分离得到核蛋白后，还需进一步将蛋白等杂质除去。去除蛋白的方法有 3种：① 用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除 去变性蛋白质。用这种方法处理时，蛋白质停留在水相和氯仿相中间，而 DNA则溶于上层水相，用两倍体积95%乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。② 用 十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，从而使其与核酸分离，也可 从材料中直接提取出DNA。③ 用苯酚处理，然后离心分层，一样可以将DNA 与蛋白质分离开来。这时DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内， 吸出上层水相，加入两倍体积的95%乙醇即可得到白色纤维状DNA沉淀。反复 使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去， 得到较纯的DNA制品。本实验采用CTAB法从植物幼苗中提取基因组DNA。
为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA杂质，可用RNA酶进行处理。另外， 生物材料中还含有大量的脂肪物质和多糖，这些物质在用盐溶液分离核蛋白 和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可被除去。
核酸纯化目标：纯化后的核酸样品中不应该存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的重金属离子；其它生物大分子物质如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；排除RNA分子污染。
操作注意事项：尽量简化操作步骤，缩短提取过程减少各种有害因素对核酸的破坏；减少化学因素对核酸的降解，一般pH4-10；减少物理因素如机械切力、高温对核酸的降解。
提取步骤：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质、多糖和脂类分子，去除RNA，去除盐类、有机溶剂等杂质。方案：视具体的生物材料和待提取的核酸分子特点而定。
二、仪器设备
高速离心机、水浴锅、电子天平、冰箱
三、试剂
① 2×CTAB提取液(内含2%CTAB、1.4mol/L NaCl、25mmol/L -巯基乙醇和0.1mol/LTris-HCl，pH8.0)：取2g CTAB、8.18g NaCl、0.74gEDTA、0.2% -巯基乙醇，加双蒸水(ddH2O)定容到100ml；EDTA-Na2.2H2O，加入10ml 1mol/L的Tris-HCl(pH8.0)和0.2ml
② 氯仿:异戊醇(24:1)
③ 洗涤缓冲液(70%乙醇，内含10mmol/L乙酸铵)：取70mL无水乙醇和0.077g乙酸铵，加双蒸水定容到100ml；
④ 无水乙醇、70%乙醇；
⑤ TE缓冲液：内含10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH8.0
四、操作步骤
①将材料在液氮中研磨成粉，迅速分装于Eppendorf 管中，加入0.7ml 60℃水浴中预热的2×CTAB提取液和20ul b-巯基乙醇，轻轻转动使之混匀；
② 样品于60℃温浴45min，每5min将Eppendorf管上下颠倒混匀；
③ 加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)，轻轻颠倒混匀，室温下放置5min，6000g离心10min。
④ 上层溶液转入另一个干净Eppendorf 管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，混匀，6000g转离心5min；
⑤ 重复步骤④ 2-3次，直至无白色界面物质 ；
