糖原DNA助沉的原理

主要内容：

一、硅基质离心柱制备DNA和RNA的工作原理

1. 裂解

裂解方法可能会根据需要DNA或RNA而有所不同，但其共同点是含有高浓度离液盐的裂解缓冲液。

杂化使氢键不稳定，范德华力和疏水相互作用。蛋白质不稳定，包括核酸酶，核酸与水的结合被破坏，为核酸与硅机制结合创造条件。

离液盐包括盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素和高氯酸锂。

除了离液盐，裂解缓冲液通常还含有洗涤剂，有助于蛋白质的溶解和裂解。

根据样品类型，也可以使用酶进行裂解。蛋白酶k就是其中之一，实际上蛋白酶k在裂解缓冲液中起着非常好的作用；蛋白酶k的作用就越好，蛋白质变性越完全。然而，溶菌酶在裂解缓冲液的变性条件下不起作用，因此，通常在加入变性盐之前进行溶菌酶处理。

对于质粒的制备，裂解方式与提取RNA或基因组DNA有很大不同，因为必须先从基因组DNA中分离出质粒。

如果加入离液盐，将立即释放胞内物质，并且无法从高分子量染色体中区分出小的环状质粒。

因此，在质粒制备中，直到裂解后，才加入离液盐，并用于结合硅基质。

2. 结合硅基质（Binding）

离液盐对裂解和硅基质的结合至关重要。

为了增强核酸与硅基质的结合，在结合阶段还加入了乙醇。通常是乙醇，但有时可能是异丙醇。

乙醇的浓度和体积对结合有很大影响，浓度或体积太多会带来大量降解的核酸和小片段，进而影响UV260的读数，使核酸浓度降低。浓度或体积太少，可能很难洗掉膜上的残留盐。

重要的一点是，乙醇会影响结合，并且添加的量对于任何试剂盒都是优化的。修改该步骤有助于获得核酸提取的效果，因此如果遇到问题并希望排除原因，则可以进一步评估该步骤。

另一种问题的诊断方法，保留离心后过柱滤液，并进行沉淀操作，看是否有核酸。如果在裂解过程中使用SDS的表面活性剂，试着用NaCl作为沉淀剂，以避免污染DNA或RNA。

3. 洗涤步骤

裂解液通过硅胶膜离心，现在DNA或RNA与柱结合，杂质，蛋白质和多糖则通过。

但是，膜仍然会被残留的蛋白质和盐弄脏。如果样本来自植物，膜上仍会残留多糖，可能还有一些色素，或者如果样本是血液，膜可能呈棕色或黄色。

清洗步骤有助于去除这些杂质。通常有两种清洗方式，但因样本类型而异。第一次洗涤通常会用少量的离液盐来去除蛋白质和有色污染物。然后用乙醇清洗以除去盐。如果样本本身没有太多蛋白质，如质粒准备或PCR产物纯化，那么只需要乙醇清洗即可。

4. 离心柱的干燥

乙醇洗涤后，大多数操作步骤都有离心来干燥离心柱。这是为了去除乙醇，是清洁洗脱的必要步骤。当10mM Tris缓冲液或水填充到膜上进行洗脱时，核酸会水合并从膜上释放。如果柱上还有乙醇，那么核酸就不能完全再水化。

跳过干燥步骤会导致乙醇污染和核酸产量降低。

这个问题的主要迹象是当试图把样品加载到琼脂糖凝胶上时，即使在存在染料的情况下，DNA不会下沉，而是漂浮在缓冲液中。乙醇污染的另一个迹象是，如果你把样品放在-20摄氏度，它不会结冰。

5. 洗脱

最后一步是从硅基质中释放出纯DNA或RNA。对于DNA的处理，通常使用pH值在8-9之间的10 mM Tris。DNA在稍微碱性的pH下更稳定，在缓冲液中溶解更快。即使是DNA颗粒也是如此。水往往趋向于低pH值，低至4-5，在短时间内洗脱时，高分子量DNA可能不完全水化。通过让缓冲液在离心前在膜中停留几分钟，可以最大限度地洗脱DNA。

另一方面，RNA在弱酸性pH值下稳定，因此水是首选洗脱液。RNA很容易溶于水。

6. 离心柱操作时容易出问题的事儿

核酸回收率低：因素有很多，通常是裂解问题，或者是过柱结合时条件出现了问题。

确保使用新鲜的优质乙醇（100%）稀释缓冲液或添加到过柱结合步骤。

质量差的乙醇或者长期储存的乙醇可能吸水，导致乙醇浓度发生变化，如果洗脱缓冲液的配置出现问题，DNA或RNA就会被清洗时流失。

低纯度：如果样品被蛋白质污染（低260/280），那么可能是因为样品太多，蛋白质没有完全去除或溶解。如果样品的260/230比率很低，则问题通常是来自结合缓冲液或洗涤缓冲液中的盐。确保使用最高质量的乙醇来制备洗涤缓冲液，如果问题仍然存在，则提取是增加洗涤次数。

与其他样品相比，一些样品含有更多的抑制剂。环境样品特别容易出现纯度问题，因为在提取过程中腐殖物质会被溶解。腐殖质类似于DNA，很难从硅胶柱中除去。对于这种类型的样品，在过柱步骤之前需要使用去除蛋白质和腐殖质的专门技术。

降解： 主要是RNA，降解是由于样品储存不当或者裂解效率过低造成的，不过前提是用不含RNase的水洗脱，对于DNA预处理来说，降解并不是一个大问题，因为对于PCR来说，DNA有降解，扩增依旧可以良好进行。但如果不希望DNA剪切过于严重，那么不要使用太强的裂解方法。  PCR纯化注意事项： PCR纯化是所有硅基质离心柱技术中最简单的，因为它只需要添加高浓度的结合盐（通常在每个PCR反应体系中添加3-5倍体积）并离心柱体。因此，当PCR纯化试剂盒操作失败时，可能会特别令人沮丧。所以纯化前，最好在凝胶上检测一下扩增结果。

