如果用95%的乙醇提取叶绿素,要注意什么问题

注意事项

1、由于植物子叶中含有水分，故先用纯丙酮进行提取，以色素提取液中丙酮的最终浓度近似80%。

2、由于叶绿素A，B的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差，因此最好能用波长较正确的高级型分光光度计。

实验原理：在叶绿素a和b的吸收光谱曲线中，红波波长范围内，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b的最大吸收峰在645nm。

实验步骤

1、 取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。

2、 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。

3、取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

4、 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。

5、把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。

提取色素：称取5 g的绿叶，剪碎，放入研钵中→加入少量二氧化硅、碳酸钙和10 mL无水乙醇→研磨→过滤→收集到试管内并塞严试管口。

制备滤纸条：将干燥的定性滤纸剪成略小于试管长与直径的滤纸条，将滤纸条的一端剪去两角，在距离剪角一端1cm处用铅笔画一条细的横线。

画滤液细线：用毛细吸管吸取少量的滤液，沿铅笔线均匀地画出一条细线，待滤液干后，再画1～2次。

分离色素：将适量的层析液倒入试管中。结果为滤纸条上呈现四条颜色、宽度不同的色素带。

扩展资料：

叶绿素提取注意事项：

制备滤纸条时，要将滤纸条的一端剪去两角，这样可以使色素在滤纸条上扩散均心，便于观察实验结果。

过滤时不用滤纸过滤而用单层尼龙布过滤是因为滤纸对色素具有吸附作用，若用其过滤，会导致收集到的滤液色素含量少，使实验效果不明显或失败。

分离色素时，一定不要让滤纸条上的滤液细线接触到层析液，这是因为色素易溶解于层析液中，导致色素带不清晰，影响实验效果。

参考资料来源：百度百科-叶绿素

叶绿体中色素提取的原理是：由于光合色素位于叶绿体中的囊状结构上,要把

它提取出来必须破坏叶表皮、细胞壁和细胞膜、叶绿体的双层膜,所以要剪碎后

加二氧化硅研磨,以便使色素充分被提取.又因为叶绿体的色素不溶于水,但可

溶于有机溶剂中,所以还要加入丙酮使色素溶解,来提取各种色素.另外还要加

碳酸钙以保护叶绿体中的色素,原因是加碳酸钙以调节液体的pH,防止叶绿素被

破坏.叶绿体中的色素溶解于有机溶剂如酒精或丙酮(相似相溶),形成色素液.

叶绿素的提取分离及理化性质分析这个实验的注意事项都有什么啊

叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类,这两类色素都不溶于水,而溶于有机溶剂,故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取.

再看看别人怎么说的。

无水乙醇提取是将叶绿体中的叶绿体溶解出来，进入溶液，并不能起到分离色素的效果。乙醇提取只是提取方法，不是分离方法。分离是要靠色谱法等方法进行分离。

（补充资料）：叶绿素提取

高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a (C55H72O5N4Mg)、叶绿素b(C55H70O6N4Mg)、β—胡萝卜素(C40H56)和叶黄素(C40H56O2)等4种。叶绿素a和叶绿素b为吡咯衍生物与金属镁的配合物，胡萝卜素是一种橙色天然色素，属于四萜类，为一长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体，其中，β异构体含量最多。叶黄素为一种黄色色素，与叶绿素同存在于植物体中，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在乙醚中溶解度较小。根据它们的化学特性，可将它们从植物叶片中提取出来，并通过萃取、沉淀和色谱方法将它们分离开来。

2．薄层色谱

薄层层析是快速分离和定性分析微量物质的一种极为重要的实验技术，具有设备简单、操作方便而快速的特点。它是将固定相支持物均匀地铺在玻片上制成薄层板，将样品溶液点加在起点处，置于层析容器中用合适的溶剂展开而达到分离的目的。用此法分离时几乎不受温度的影响，可采用腐蚀性显色剂，而且可在高温下显色，特别适用于挥发性小或在较高温度下易发生反应的物质，同时也常用来跟踪有机反应或监测有机反应完成的程度。

薄层层析的器材选择：

（1）基板：玻璃、塑料、金属箔，常用玻璃板。

（2）吸附剂：

吸附剂要有合适的吸附力，并且必须与展开剂和被吸附物质均不起化学反应。可用作吸附剂的物质很多，常用的有硅胶和氧化铝，由于吸附性好，适用于各类化合物的分离，应用最广。选择吸附剂时主要根据样品的溶解度、酸碱性及极性。氧化铝一般是微碱性吸附剂，适用于碱性物质及中性物质的分离；而硅胶是微酸性吸附剂，适用于酸性物质及中性物质的分离。以下简单介绍吸附剂的几个基本参数。

种类：常用：氧化铝（强极性）、硅胶（中强极性）

不常用：硅藻土、纤维素、糖类、活性碳

符号：H——无任何添加剂；G——加有锻石膏（Gypsum，CaSO4·1/2 H2O）粘合剂；

F——加有荧光素（Fluorescein）

CMC——加有羧甲基纤维素钠（Carboxymethyl cellulose）

例：硅胶GF254表示硅胶中既加有煅石膏粘合剂，也加有荧光素，可以在波长254nm的紫外光下激发出荧光

粒度：目：1cm2内的筛孔数，数目越大，颗粒越小。薄层所用吸附剂颗粒较细，氧化铝为200目，硅胶为100~150目。

μ：颗粒的平均直径，以微米表示。例如：40μ的颗粒与100目相当。

活性：

吸附剂按其含水量的多少各分为五个等级：I级含水量最少，活性最高；V级含水量最多，活性最低；但并不是活性越高分离效果越好，选用哪种活性级别的吸附剂，要用实验的方法来确定。