⑥ 将上层水相吸入另一干净的离心管中，加入2/3体积的预冷异丙醇，轻轻混匀使核酸沉淀下来。在-20℃下放置30min，4℃、10000g转离心10min，弃上清液；
⑦ 沉淀用加入1ml洗涤缓冲液，10000g离心1-2min；
⑧ 沉淀用无水乙醇洗1次， 10000g离心1-2min
一、SDS-PAGE的工作原理
SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是实验室常用的基于蛋白质分子量对蛋白质进行分离的方法。
SDS-PAGE根据蛋白质的分子量来分离蛋白质，基于施加电场的作用下通过筛分基质（凝胶）产生的迁移率。
1. 使蛋白质的迁移率与分子量成正比
任何带电物种在电场中的运动都是由其净电荷、分子半径和外加电场的大小决定的。但自体折叠的蛋白质所带来的问题是，它们的净电荷和分子半径都不依赖于分子量。相反，它们的净电荷由氨基酸组成决定，即蛋白质中的氨基酸正、负电荷之和以及蛋白质三级结构的分子半径决定。
因此，在它们的原生状态下，具有相同分子量的不同蛋白质在电场中以不同的速度迁移，这取决于它们的电荷和三维形状。
为了根据分子量在电场中分离蛋白质，我们需要将蛋白质还原为线性分子，破坏三级结构，并以某种方式掩盖蛋白质的固有净电荷。这就是SDS的应用来源。
2. SDS的作用
SDS是一种存在于SDS-PAGE缓冲液中的洗涤剂，在这种缓冲液中，伴随着一点煮沸和还原剂（通常是DTT或β-ME来分解蛋白质-蛋白质二硫键），它会破坏蛋白质的三级结构。这将折叠的蛋白质转变为线性分子。
SDS利用均匀的负电荷覆盖蛋白质，从而掩盖R-基团的固有电荷。SDS与线性蛋白（约1.4g SDS/1g蛋白）的结合相当均匀，这意味着蛋白质的电荷现在与它的分子量近似成正比。
SDS也存在于凝胶中，以确保一旦蛋白质被线性化，电荷被掩盖，但蛋白质在整个电泳分离过程中仍保持这种方式（与分子量成正比的迁移）。
SDS包被的蛋白在凝胶中的迁移率的主要决定性因素是它的分子半径。
SDS包被的蛋白已被证明是线性分子，18Å宽，长度与分子量成正比，因此分子半径（它们在凝胶中的迁移率）由蛋白质的分子量决定。由于SDS包被的蛋白质具有相同的电荷质量比，因此不存在基于电荷的差异迁移。
3. 凝胶基质
在外加电场中，SDS处理后的蛋白质现在将以不同分子量产生的不同速率向阴极移动。这些不同的迁移率将被凝胶基质的高摩擦环境扩大。
SDS-PAGE的凝胶基质是聚丙烯酰胺，它具有化学惰性，并且至关重要的是可以很容易地在各种浓度下制备不同的孔径，可以产生不同的分离特性。
4. 不连续缓冲体系与浓缩凝胶
为了通过凝胶将电流从阳极传递到阴极，需要缓冲液。我们通常使用不连续Laemmli缓冲系统。 “不连续”仅仅意味着凝胶和电泳槽的缓冲液是不同的。
通常，该系统采用pH6.8的Tris-HCl缓冲液配置的浓缩胶，pH8.8的Tris-HCl缓冲液配置的分离胶以及pH8.3的电极缓冲液，浓缩胶具有低浓度的丙烯酰胺，分离胶具有更高的浓度，能够延缓蛋白质的运动。
那些不同的pH是怎么回事儿？甘氨酸可以以三种不同的电荷状态存在，正电荷、中性电荷或负电荷，这取决于pH值。用不同的缓冲液控制甘氨酸的电荷状态是整个浓缩胶的关键。
同时，这也是浓缩胶的工作原理，当电源接通时，在pH 8.3电极缓冲液中带负电荷的甘氨酸离子被迫进入浓缩胶（pH为6.8），在这种环境中，甘氨酸主要转变为两性离子（中性电荷）状态。电荷的这种损失使它们在电场中移动得非常缓慢。
另一方面，氯离子（来源于Tris-HCl）在电场中移动得很快，它们形成一个离子锋，在甘氨酸之前迁移。从Tris平衡离子（正朝阴极移动）中分离出的Cl-形成一个具有陡峭电压梯度的狭窄区，该电压梯度将甘氨酸往后拉，导致迁移离子产生两个狭长迁移前沿，高流动性的Cl-前沿，然后是较慢的中性甘氨酸前沿。
所有凝胶中的蛋白质样本的电泳迁移率处在甘氨酸和Cl-迁移率的极值之间。因此当两个前沿进入样品孔时，蛋白质浓缩到Cl-和甘氨酸之间的狭窄区。
5. 当蛋白质离开浓缩胶
浓缩胶迁移过程结束后，进入分离胶，pH转变为8.8，在该pH下，甘氨酸分子大多带负电，迁移速度比蛋白质快得多。因此，甘氨酸加速通过蛋白质，而蛋白质留在分离胶中。