PCR反应体系中太多物质可在UV260处有吸收峰： 核苷酸、洗涤剂、盐和引物。PCR纯化试剂盒操作失败多数是因为没有获得扩增产物。

如果确定反应体系中，有PCR产物且浓度不低，可以保留过柱后的液体，如果DNA没有发生结合，还可以进行挽救，重新进行纯化。

二、DNA连接酶工作原理

DNA连接酶（EC 6.5.1.1）以共价方式将DNA的磷酸骨架与平末端或配对的粘性末端连接起来，其作用是修复DNA分子中断裂的双链。

在分子生物学中，它通常用于将限制性内切酶产生的DNA片段插入载体。商业连接酶提供含有ATP和Mg2+的反应缓冲液，这两种物质对连接酶活性都是必不可少的。

由于反复的冻融可能会破坏ATP，所以最好将溶液进行分装。

链接反应本身有两个基本步骤。首先，DNA末端必须偶然碰撞，并保持在一起足够长的时间，以便连接酶连接它们。

低温反应更容易。所有的分子在更高的温度下移动得更快，如果它们在低温下轻轻地漂浮在溶液中，而不是像在更高的温度下那样呼啸而过，那么两个DNA末端碰撞并保持在一起会更容易。对于粘性末端，较低的温度稳定了互补核苷酸之间的氢键，有助于保持性对位置。

第二步是酶促反应：DNA连接酶通过两步催化3′-OH与5′-磷酸基团连接。首先，与酶活性部位的赖氨酸残基相连的AMP核苷酸被转移到5′-磷酸。然后磷酸腺苷键被3′-OH攻击，形成共价键并释放腺苷酸。为了让酶进行进一步的反应，酶活性部位的AMP必须由ATP补充。

DNA连接酶在25℃时具有最佳活性，因此连接反应在使DNA末端连接在一起的最佳温度（1℃）和酶反应（25℃）之间的权衡温度下进行。通常在16℃下1小时是可以的，但是由于将DNA末端连接在一起是反应中最不有效的部分，因此通过将温度降低到4℃来促进这一点可以提供更高的效率。 然而，酶在这个温度下工作非常缓慢，因此需要很长的（如过夜）反应时间。

三、比色分析的工作原理

1.对硝基苯基磷酸酯—分析机制

对硝基苯磷酸酯（pNPP）作为一种合成底物广泛应用于各种磷酸酶的催化活性测定。pNPP的磷酸基团被酶裂解生成对硝基苯酚，由于对硝基苯酚在水中电子激发的最大波长为318nm，因此对硝基苯酚也是无色的。然而，在碱性条件下，对硝基苯酚转化为对硝基苯酚阴离子，导致向400nm左右的深色偏移（根据溶液条件将化合物的吸收峰改变为较长波长）。这是电磁光谱的蓝色边缘，但是由于我们看到反射光的颜色（与吸收光相反），溶液看起来是黄色的。

要记住的事情：

铬酸盐转移是分析的关键因素。

举例来说，如果酶的活性要求在酸性范围内有一个最佳的pH值，那么酸性磷酸酶的情况正好如此。

在这种情况下，为了获得所需的黄色，必须在终点添加强碱（例如氢氧化钠或氢氧化钾）。

2.孔雀绿—分析机制

对硝基苯磷酸测定是很好的，但是如果你最喜欢的磷酸酶不能有效地代谢pNPP呢？另一种市面上可买到的磷酸酶测定法是孔雀绿测定法。这种简单的测定方法是基于孔雀绿、钼酸铵和游离正磷酸盐（又称无机磷酸盐，pi）在酸性条件下形成的络合物。

正磷酸盐被磷酸酶分解后从磷酸化底物中释放出来，在硫酸溶液中与钼酸铵形成络合物。孔雀绿磷钼酸盐络合物的形成，在620-650nm处测量，与游离正磷酸盐浓度直接相关。因此，有可能量化蛋白质磷酸酶底物的磷酸化和磷酸释放。

要记住的事情：

这种方法仅测量无机游离磷酸盐；在测量之前，必须首先水解和中和有机磷酸盐（脂质结合或蛋白质结合磷酸盐）。了解不同种类的有机磷酸盐及其各自不同的水解自由能有助于优化分析条件。高能有机磷酸酯（缩醛磷酸酯、酸酐等）具有不耐酸的磷酸基团，可在低pH下孵育释放到溶液中。另一方面，低能有机磷酸盐（磷酸酯）在酸性溶液中稳定，需要更苛刻的条件（如热分解）才能用这种方法检测。

在大量孔雀绿存在下，3:1离子缔合物[(MG+)3(PMo12O40 3-)]容易在酸性水溶液中形成和沉淀。为了稳定水溶液中的1:1离子缔合物，在溶液中加入聚乙烯醇。

在分析过程中要考虑的另一件事是任何可能干扰分析的氧化还原反应的可能性。钼是一种过渡金属，因此存在于多种氧化状态。在钼酸盐阴离子中，它具有+6的氧化状态。通过有机化合物，如抗坏血酸和还原糖（即葡萄糖）或无机化合物（如SnCl2）还原酸化的Mo（VI）溶液，生成颜色为蓝色的Mo（IV）物质。

四、实验室级用水是如何纯化的？

1.蒸馏：像山丘一样古老的技术（或者至少像隐藏在山丘里的静物一样）。水被加热到沸点，然后冷凝成液体。这样可以除去许多杂质，但沸点等于或小于水的杂质也会被带入蒸馏液中。

2.微滤：在这项技术中，利用压力迫使水通过孔径为1至0.1微米的过滤器，以去除颗粒物。直径小于0.2微米的过滤器可去除细菌，即所谓的冷杀菌。

3. 超滤，使用更小的孔径（小于0.003微米）。这些基本上都是分子筛，用来去除直径大于孔径的分子。它可以用来清除病毒、内毒素、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶。