结果是，蛋白质在浓缩和分离胶的界面处被浓缩到非常窄的带中，并且由于分离胶中丙烯酰胺浓度的增加，这减缓了蛋白质根据其分子量大小的运动，分离开始。
6. 浓缩胶起到了什么作用
浓缩胶胶孔约1cm深，通常需要填充足够的蛋白在凝胶上。因此，缺少浓缩胶的情况下，样本则置于分离胶上，而样本条带将达到1cm深。
与浓缩成一条带同时进入分离胶相比，没有浓缩胶意味着蛋白质在不同时间分别进入浓缩胶而形成弥散条带。
因此，浓缩胶确保蛋白质同时达到分离胶，分子量相同的蛋白质则形成紧密条带进行迁移。
7. 蛋白质分离
一旦蛋白质进入分离胶，则因高分子量蛋白质通过多孔丙烯酰胺凝胶的速度比低分子量蛋白慢而被分离。凝胶孔的大小可以根据丙烯酰胺浓度和蛋白质分子量大小而改变。
对于更宽的分离范围，或对于难以分离的蛋白质，可以使用具有丙烯酰胺浓度增加的梯度凝胶。
二、蛋白酶和蛋白酶抑制剂工作原理
1. 蛋白酶：好的，坏的，水解的
所有生物体都有蛋白水解酶和磷酸化酶，包括：你、我、甚至棉铃虫。虽然蛋白酶涉及到从宿主防御到伤口愈合乃至病毒复制的各个方面，但根据蛋白酶活性位点的构成和与目标肽键的相互作用，可以大致分为两大类。
1）通过丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸在其活性部位的亲核活化水解键；
2）天冬氨酸、谷氨酸和金属蛋白酶，利用水本身进行水解。
2. 抑制剂：你不能只靠一种
化学分解、碰撞摩擦、超声波和冻融，把整个系统都弄得乱七八糟。没有肽键是安全的！
外肽酶攻击氨基酸链的末端，而内肽酶水解它们的内部连接。激酶磷酸化和去磷酸化随意。
没有一种抑制剂能清除所有蛋白酶，阻止每一个磷酸化事件。它需要一种“鸡尾酒”的方法来阻止蛋白质分解。蛋白酶抑制剂在胁迫下可以不可逆、可逆和可逆地作用，可以是任何小分子，如氟化钠，也可以是进化过程中自身微生物抑制剂多肽类似物。它们可以与底物竞争活性位点，有时会破坏或者囤积蛋白酶功能所需的珍贵阳离子。
竞争性抑制剂的作用是以类似底物的方式与活性位点结合通过修饰阻止蛋白酶，例如，酯化反应。许多大的竞争抑制剂通过增强亲和性和特异性结合。
竞争性的阻碍因素。因素种类繁多，从抑肽酶，一种6kDa的多肽丝氨酸蛋白酶（在极端的pH值是可逆的），到正钒酸钠，一种抑制易受骗蛋白-酪氨酸磷酸酶的小分子。
螯合剂利用它们对金属离子的增强亲和力与金属离子螯合，而不能与其他成员发生反应。金属蛋白酶的活性部位需要锌、镁、锰、钙，甚至钴来活化水，水解肽键，以达到水解目的。把锌和乙二胺四乙酸（EDTA）结合起来，把钙和乙二胺四乙酸（EGTA）结合起来，金属蛋白酶就不再有活性了。
三、琼脂糖凝胶不是通过聚合形成的
1.琼脂糖凝胶不是通过聚合形成的
聚丙烯酰胺主要用于SDS-PAGE，是由丙烯酰胺单体和双丙烯酰胺单体组成的基质。它的优点是化学惰性，因此在蛋白质通过时不会与蛋白质发生相互作用，而且它可以用不同的孔径轻松地、重复地制造出具有不同分离特性的凝胶。
聚合反应，是自由基催化的乙烯基加成反应。该反应由TEMED引发，引发过硫酸铵（APS）自由基的生成。自由基将电子转移到丙烯酰胺/双丙烯酰胺单体上，使它们呈放射状并相互作用形成聚丙烯酰胺链。
在缺失双丙烯酰胺的情况下，丙烯酰胺会聚合成长链，而不是多孔凝胶。双丙烯酰胺交联丙烯酰胺链，是形成多孔凝胶基质的原因。通过改变丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例，可以控制交联的量，决定凝胶的孔径和分离特性。
2. 琼脂糖凝胶形成
琼脂糖—凝胶琼脂的主要成分，可以从某些海藻中分离出来—本身就是一种聚合物。但是，聚合不是琼脂糖凝胶形成的机制。
在化学上，琼脂糖是一种多糖，其单体单元是D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳吡喃糖的二糖。
在低于35℃的水溶液中，这些聚合物链通过非共价键相互作用（像氢键）和静电相互作用被保持在多孔凝胶结构中。
加热溶液会破坏这些非共价相互作用，并使链脱离。
当溶液冷却时，这些非共价相互作用被重新建立并且形成凝胶。