4.反渗透。反渗透过滤器的孔径小于0.001微米，这使得它们能够根据直径筛选离子。这是用来脱盐的水。

5.通过活性炭床过滤，有助于去除吸附在炭表面的氯离子和有机化合物等物质。

6.紫外线辐射。紫外线是一种很明显的去除水中微生物的方法。它还可以通过将某些有机化合物分解成危害较小的产物用来净化水。

7. 去离子/离子交换。将水通过含有阳离子和阴离子树脂混合物的树脂床来去除水中的离子。水中的正离子被阴离子树脂颗粒所吸引，而负离子被阳离子树脂所吸引。其结果是从树脂床的另一端流出去离子水。

销售纯水水或净水系统通常将使用这些技术的组合。水的纯度越高，使用的技术就越多。

五、为什么酶有最适温度

每个生物学家都熟悉酶反应速率与温度的关系，如图所示。

我们知道来自大肠杆菌或温血动物的酶在37℃左右有一个最佳温度，而来自热排气细菌的酶有更高的最佳温度。

为什么酶有一个最佳温度分布？化学家有一个经验法则，温度升高10℃会使反应速度加倍。这个规则是从Arrhenius方程推导出来的。

基本上，随着温度的升高，反应物的动能也随之增加。这种动能的增加意味着反应物更容易与足够的能量发生碰撞，从而使反应发生，因此温度越高，反应速率越高。

温度上升：反应速率曲线的第一部分，其中速率随着温度的升高而增加，遵循Arrhenius方程。如果这种酶即使在高温下也完全稳定，反应速度也会随着温度的升高而继续增加，直到发生其他事情，比如其中一种反应物变得受限。

平衡：反应速率开始趋于平稳，这是由于温度接近该酶变性温度（因此失去活性）。

温度下降：在更高的温度下，酶完全变性，失活。

变性发生的温度取决于酶的结构，而这又与酶的进化起源有关。大肠杆菌的酶已经进化到可以应对37℃左右的温度，而来自热喷口细菌的酶则被迫进化到可以在更高温度下保持稳定的程度。

因此，酶的最佳温度是基于Arrhenius模式对温度的依赖性（反应越热，反应速度越快）和酶接近变性温度时的不稳定性之间的权衡。

一、SDS-PAGE的工作原理

SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是实验室常用的基于蛋白质分子量对蛋白质进行分离的方法。

SDS-PAGE根据蛋白质的分子量来分离蛋白质，基于施加电场的作用下通过筛分基质（凝胶）产生的迁移率。

1.  使蛋白质的迁移率与分子量成正比

任何带电物种在电场中的运动都是由其净电荷、分子半径和外加电场的大小决定的。但自体折叠的蛋白质所带来的问题是，它们的净电荷和分子半径都不依赖于分子量。相反，它们的净电荷由氨基酸组成决定，即蛋白质中的氨基酸正、负电荷之和以及蛋白质三级结构的分子半径决定。  

因此，在它们的原生状态下，具有相同分子量的不同蛋白质在电场中以不同的速度迁移，这取决于它们的电荷和三维形状。  

为了根据分子量在电场中分离蛋白质，我们需要将蛋白质还原为线性分子，破坏三级结构，并以某种方式掩盖蛋白质的固有净电荷。这就是SDS的应用来源。

2.  SDS的作用

SDS是一种存在于SDS-PAGE缓冲液中的洗涤剂，在这种缓冲液中，伴随着一点煮沸和还原剂（通常是DTT或β-ME来分解蛋白质-蛋白质二硫键），它会破坏蛋白质的三级结构。这将折叠的蛋白质转变为线性分子。

SDS利用均匀的负电荷覆盖蛋白质，从而掩盖R-基团的固有电荷。SDS与线性蛋白（约1.4g SDS/1g蛋白）的结合相当均匀，这意味着蛋白质的电荷现在与它的分子量近似成正比。  

SDS也存在于凝胶中，以确保一旦蛋白质被线性化，电荷被掩盖，但蛋白质在整个电泳分离过程中仍保持这种方式（与分子量成正比的迁移）。  

SDS包被的蛋白在凝胶中的迁移率的主要决定性因素是它的分子半径。  

SDS包被的蛋白已被证明是线性分子，18Å宽，长度与分子量成正比，因此分子半径（它们在凝胶中的迁移率）由蛋白质的分子量决定。由于SDS包被的蛋白质具有相同的电荷质量比，因此不存在基于电荷的差异迁移。

3. 凝胶基质

在外加电场中，SDS处理后的蛋白质现在将以不同分子量产生的不同速率向阴极移动。这些不同的迁移率将被凝胶基质的高摩擦环境扩大。

SDS-PAGE的凝胶基质是聚丙烯酰胺，它具有化学惰性，并且至关重要的是可以很容易地在各种浓度下制备不同的孔径，可以产生不同的分离特性。

4. 不连续缓冲体系与浓缩凝胶

为了通过凝胶将电流从阳极传递到阴极，需要缓冲液。我们通常使用不连续Laemmli缓冲系统。 “不连续”仅仅意味着凝胶和电泳槽的缓冲液是不同的。  

通常，该系统采用pH6.8的Tris-HCl缓冲液配置的浓缩胶，pH8.8的Tris-HCl缓冲液配置的分离胶以及pH8.3的电极缓冲液，浓缩胶具有低浓度的丙烯酰胺，分离胶具有更高的浓度，能够延缓蛋白质的运动。

那些不同的pH是怎么回事儿？甘氨酸可以以三种不同的电荷状态存在，正电荷、中性电荷或负电荷，这取决于pH值。用不同的缓冲液控制甘氨酸的电荷状态是整个浓缩胶的关键。

同时，这也是浓缩胶的工作原理，当电源接通时，在pH 8.3电极缓冲液中带负电荷的甘氨酸离子被迫进入浓缩胶（pH为6.8），在这种环境中，甘氨酸主要转变为两性离子（中性电荷）状态。电荷的这种损失使它们在电场中移动得非常缓慢。  

另一方面，氯离子（来源于Tris-HCl）在电场中移动得很快，它们形成一个离子锋，在甘氨酸之前迁移。从Tris平衡离子（正朝阴极移动）中分离出的Cl-形成一个具有陡峭电压梯度的狭窄区，该电压梯度将甘氨酸往后拉，导致迁移离子产生两个狭长迁移前沿，高流动性的Cl-前沿，然后是较慢的中性甘氨酸前沿。  

所有凝胶中的蛋白质样本的电泳迁移率处在甘氨酸和Cl-迁移率的极值之间。因此当两个前沿进入样品孔时，蛋白质浓缩到Cl-和甘氨酸之间的狭窄区。

5. 当蛋白质离开浓缩胶

浓缩胶迁移过程结束后，进入分离胶，pH转变为8.8，在该pH下，甘氨酸分子大多带负电，迁移速度比蛋白质快得多。因此，甘氨酸加速通过蛋白质，而蛋白质留在分离胶中。  

结果是，蛋白质在浓缩和分离胶的界面处被浓缩到非常窄的带中，并且由于分离胶中丙烯酰胺浓度的增加，这减缓了蛋白质根据其分子量大小的运动，分离开始。

6. 浓缩胶起到了什么作用

浓缩胶胶孔约1cm深，通常需要填充足够的蛋白在凝胶上。因此，缺少浓缩胶的情况下，样本则置于分离胶上，而样本条带将达到1cm深。  

与浓缩成一条带同时进入分离胶相比，没有浓缩胶意味着蛋白质在不同时间分别进入浓缩胶而形成弥散条带。

因此，浓缩胶确保蛋白质同时达到分离胶，分子量相同的蛋白质则形成紧密条带进行迁移。

7. 蛋白质分离

一旦蛋白质进入分离胶，则因高分子量蛋白质通过多孔丙烯酰胺凝胶的速度比低分子量蛋白慢而被分离。凝胶孔的大小可以根据丙烯酰胺浓度和蛋白质分子量大小而改变。  

对于更宽的分离范围，或对于难以分离的蛋白质，可以使用具有丙烯酰胺浓度增加的梯度凝胶。

二、蛋白酶和蛋白酶抑制剂工作原理

1. 蛋白酶：好的，坏的，水解的

所有生物体都有蛋白水解酶和磷酸化酶，包括：你、我、甚至棉铃虫。虽然蛋白酶涉及到从宿主防御到伤口愈合乃至病毒复制的各个方面，但根据蛋白酶活性位点的构成和与目标肽键的相互作用，可以大致分为两大类。

1）通过丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸在其活性部位的亲核活化水解键；

2）天冬氨酸、谷氨酸和金属蛋白酶，利用水本身进行水解。

2. 抑制剂：你不能只靠一种

化学分解、碰撞摩擦、超声波和冻融，把整个系统都弄得乱七八糟。没有肽键是安全的！  

外肽酶攻击氨基酸链的末端，而内肽酶水解它们的内部连接。激酶磷酸化和去磷酸化随意。  

没有一种抑制剂能清除所有蛋白酶，阻止每一个磷酸化事件。它需要一种“鸡尾酒”的方法来阻止蛋白质分解。蛋白酶抑制剂在胁迫下可以不可逆、可逆和可逆地作用，可以是任何小分子，如氟化钠，也可以是进化过程中自身微生物抑制剂多肽类似物。它们可以与底物竞争活性位点，有时会破坏或者囤积蛋白酶功能所需的珍贵阳离子。  

竞争性抑制剂的作用是以类似底物的方式与活性位点结合通过修饰阻止蛋白酶，例如，酯化反应。许多大的竞争抑制剂通过增强亲和性和特异性结合。  

竞争性的阻碍因素。因素种类繁多，从抑肽酶，一种6kDa的多肽丝氨酸蛋白酶（在极端的pH值是可逆的），到正钒酸钠，一种抑制易受骗蛋白-酪氨酸磷酸酶的小分子。

螯合剂利用它们对金属离子的增强亲和力与金属离子螯合，而不能与其他成员发生反应。金属蛋白酶的活性部位需要锌、镁、锰、钙，甚至钴来活化水，水解肽键，以达到水解目的。把锌和乙二胺四乙酸（EDTA）结合起来，把钙和乙二胺四乙酸（EGTA）结合起来，金属蛋白酶就不再有活性了。

三、琼脂糖凝胶不是通过聚合形成的

1.琼脂糖凝胶不是通过聚合形成的

聚丙烯酰胺主要用于SDS-PAGE，是由丙烯酰胺单体和双丙烯酰胺单体组成的基质。它的优点是化学惰性，因此在蛋白质通过时不会与蛋白质发生相互作用，而且它可以用不同的孔径轻松地、重复地制造出具有不同分离特性的凝胶。

聚合反应，是自由基催化的乙烯基加成反应。该反应由TEMED引发，引发过硫酸铵（APS）自由基的生成。自由基将电子转移到丙烯酰胺/双丙烯酰胺单体上，使它们呈放射状并相互作用形成聚丙烯酰胺链。

在缺失双丙烯酰胺的情况下，丙烯酰胺会聚合成长链，而不是多孔凝胶。双丙烯酰胺交联丙烯酰胺链，是形成多孔凝胶基质的原因。通过改变丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例，可以控制交联的量，决定凝胶的孔径和分离特性。

2. 琼脂糖凝胶形成

琼脂糖—凝胶琼脂的主要成分，可以从某些海藻中分离出来—本身就是一种聚合物。但是，聚合不是琼脂糖凝胶形成的机制。  

在化学上，琼脂糖是一种多糖，其单体单元是D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳吡喃糖的二糖。