所以，琼脂糖（和琼脂）凝胶是通过氢键和静电相互作用而不是通过聚合形成的。
四、乙醇是如何沉淀DNA和RNA的
乙醇沉淀法是一种在水溶液中浓缩和脱盐核酸（DNA或RNA）的常用方法。最基本的步骤是在水溶液中加入盐和乙醇，迫使核酸从溶液中沉淀出来。
通过离心分离沉淀的核酸。核酸颗粒在70%的冷乙醇中洗涤，进一步离心后，干燥去除乙醇，核酸颗粒被重新悬浮在干净的缓冲液中。
1. 关于溶解度
首先我们需要知道为什么核酸能溶于水。水是一个极性分子，由于非共享的电子对，它在氧原子附近有部分负电荷，在氢原子附近有部分正电荷。
由于这些电荷，极性分子，如DNA或RNA，可以与水分子静电作用，使它们很容易溶于水。
因此，极性分子可以被描述为亲水性分子，而非极性分子是疏水性的，它们不易与水分子相互作用。
核酸是亲水性的，这是由于糖磷酸主链上带负电荷的磷酸（PO3-）基团。
2. 盐的作用
盐在实验中的作用是中和糖磷酸骨架上的电荷。一种常用的盐是醋酸钠（乙酸钠），在溶液中，乙酸钠分解成NA+和[CH3COO]-。
带正电的钠离子中和了核酸上PO3-基团的负电荷，使分子的亲水性大大降低，因此在水中的溶解度大大降低。
3. 乙醇的作用
溶液中Na+离子与PO3-离子之间的静电吸引受库仑定律的支配，受溶液介电常数的影响。
水具有很高的介电常数，这使得Na+和PO3-很难结合在一起。
另一方面，乙醇具有较低的介电常数，使得Na+更容易与PO3-相互作用，屏蔽其电荷，使核酸不太亲水，导致其从溶液中脱落。
4. 温度的作用
低温（如-20或-80℃）下保存核酸/盐/乙醇混合物用于沉淀核酸通常在实验中认为是必要的。
然而，这不是必需的，因为浓度低至20ng/mL的核酸在0-4℃时会沉淀，因此在冰上孵育15-30分钟就足够了。
5. 70%无水乙醇洗涤步骤
把沉淀的DNA颗粒中的残留盐洗掉。
6. 关于核酸沉淀的一些建议：
a. 盐的选择
使用醋酸钠（0.3M终浓度，pH值5.2）进行常规DNA沉淀；
对于含有SDS的DNA样品，使用氯化钠（终浓度为0.2M），因为NaCl使SDS在70%乙醇中保持可溶性，因此不会与DNA一起沉淀；
对于RNA，使用氯化锂（0.8M终浓度）。这是因为2.5-3体积的乙醇应用于RNA沉淀，而LiCl比NaAC更易溶于乙醇，因此不会沉淀，但要注意氯离子会抑制蛋白质合成和DNA聚合酶，因此LiCl不适合用于体外翻译或反转录RNA的制备。在这种情况下，使用NaAC。
使用乙酸铵（2M终浓度）去除dNTPs，但不用于制备应用于T4多核苷酸激酶反应的DNA，因为铵离子抑制酶活性。
提高低浓度或小核酸片段沉淀的产率（<100个核苷酸）
a. 将MgCl2添加至最终浓度0.01M ；
b. 将离心前在冰上孵育的时间增加到1小时。
方法提要
在稀硫酸溶液［(1+9)～(3+7)硫酸溶液最适宜］中，使铅呈硫酸盐状态析出，用乙酸铵溶液溶解硫酸铅，加入重铬酸钾溶液使铅生成铬酸铅沉淀，然后以碘量法完成测定。反应式如下:
2Pb(C2H3O2)2+Cr2O2-7+H2O→2PbCrO4+2H++2C2H3O-2
2PbCrO4+2H+→2Pb2++Cr2O72-+H2O
Cr2O2-7+6I-+14H+→2Cr3++3I2+7H2O
I2+2S2O2-3→2I-+S4O2-6
本法是测定铅的经典方法，当试样不含钡时，能得到准确的结果。本法适用于0.5%以上铅的测定。
试剂
盐酸。
硝酸。
硫酸。
乙酸铵溶液称取350gNH4Ac溶于水中，加入25mLHAc，用水稀释至1000mL。
乙酸铵洗液(2+98)。
盐酸-氯化钠混合溶液称取300gNaCl溶于1250mL水中，加入100mLHCl，搅匀。
硫代硫酸钠标准溶液c(Na2S2O3)=0.025mol/L配制方法见本章41.3.2铅的钡铬酸铅容量法测定。
标定:吸取20.00mL铅标准溶液(1.00mg/mL)置于100mL烧杯中，加入10mLHCl蒸发至近干，再加5mLHCl重复蒸发至近干。以下按试样分析步骤操作，由消耗的硫代硫酸钠标准溶液的体积以及吸取铅标准溶液的浓度和体积，计算硫代硫酸钠标准溶液对铅的滴定度(mg/mL)。
其他试剂与本章41.3.2铅的钡铬酸铅容量法测定相同。