在低于35℃的水溶液中，这些聚合物链通过非共价键相互作用（像氢键）和静电相互作用被保持在多孔凝胶结构中。 

加热溶液会破坏这些非共价相互作用，并使链脱离。  

当溶液冷却时，这些非共价相互作用被重新建立并且形成凝胶。 

所以，琼脂糖（和琼脂）凝胶是通过氢键和静电相互作用而不是通过聚合形成的。

四、乙醇是如何沉淀DNA和RNA的

乙醇沉淀法是一种在水溶液中浓缩和脱盐核酸（DNA或RNA）的常用方法。最基本的步骤是在水溶液中加入盐和乙醇，迫使核酸从溶液中沉淀出来。

通过离心分离沉淀的核酸。核酸颗粒在70%的冷乙醇中洗涤，进一步离心后，干燥去除乙醇，核酸颗粒被重新悬浮在干净的缓冲液中。

1. 关于溶解度

首先我们需要知道为什么核酸能溶于水。水是一个极性分子，由于非共享的电子对，它在氧原子附近有部分负电荷，在氢原子附近有部分正电荷。  

由于这些电荷，极性分子，如DNA或RNA，可以与水分子静电作用，使它们很容易溶于水。  

因此，极性分子可以被描述为亲水性分子，而非极性分子是疏水性的，它们不易与水分子相互作用。 

核酸是亲水性的，这是由于糖磷酸主链上带负电荷的磷酸（PO3-）基团。

2.  盐的作用

盐在实验中的作用是中和糖磷酸骨架上的电荷。一种常用的盐是醋酸钠（乙酸钠），在溶液中，乙酸钠分解成NA+和[CH3COO]-。  

带正电的钠离子中和了核酸上PO3-基团的负电荷，使分子的亲水性大大降低，因此在水中的溶解度大大降低。

3. 乙醇的作用

溶液中Na+离子与PO3-离子之间的静电吸引受库仑定律的支配，受溶液介电常数的影响。  

水具有很高的介电常数，这使得Na+和PO3-很难结合在一起。  

另一方面，乙醇具有较低的介电常数，使得Na+更容易与PO3-相互作用，屏蔽其电荷，使核酸不太亲水，导致其从溶液中脱落。

4. 温度的作用

低温（如-20或-80℃）下保存核酸/盐/乙醇混合物用于沉淀核酸通常在实验中认为是必要的。  

然而，这不是必需的，因为浓度低至20ng/mL的核酸在0-4℃时会沉淀，因此在冰上孵育15-30分钟就足够了。

5. 70%无水乙醇洗涤步骤

把沉淀的DNA颗粒中的残留盐洗掉。

6. 关于核酸沉淀的一些建议：

a. 盐的选择

使用醋酸钠（0.3M终浓度，pH值5.2）进行常规DNA沉淀；  

对于含有SDS的DNA样品，使用氯化钠（终浓度为0.2M），因为NaCl使SDS在70%乙醇中保持可溶性，因此不会与DNA一起沉淀；  

对于RNA，使用氯化锂（0.8M终浓度）。这是因为2.5-3体积的乙醇应用于RNA沉淀，而LiCl比NaAC更易溶于乙醇，因此不会沉淀，但要注意氯离子会抑制蛋白质合成和DNA聚合酶，因此LiCl不适合用于体外翻译或反转录RNA的制备。在这种情况下，使用NaAC。

使用乙酸铵（2M终浓度）去除dNTPs，但不用于制备应用于T4多核苷酸激酶反应的DNA，因为铵离子抑制酶活性。

提高低浓度或小核酸片段沉淀的产率（<100个核苷酸）

a. 将MgCl2添加至最终浓度0.01M ；

b. 将离心前在冰上孵育的时间增加到1小时。

玉米——粉碎——蒸煮（糊化）——糖化（加糖化酶）——发酵（加酵母菌种）——蒸馏塔（蒸馏）——精馏塔（精馏）——酒精

酵母菌将糖发酵成酒精的过程不是简单的化学反应，其机理至今仍莫衷一是。

酒精的不同浓度溶液用途：

（1）20%～30%乙醇：

用于急性肺水肿时湿化给氧，从而降低肺泡内泡沫的表面张力。

（2）30%乙醇：

用于湿润、松解头发缠结。

（3）50%乙醇：

用于皮肤按摩。

（4）75%乙醇：

注射前常规皮肤消毒，脐部消毒，供皮区可用70%乙醇消毒2～3次。

（5）95%乙醇：

用于燃烧法。

扩展资料：

酒精又称为乙醇，也称为醇，乙基醇，谷物醇，和饮酒，是一种化学化合物，。乙醇是易挥发，易燃，无色的液体，具有轻微的特征气味。它是一种精神活性物质，是酒精饮料中酒精的主要类型。

乙醇自然受到所产生的发酵的糖由酵母或通过石油化学过程，并且是最常见的消耗作为一个受欢迎的娱乐性药物。它还具有作为防腐剂和消毒剂的医疗应用。该化合物被广泛用作化学 溶剂，用于科学化学测试或合成其他有机化合物，并且是用于各种制造业的重要物质。乙醇也被用作清洁燃料的燃料来源。

参考资料：

【1】Ethanol – Compound Summary". The PubChem Project. USA: National Center for Biotechnology Information.网页链接

【2】Haynes, William M., ed. (2011). CRC Handbook of Chemistry and Physics (92nd ed.). Boca Raton, FL: CRC Press. p. 3.246. ISBN 1439855110.

实验1总DNA提取

生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。

[实验目的]

学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。

[实验原理]

植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/异戊醇(24:1)抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。

由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/mlDNA溶液A260=0.020。

[实验器材]

1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料

[实验试剂]

1、3×CTABbuffer（pH8.0）

100mMTris

25mMEDTA

1.5MNaCl

3%CTAB

2%β-巯基乙醇

2、TE缓冲液（pH8.0）

10mmol/LTris·HCl

1mmol/LEDTA

3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）

4、95％乙醇

5、液氮

[实验步骤]

1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。

2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。

3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，

置于65℃水浴保温0.5h，不时地轻轻摇动混匀。

4、加等体积的氯仿/异戊醇，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。

5、将锥形瓶中的液体倒入50ml离心管中，在4℃下8000rpm离心10min。

6、离心管中出现3层，用滴管小心地将上层清液吸入另一干净的离心管中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。（根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。）

7、收集上层清液，并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入2倍体积预冷的95％乙醇。边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀（主要为DNA）迅速缠绕在玻棒上。

8、小心取下这些纤维状沉淀，加1～2mL70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙醇，即为DNA粗制品。

9、将粗制品溶于TE缓冲液。

10、在分光光度计上测定该溶液在260nm/280nm紫外光波长下的光密度值。

[注意事项]

1、液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。

2、所有操作均需温和，避免剧烈震荡。

[思考题]

CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用分别是什么？

液氮研磨的原理是什么？

实验二质粒DNA的提取

质粒DNA是分子生物学实验中广泛应用的载体分子。质粒是细菌独立于染色体外的遗传物质，是环状的`双链DNA分子。由于质粒比较小，并且能进行独立的自我复制，常常被改造为克隆和表达的载体分子。

[实验目的]

通过本实验掌握碱裂解法提取质粒的基本原理，掌握碱裂解小量提取质粒的实验技术。

[实验原理]

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速

而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

[实验器材]

1、恒温培养箱

2、恒温摇床

3、台式离心机

4、高压灭菌锅

5、Tip头、Eppendorg管

6、含有目的质粒的E.coli菌株

[实验试剂]

1、溶液I

50mmol/L葡萄糖

5mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl

10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）

2、溶液II

0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合

3、溶液III

5mol/L乙酸钾60mL

冰乙酸11.5mL

水28.5mL

4、TE缓冲液

10mmol/LTris·HCl

1mmol/LEDTA(pH8.0)

5、70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）

6、EcoRI及其缓冲液

7、HindIII及其缓冲液

[实验步骤]

1、将含有目的质粒的E.coli菌株接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

2、取1ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min离心30sec。

3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4、将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。

5、加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上。

6、加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。7、12000r/min，离心5min，将上清液转至另一Eppendorf管中。

8、向上清液加入等体积的饱和酚，混匀。

9、12000r/min，离心5min，将上清液转至另一Eppendorf管中。

10、向上清液加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置5~10min。12000r/min离心5min。倒去上清液，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

11、1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。12、20μLTE缓冲液，使DNA完全溶解，-20℃保存。

[注意事项]

操作时，避免剧烈震荡。

[思考题]

1、实验操作中，饱和酚的作用是什么？

2、SDS和NaOH的作用是什么？

[参考文献]

《精编分子生物学实验指南》（第四版）

[美]FM奥斯伯，RE金斯顿等主编科学出版社2005

实验三总RNA提取

【目的和要求】

1．掌握样品中总RNA的提取的原理和方法。

2．熟悉RNA纯度及浓度检测方法。

3．了解RNA提取过程中的注意事项。

【实验原理】

RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。因此提取必须在无RNase的环境中进行。可使用RNase抑制剂，如DEPC是RNase的强抑制剂，常用来抑制外源RNase活性。提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制RNase活性，并有助于除去非核酸成分。

【教学内容】

1．总RNA提取的基本原理和常用方法介绍

2．进行动物组织或血液样品总RNA提取。

3．对提取的RNA的进行纯度和浓度检测。

【实验器材和试剂】

超净工作台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、振荡器、移液器、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管。

玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h；不耐高温的器皿（如塑料制品）应用0.1%DEPC浸泡2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高压20min，再70～80℃烘烤干燥方可使用。

细胞裂解液：异硫氰酸胍4mol/L；柠檬酸钠（pH7.0）25mmol/L；十二烷基肌氨酸钠0.5%；β-巯基乙醇0.1mol/L（称取柠檬酸钠0.64g，十二烷基肌氨酸钠0.415g，吸取β-巯基乙醇0.7ml，用无Rnase的蒸馏水溶解，定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，异硫氰酸胍25g,混合，完全溶解后4℃保存备用）

TRIzolRNA抽提试剂、2mol醋酸钠、0.1%DEPC、平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）、氯仿、无水乙醇、异丙醇、75%乙醇（用RNase-free水配制）、RNase-free的水。

【实验方法】

（一）异硫氰酸胍法（PLT）

1．取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的细胞裂解液1ml,在冰浴

中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一试管中。

2．加入2mol醋酸钠（pH4.0）120μl，充分混匀。

3．加入1.2ml酚：氯仿：异戊醇，充分混匀摇振10s，冰浴15min。

4．将混合物转移至1.5mlEp管中，4℃，离心10000r/min,20min.

5．移取上层水相至另一Ep管中，加入等体积的异丙醇，静置-20℃，30min沉淀RNA.

6．4℃，离心12000r/min，15min.

7．弃上清液，加入70%乙醇400μl,洗涤RNA沉淀物；如果RNA沉淀物被悬浮，则4℃离心10000r/min，10min。

8．弃上清液，自然干燥，但应避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。

9．加入100μl无RNase水重悬RNA，或加1ml无水乙醇和1/10体积3mol醋酸钠（pH4.0），-70℃保存。

（二）TrizolReagent/总RNA提取试剂

TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。下面介绍由上海美季生物技术有限公司总RNA提取试剂推荐的操作步骤：

1.匀浆处理（Homogenization）

（1）组织中提取总RNA

①植物组织：植物叶片直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100mg植物叶片加入1mlTRIzol。

②动物组织：按10-30mg组织加入1mlTRIzol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆。

（2）培养细胞中提取总RNA

①贴壁细胞：无须胰酶消化，可直接用TRIzol进行裂解，每10平方厘米培养面积加1mlTRIzol。

②悬浮细胞：可直接离心收集、裂解，每1mlTRIzol可裂解5×106动物或酵母细胞，或107细菌细胞。

（3）血液中提取总RNA

直接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1mlTRIzol。

2．分层（PhaseSeparation）

（1）样品加入TRIzol后，室温放置5min，使样品充分裂解。

注：如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存。

这里的实验基本操作技术是指在分子生物学实验中使用范围最广、使用频率最高、几乎所有实验都要应用的技术。器皿的清洗，试管、量筒（杯）、容量瓶、吸管及移液器、电子天平等量具的正确操作和使用、试剂配制等技术，应当都是基本操作技术，但这些内容已在分析化学、生物化学的实验课程中作了详细介绍。本章主要介绍与分子生物学实验有关的除（灭）菌技术、无菌操作技术和微量操作技术。