分析步骤
称取0.1～0.5g(精确至0.0001g)试样置于150mL烧杯中，用水润湿，加入10mLHCl，盖上表面皿，置于电热板上加热。10min后，再加5mLHNO3，加热至试样完全分解。洗净并移去表面皿，蒸发至体积为3～5mL，取下冷却。加入10mL(1+1)H2SO4，继续加热至冒浓厚白烟。取下冷却，用水冲洗杯壁，重新加热至冒浓厚白烟。冷却后加100mL水，煮沸，使盐类溶解。在冷水中冷却后，放置2～3h。用慢速滤纸过滤，沉淀用冷的(2+98)H2SO4洗涤至无铁离子(用硫氰酸钾溶液检验)。
将沉淀及滤纸置于原烧杯中，加入50mLNH4Ac溶液，置于电热板上加热至沸。用定性滤纸过滤，并用热的乙酸铵洗液洗涤残渣10次以上(用硫化氢水检验至无铅离子)。滤液中加入10mLK2Cr2O7饱和溶液，煮沸，使黄色沉淀转化为橙色(开始形成的铬酸铅沉淀极细，不易过滤，加热煮沸可转化为较大结晶)。静置2h(如铅量少，应放置过夜)。用慢速滤纸过滤，用热乙酸铵洗液洗涤至无铬酸根离子为止。
沉淀用热的盐酸-氯化钠混合溶液溶解于原烧杯中，继续用此混合溶液洗涤滤纸至无铬酸根离子存在，再用水洗两次。所用的混合溶液不应少于50mL(如用量不足，在加入碘化钾溶液后，会析出金黄色碘化铅沉淀，影响滴定。如发现此现象，可再加入盐酸-氯化钠溶液，使沉淀溶解)，烧杯中的溶液用水稀释至100mL，加入10mLKI溶液，放置片刻，用硫代硫酸钠标准溶液滴定至溶液呈浅黄色。加入1mL淀粉溶液，继续滴定至蓝色消失为终点。
铅含量的计算公式同式(41.1)。
注意事项
1)本法能将铅与大多数金属离子如铁、铜、锌、钴、镍等分离。大量铁的存在会沾污硫酸铅沉淀。当用乙酸铵溶液提取并进行沉淀铬酸铅时，铁水解成胶状氢氧化铁而与铬酸铅沉淀在一起，以后都能被盐酸-氯化钠混合溶液所溶解，因此对后续碘量法测定铅时有影响。有盐酸和硝酸存在，使硫酸铅沉淀不完全，因此必须经过二次硫酸冒烟驱尽剩余的盐酸及硝酸。
2)在乙酸铵溶液中，用重铬酸钾沉淀铅时，溶液pH以3～4为最适宜。pH大于5.4时，部分铅沉淀为PbCrO4·K2CrO4复盐在近中性(pH6.6～7.4)的溶液中铅全部成PbCrO4·K2CrO4复盐沉淀，而在强酸性溶液中铬酸铅沉淀不完全。
3)当试样溶液含钡量大于10mg时，钡与铅在过量的硫酸存在下结合成一种极稳定的 以后不易被乙酸铵溶液提取完全。用乙酸铵溶液提取铅的完全程度随Ba/Pb的比值增加而显著降低。当Ba/Pb等于0.1时，铅的提取率为94.5%等于0.5时，铅的提取率为75%等于2.0时，铅的提取率仅为19.5%而在比值等于10时，铅就完全不能被乙酸铵溶液所提取。另一方面，硫酸钡却部分地被乙酸铵溶液提取，与铅一起为重铬酸钾所沉淀，使沉淀结果偏高。
4)铋存在时能部分地水解生成碱式硫酸铋而和硫酸铅共沉淀，以后被乙酸铵提取溶解后，在用重铬酸钾溶液沉淀铅时，也能生成(BiO)2Cr2O7黄色沉淀。因此，在铬酸铅沉淀过滤前可加入2g柠檬酸(溶解于少量热水中)，重铬酸铋立刻溶解，可立即过滤分离。锑的情况与铋相似。
5)钼、钨、铊、银和锰等含量较高时，对测定有影响。
王海龙杨静祁振国岳秀兰
(包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古包头014010；赤峰市第一医院’)
中图分类号(}so3 文献标识码A 文章编号1006—740X(2006)02—0231一o3
蛋白质组学是后基因组时代的一个新领域，它通
过在蛋白质水平上对细胞或机体基因表达的整体蛋白
质的定量研究，来揭示生命的过程和解释基因表达控
制的机理⋯ 。蛋白质组学分为表达蛋白质组学(Ex·
pression Proteomies)和细胞图谱蛋白质组学(Cell Map
Pmteomies)，前者指细胞和组织表达的蛋白质的定量
图谱，它依赖二维凝胶电泳图谱和图像分析，它能在整
体蛋白质水平上研究细胞的通路，以及疾病、药物和其
它生物刺激所引起的紊乱，因此它可能发现疾病标志
和阐明生物通路；后者是指通过纯化细胞器或蛋白质
复合物，用质谱鉴定蛋白质组分，确定蛋白质和蛋白质