3.1 除(灭)菌技术

在进行分子生物学实验过程中，需要一个清洁的实验环境，所使用的器皿及溶液均需要进行除（灭）菌处理，一方面避免环境中微生物的污染，另一方面还可消除蛋白酶和核酸酶对实验的干扰和影响。在进行微生物及细胞的纯培养时要求更高，不能有任何外来杂菌。因此，对所有器材、培养基要进行严格灭菌，对工作场所进行消毒，保证工作顺利进行。

实验室常用的除灭菌方法主要有物理方法及化学方法两种。物理方法包括用湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线、过滤、离心沉淀等方法除去微生物；化学方法是使用化学消毒剂、抗菌素等杀死或抑制微生物。根据被灭菌物品的材料性质和实验要求，可采取不同的消毒灭菌方法。

3.1.1 物理灭菌法

（1）干热灭菌：干热灭菌包括火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。

火焰灼烧适用于金属用具，如接种环、接种针和手术器械等，玻璃器皿的口颈，如试管口和瓶口，玻璃棒等的灭菌处理。这种方法灭菌迅速彻底。

热空气灭菌一般在烤箱中进行，利用高温干燥空气（160℃170℃）加热灭菌12h，适用于玻璃器皿和培养皿等。干热消毒后的器皿干燥，易于保存。缺点是干热传导慢，可能有冷空气存留于烤箱内，因此要求较高的温度和较长的时间才能达到消毒的目的。应当注意，干烤灭菌完毕后不得马上将烤箱门打开，须等温度降至70℃以下时再开箱门，以免冷空气突然进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。在灭菌时，物品不能放的太挤。灭菌的玻璃器皿中不可有水，有水的玻璃器皿在干热灭菌时容易炸裂。培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此方法消毒。

（2）湿热灭菌：在相同温度下，湿热的灭菌效力比干热灭菌好。原因是：（1）热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强。水分子的存在有助于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其他相互作用弱键，更易使蛋白质变性。加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。蛋白质含水量与其凝固温度成反比；（2）热蒸汽比热空气穿透力强，能更有效地杀灭微生物；（3）蒸汽存在潜能，当气体转变成液体时可放出大量热能，故可更迅速提高灭菌物体的温度。

湿热灭菌常用的方法有高压蒸汽灭菌、常压蒸汽灭菌和煮沸灭菌。其中高压蒸汽灭菌法最为常用，效果最好。常压蒸汽灭菌法不能在短时间内杀死细菌芽孢，必须采取间歇灭菌或持续灭菌的方法，才能达到完全灭菌。而煮沸灭菌仅用于注射器及某些用具的灭菌，被灭菌物品的湿度太大。所以，这两种方法较少使用。

高压蒸气灭菌是在密闭的高压蒸汽锅中进行的。其原理是：将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，将锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭，再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而使温度也随之上升到100℃以上。

灭菌时，根据不同的物品选择不同压力和时间，一般物品（如布类、金属器械、玻璃器皿等）消毒的要求是0.15MPa下15min，培养液和橡胶制品为0.1MPa下10min。灭菌前在锅内加适量的水，加水过少，易将灭菌锅烧干，引起炸裂事故。加水过多有可能引起灭菌物品浸水。物品不能装得过满，以免影响消毒器内气体流通。导气管要伸至罐底并防止堵塞。在加热升压之前，先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气，冷空气排出后，关闭排气阀门，同时检验安全阀活动自如，开始升压，当达到所需压力时，开始计时，并控制压力恒定。灭菌过程中，操作者不能离开工作岗位，要定时检查压力及安全，防止意外事件发生。灭菌完毕后一定要先打开阀门放气，当灭菌锅内压力下降到“0”时，再打开灭菌锅的盖。也可在灭菌完毕后，关闭电源总阀，让灭菌物品自然冷却，待灭菌锅压力表降至“0”时，再取出灭菌物品。

蒸汽压力与温度的关系

蒸汽压力（表压） 蒸汽温度

Kg/cm2 MPa ℃ ℉

0.00 0.00 100 212

0.25 0.025 107.0 224

0.50 0.050 112.0 234

0.75 0.075 115.5 240

1.00 0.100 121.0 250

1.50 0.150 128.0 262

2.00 0.200 134.5 274

（3）紫外线杀菌： 紫外线的波长范围是200300nm，杀菌范围为240280nm，其中波长在260nm左右的紫外线杀菌作用最强。紫外灯是人工制造的低压水银灯，能辐射出257.3nm的紫外线，杀菌能力强且较稳定。紫外线杀菌作用是因为它可以被蛋白质（波长为280nm）和核酸（波长为260nm）吸收，造成这些分子的变性失活。紫外线穿透能力很差，不能穿透玻璃、衣物、纸张和大多数其他物体，但能穿透空气，主要用于实验室空气、操作台表面和不能使用其它方法进行灭菌的物品。紫外线直接照射方便、效果好，经一定的时间照射后，可以消灭空气中大部分细菌。培养室紫外线灯应距地面不超过2.5米，且消毒物品不宜相互遮挡，照射不到的地方起不到消毒作用。

紫外线照射可产生臭氧，污染空气，对试剂及培养液都有不良影响，对人皮肤也有伤害。

（4）过滤除菌：很多液体不能采用高压灭菌的方法进行灭菌处理，如血清、合成培养液、酶及含有生物活性蛋白的液体等，可采用过滤的方法除去细菌等微生物。滤器有抽吸（抽滤）式及加压式两种类型；滤板（或滤膜）结构可分为石棉板、玻璃或微孔膜。常用的滤器有Zeiss滤器（蔡氏滤器）、玻璃滤器和微孔滤膜滤器，其中微孔滤膜滤器最为常用。