相互作用的亚细胞位置 】。9O年代以来随着人类基
因组计划的实施，引发了生物信息学(Bioinformaties)
的发展，使蛋白质分析发生了革命性的变化。现在将
高分辨2一维电泳、高灵敏度的生物质谱和快速增长
的蛋白质和DNA数据库三者结合起来，为高通量的蛋
白质组学(High throughout Proteomies)铺平了道路 。
这里主要介绍质谱技术在蛋白质组学中的应用。
收稿日期：2006-03-02
作者简介：王海龙(1951一)，男。大学，副教授。
l 质谱技术的发展历史
1．1 质谱的开发历史要追溯到2O世纪初，Thomson
创制的抛物线质谱装置，1919年Aston制成了第一台
速度聚焦型质谱仪，成为了质谱发展史上的里程碑。
最初的质谱仪主要用来测定元素或同位素的原子量，
随着离子光学理论的发展，质谱仪不断改进，其应用范
围也在不断扩大，到2O世纪5O年代后期已广泛地应
用于无机化合物和有机化合物的测定。现今质谱分析
的足迹已遍布各个学科的技术领域，在固体物理、冶
金、电子、航天、原子能、地球和宇宙化学、生物化学及
生命科学等领域均有着广阔的应用。质谱技术在生命
科学领域的应用更为质谱的发展注入了新的活力，形
成了独特的生物质谱技术。
1．2 基本原理质谱(Mass Spectrometry)是带电原
子、分子或分子碎片按质量的大小顺序排列的图像。
质谱仪是一类能使物质离化成离子并通过适当的电
场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与
否实现质量比分离，并检测强度后进行物质分析的仪
器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组
成 。
用于分析的样品分子在离子源中离化成具有不同
质量的单电荷分子和碎片离子，这些单电荷离子在加
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232 包头医学院学报 第22卷
速电场中获得相同动能并形成一束离子，进入由电场
和磁场组成的分析器，离子束中速度较慢的离子通过
电场后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角
速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大，速
度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们
的轨道便相交于一点。与此同时，在磁场中还能发生
质量的分离，这样就使具有同一质量比而速度不同的
离子聚焦在同一点上，不同质量比的离子聚焦在不同
的点上，其焦面接近于平面，在此处用检测系统进行检
测即可得到不同质量比的谱线，即质谱。通过质谱分
析，我们可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中
同位素构成和分子结构等多方面的信息 J。
2 质谱技术种类
2．1 电喷雾质谱技术(Electrospray ionization Mass
Spectrometry，ESI—MS) 是在毛细管的出口处施加一
高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化
成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强
度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷
的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进
入气相⋯ 。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子
而不是碎片离子，使质量电荷比降低到多数质量分析
仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分
析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电
荷数算出。电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多
种分离技术联合使用 j。
2．2 基质辅助激光解吸附质谱技术(Matrix Assisted
Laser Desorption／Ionization，MALDI) 基本原理是将
分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射
晶体时由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量
蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分
析物膨胀并进入气相。MALDI所产生的质谱图多为
单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的
质量有一一对应关系。MALDI产生的离子常用飞行
时间检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足
够，检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此质
谱很合适对蛋白质、多肽、核酸和多糖等大分子的研
究。
2．3 快原子轰击质谱技术(Fast Atom Bomebardment
Mass Spectrometry，FABMS) 一种软电离技术，是用快
速隋性原子射击存在于底物中的样品，使样品离子溅
出进入分析器，这种软电离技术适于极性强、热不稳定
的化合物的分析，特别适于多肽和蛋白质的分析研究。
FABMS只能提供有关离子的精确质量，从而可以确定
样品的元素组成和分子式。而FABMS—MS串联技术
的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息，从而
使其在生物医学分析中迅速发展起来 ]。
2．4 同位素质谱技术是一种开发和应用比较早的
技术，被广泛地应用于各个领域，但它在医学领域的应
用只是近近几年的事。由于某些病原菌具有分解特定
化合物的能力，该化合物又易于用同位素标示，人们就
想到用同位素质谱的方法检测其代谢物中同位素的含
量以达到检测该病原菌的目的，同时也为同位素质谱
在医学领域的应用开辟了一条思路。
3 电泳分离后凝胶上蛋白质的质谱鉴定
电泳分离后凝胶上的蛋白质，先用适当的蛋白内
切酶酶切成肽段，再用质谱鉴定。现有四种制样方法：
3．1 凝胶内酶切凝胶内酶切的灵敏度高，是当前广
泛采用的样品制备方法。最常用的蛋白内切酶是胰蛋
白酶。它在蛋白质主链精氨酸和赖氨酸的C一端进行
切割。文献中有多种凝胶内酶切的方法，这里介绍改
进后的Wilm的方法。
将电泳后凝胶上的蛋白质斑点以最小的体积切
下，并将凝胶块切成约lmm 小颗粒，转入小离心管
内，加入约5O 的lOOmmol／L碳酸氢铵溶液洗胶粒
5min，弃去碳酸氢铵液，加入50pJ乙腈使凝胶脱水1O
一15min。若胶粒未完全脱水再用乙腈脱水～次，弃去
乙腈液。将离心管置入真空离心蒸发浓缩器内，微加
热15rain使胶粒完全干燥。将50pJ新鲜配制的
10mmoVL DTY韵100mmol／L碳酸氢铵溶液加入离心
管内，使胶粒水化。在56℃加热30rain还原样品，弃
去DTr溶液，加入乙腈放置15min，再在Speed Vac微
加热干燥15rain，加入5O l 55mmol／L碘乙酰胺的
100mmol／L碳酸氢铵溶液，烷基化半胱氨酸残基上的
巯基。室温暗室中放置20 min，弃去上清夜，加入
50pJ乙腈放置15min，在Speed Vac内干燥。加入2O l
胰蛋白酶溶液在4℃放置45—60min使胶粒再水化，
加入1O一2o 碳酸氢铵溶液覆盖胶粒，37cI=保温1小
时后，放置过夜，所得溶液供质谱分析用。
3．2 电洗脱后在溶液中酶解 电洗脱是电泳后从凝
胶上回收蛋白质的经典方法。通常蛋白质量多于0．
O01 mmol。将含SDS的凝胶与MALDI TOF MS分析结