微孔滤膜滤器多为塑料结构，分为上下两部分，中间可放置纤维素滤膜。将待过滤液体吸入注射器内，慢慢注入滤器上部的孔中，通过中间的滤膜即可。可用于包括血清在内的各种培养液的过滤除菌，速度快，效果好。滤膜为一次性的特制混合纤维素滤膜，其孔径有0.6μm、0.45μm、0.22μm三种，用于过滤除菌时，最好选用0.22μm的滤膜（可以除去细菌和霉菌）。安装滤膜时要注意：先将滤膜在蒸馏水中浸湿再安装；滤膜薄且光滑，容易移动，千万不能装偏而使过滤失败；同时要注意滤膜的正反面，正面（光面）应朝上。由于滤膜薄，承受压力有限，压力不能过大、过猛，以免造成滤膜破裂。每次过滤后应打开滤器，核实滤膜是否移动和破裂，以保证有效过滤除菌。微孔滤膜滤器的清洗、消毒方法很简单，用完后去掉滤膜，用去离子水冲洗干净，再将新的滤膜正确放入其中，包裹后可高压灭菌处理，也可直接煮沸灭菌处理。现在也有一次性小滤器。

3.1.2 化学灭菌法

应用化学制剂破坏细菌代谢机能。常用化学杀菌剂有：乙醇、醋酸、福尔马林、高锰酸钾、新洁尔灭等。最常见的是75%酒精及1‰的新洁尔灭，前者主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。化学灭菌法操作简单、方便有效。

将高锰酸钾粉末与适量体积的福尔马林混合，会产生大量的甲醛气体，常用于无菌室的熏蒸消毒。

3.1.3抗生素灭菌法

主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。要注意不能完全依赖抗生素来达到消毒灭菌的目的，还应严格无菌操作。常用的抗生素是青霉素和链霉素。

3.2无菌操作技术

无菌技术是指实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法，是实验过程中预防和控制交叉污染的一项重要基本操作。在生化实验中经常涉及到无菌操作技术，尤其是微生物的纯培养、细胞及胚胎的培养，更需要严格的无菌操作技术。在无菌操作过程中，任何一个环节都不得违反操作原则，否则就可能造成实验失败。因此，必须加强无菌观念，准确熟练地掌握无菌技术，严格遵守无菌操作规程。

无菌技术包括四部分内容：实验所用的玻璃、塑料制品及金属器械的处理；实验操作对象及试剂的无菌处理；工作环境及表面的处理；实验者的操作技术。前两部分已在前面介绍过，这里主要介绍后两部分内容。

1. 周密计划 在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。

2．仔细准备 根据实验要求，准备各种所需的器材和物品，并选择适宜的方法进行包装和除（灭）菌处理，清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净工作台)内。这样可以避免开始实验后因物品不全往返拿取而增加污染机会。

3．严格操作

实验进行前，无菌室及超净工作台以紫外灯照射3060min灭菌，以70%酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10min后，再开始实验操作。实验操作应在超净工作台的中央无菌区域，不要在边缘的非无菌区域操作。

为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。

在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精擦手或用消毒液洗手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入细胞培养室需彻底洗手，戴口罩、着消毒衣帽及鞋等。

在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后一切操作，如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意：金属器械不能在火焰中烧的时间过长，以防退火，烧过的金属镊要待冷却后才能夹取组织，以免造成组织损伤。吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。开启、关闭长有细胞或微生物的培养瓶时，火焰灭菌时间要短，防止因温度过高烧死细胞或微生物。另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。进行无菌操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备用品更换。

工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养用液及其他溶液在未用前，不要过早开瓶；打开瓶盖进行操作时，瓶口朝上与台面呈45度角，减少落菌机会；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。吸取营养液、PBS缓冲液、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防影响试剂的效果、扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能面向操作台讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖部碰到瓶口，则应更换干净吸管。

对于微生物或细胞而言，每次操作只处理一种微生物或一个细胞株，即使培养基相同也不要共享培养基，以免微生物或细胞间污染。

4．善始善终 实验完毕后，应及时将实验物品及废液带出工作台，关闭风机，以70%酒精擦拭无菌操作台面，关闭超净工作台的风机和照明灯，实验结束。尽管每次实验前都会进行工作台面的消毒处理，但建议实验结束后立即打开紫外灯进行消毒，特别是在夏季，以防细菌或霉菌孳生。

无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其他实验用品用完即取出，以利于空气流通。

3.3微量操作技术

在过去的实验中，大家使用的重量和体积计量单位主要是克（g）和毫升（ml）及其以上者，而小于g和ml的单位如毫克（mg）、微克（g）及微升（l）等极少用到。从进入分子生物学实验开始，这些很小的计量单位都将经常使用，甚至更小者如纳克（ng）、皮克（pg）及纳升（nl）等也将用到。由相对宏观的操作突然转为微量操作，对初学者来讲需要有一个熟悉并熟练的过程，关键应当注意以下几个方面的问题。

1. 熟悉并掌握微量称量器具的正确使用方法。微量电子天平（最小感量10-4g）和微量移液器（最大2l）是两种最常使用的器具，它们的使用方法请参考第2章有关内容。准确量取是微量操作的第一步，也是最重要的一步。

2. 添加。将一种或几种液体物质分别准确量取后添加到同一个Eppendorf管中，必须保证看到每一种液体都加入其中，而且在取出移液器时，Tip头的尖部不得带出任何可见的液珠。

3. 混匀并集中。全部液体加完后，总体积只有10到几十微升，难以用常规混匀的方法将各种成分彻底混匀。微量混匀的方法有：旋涡震荡混匀和弹匀。将盛有液体的Eppendorf管盖紧，握紧并将其底部与旋涡震荡器接触，液体会在管内高速旋转而混匀；也可手持盖好的Eppendorf管上端（口部），另一只手反复弹动其底部，将其中的液体混匀。最后，用高速台式离心机将全部液体甩到Eppendorf管的底部。

4. 有时将极微量的物质如DNA片段或质粒DNA溶解在几微升液体中，尽管看不见待溶解物质，但将液体加入后，用上述同样的方法进行操作，也可很好将其溶解并混匀。

5. 由于微量操作，实验结果很难用肉眼直接观察到。为了保证实验的顺利进行，在分子生物学实验过程中，每一步实验的结果都必须利用相关的检测、鉴定方法显示出来，判定正确后再进行下一步反应。这是所有科学实验的共同要求，但在分子生物学实验中更应当强调和加以注意。

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