合，可分析亚mmol的蛋白质。Schuh macher等用无
SDS pH2．5的乙酸铵作洗脱缓冲液，电洗脱系统的极
性相反，蛋白质SDS复合物在原位解离，游离的蛋白
质迁移至阴极，用标准蛋白样品实验，回收率达25％
～ 56％ [引
。
3．3 膜上酶切膜上酶切的方法已不常用于质谱分
析，因为它的灵敏度低于凝胶内酶切。电转移时不是
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第2期 王海龙，等．质谱技术在蛋白质组学中的应用 233
所有的蛋白质都能有效转移，而且在印迹过程中蛋白
质可能丢失。另外从PVDF膜上提取酶切后多肽时效
率不高，提取时加Triton 100可以增加多肽的提取效
率，但去污剂干扰质谱鉴定 J。
3．4 印迹过程中酶切 1999年Bins等报道将固定有
胰蛋白酶的膜，置于凝胶和PVDF膜之间在印迹过程
中使蛋白质样品发生酶切，为了蛋白质完全酶切，印迹
过程需要特殊设计。印迹后的膜用基体溶液浸透后可
用MALDI TOF MS直接分析。该法的主要特点是印迹
过程中平行进行酶切，其灵敏度不如标准方法 J。
4 用肽质量指纹谱鉴定蛋白质
蛋白质组学中最有意义的突破是用生物质谱鉴定
电泳后凝胶上的蛋白质。质谱技术已取代了生物化学
中经典的Edman降解技术¨。。，这是由于质谱技术能
进行高通量的分析，能分析蛋白质混合物，而且灵敏。
肽质量指纹谱方法最初由Henzel及其同事提
出¨ ，很快成为高通量蛋白质鉴定的选用方法。分析
时用MALDI TOF MS测定凝胶内酶切后多肽混合物的
质量，获得肽质量指纹图谱。蛋白质酶切后生成多肽
混合物，可以在蛋白质序列数据库内进行理论预测，并
对质谱实测多肽混合物与理论预测的数据进行比较，
质谱实测到足够肽段的质量与数据库中一个蛋白质理
论预测肽段质量匹配，蛋白质可明确鉴定_1 。
随着科学技术的进步，质谱也得到了快速发展，特
别是与生物技术的结合，开创了质谱应用的新领域。
质谱已成为生命科学研究中非常重要的工具。其研究
成果也将大大推动人类基因组的研究，并将使人类对
生命的本质，其发生发展过程的认识达到一个前所未
有新高度。
参考文献
[1] 钱小红，盛龙生．生物质谱技术与方法[M]．北京：科学
出版社，2003：17．
[2] B．N帕拉马克尼．电喷雾质谱应用技术[M]．北京：化学
工业出版社，2005：215．
[3] 利布来尔．蛋白质组学导论[M]．北京：科学出版社。
2005：163．
[4] 桑志红．电喷雾电离质谱及其在蛋白质化学研究中的应
用[J]．国外医学．药学分册，2000，27(1)：38．
[5] Miller GM，Byrd SE，Kuznieky RI．Nature Insight：Funetional
Genomies[J]．Nature，2000，405：819．
[6] 张学敏，魏开华，杨松成．生物质谱和蛋白质组技术的应
用策略[J]．分析测试学报，2002，21(增)：9．
[7] Weaver RF．Molecular Biology[M]．Columbus：McGraw—
Hil1．2001：231．
[8] 魏开华，杨松成．转印到膜上的蛋白质的质谱分析[J]．质
谱学报，2004：20(3)：89．
[9] 夏家辉．医学遗传学[M]．北京：人民卫生出版社，2004：
241．
[10] Benfey PN，Protopapas AD．Genomies[M]．New Jersey：
Prenties Hall。2004：202．
[11] 冯作化．医学分子生物学[M]．北京：人民卫生出版社，
2001：189．
[12] 查锡良．医学分子生物学[M]。北京：人民卫生出版社，
2003：263．
蛋白质中的氮形成的是有机中的氨基。
p.s：铵根正离子（Ammonium；化学式：NH4+）是由氨分子衍生出的正离子。氨分子与一个氢离子配位结合就形成铵离子。由于化学性质类似于金属离子，故命名为“铵”。
氨基是有机化学中的基本碱基，所有含有氨基的有机物都有一定碱的特性，由一个氮原子和两个氢原子组成，化学式-NH2，是一个活性大、易被氧化的基团。