酸碱性：

市售氧化铝有酸性（用以分离酸性化合物）、中性、碱性（用以分离生物碱等碱性化合物），其蒸馏水洗出液的pH值分别为4、7.5、9—10；其中以中性氧化铝应用最广，可用来分离各种化合物，特别是那些对酸、碱敏感的化合物。

硅胶没有酸碱性之分。

（3）展开剂

在样品组分-吸附剂-展开剂三个因素中。对一确定组分，样品的结构和性质可看作是一不变因素，吸附剂和展开剂是可变因素。而吸附剂的种类有限，因此选择合适的展开剂就成为解决问题的关键。展开剂的选择有以下要求:

（a）对待测组分有很好的溶解度。

（b）能使待测组分与杂质分开，与基线分离。

（c）使展开后的组分斑点圆而集中，不应有拖尾现象。

（d）使待测组分的Rf值最好在0.4~0.5，如样品中待测组分较多，Rf值则可在0.25~0.75范圈内，组分间的Rf值最好相差0.1左右。由于薄层色谱法用途非常广泛，国内外均有现成的铺有吸附剂的薄层板出售。一般实验室中也可自己制备。

(e)不与组分发生化学反应，或在某些吸附剂存在下发生聚合。

(f)具有适中的沸点和较低的粘滞度。

展开剂的极性是指与样品组分相互作用时。展开剂分子与吸附剂分子的色散作用、偶极作用、氢键作用及介电作用的总和。展开剂要根据样品的极性及溶解度，吸附剂活性等因素进行选择，总的原则是展开剂的极性能使组分的Rf值在0.5左右。常用溶剂极性次序是：石油醚<环己烷<苯<乙醚<氯仿<乙酸丁酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇。

如一种溶剂不能充分展开，可选用二元或多元溶剂系统。

4．展开槽与展开：

薄层的展开在密闭的容器即展开槽或称为层析缸中进行。

展开：

合适的展开剂用量为浸及下端硅胶，但不浸及样点；点样端向下，每次只展开一块，放在正中，以免爬斜（进而展开倾斜）。

5．显色：

如果化合物本身有颜色，就可直接观察它的斑点。如果本身无色，可先在紫外灯光下观察有无荧光斑点（有苯环的物质都有），用铅笔在薄层板上划出斑点的位置；对于在紫外灯光下不显色的，可放在含少量碘蒸气的容器中显色来检查色点（因为许多化合物都能和碘成黄棕色斑点），显色后，立即用铅笔标出斑点的位置。常用

普适性显色剂：浓硫酸、碘蒸气、荧光素，专用显色剂：茚三酮、三氯化铁溶液等。

三、实验仪器与药品

仪器：半微量玻璃仪器一箱，小烧杯，层析缸(槽)，载玻片(100mm×25mm)干燥器，电吹风，毛细管，移液管，研钵，布氏漏斗，抽滤装置。

试剂：硅胶，1％ CMC，石油醚（60~90℃），乙醇，丙酮，乙醚，饱和NaCl溶液，无水Na2SO4

四、实验步骤

1．制板：

将硅胶加 1％ CMC，调成桨状(硅胶：CMC=1:3~4)（在平铺玻璃板上能晃动但不能流动），将其涂在载玻片上（100mm×25mm）），为使其坦平，可将载玻片用手端平晃动，至平坦为止，放在干净平坦的台面上，晾干之后放入105℃烘箱活化1小时，取出放入干燥器内待用。

2、叶绿素的提取

在研钵中放入几片(约5g)菠菜叶(新鲜的或冷冻的都可以．如果是冷冻的，解冻后包在纸中轻压吸左水分)。加人10mL2:1石油醚和乙醇混合液，适当研磨。将提取液用滴管转移至分液漏斗中，加人10 mL饱和NaCl溶液(防止生成乳浊液)除去水溶性物质，分去H2O层，再用蒸馏水洗涤两次。将有机层转入干燥的小锥形瓶中，加2g入无水Na2SO4干燥。干燥后的液体倾至另—锥形瓶中(如溶液颜色太浅，可在通风柜中适当蒸发浓缩)。

3、点样

用一根内径 1mm的毛细管，吸取适量提取液，轻轻地点在距薄板一端1.5cm处，平行点两点，两点相距1cm左右。若一次点样不够，可待样品溶剂挥发后．再在原处点第二次，但点样斑点直径不得越过2mm。

4、展开

先在层析缸中放入展开剂[石油醚（60~90℃）-丙酮—乙醚(体积比为3:1:1)]，加盖使缸内蒸气饱10min， 再将薄层板斜靠于层析缸内壁。点样端接触展开剂但样点不能浸没于展开剂中，密闭层祈缸。待展开剂上升到距薄层板另一端约1crm时，取出平放，用铅笔或小针划前沿线位置，晾干或用电吹风吹干薄层。

五、实验注意事项

1．制板时用注意使板上硅胶厚度尽量一致。

2．植物叶片不要研成糊状，否则会给分离造成困难

提取：（1） 取菠菜或其他植物新鲜叶片4-5片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研。（2） 研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2-3ml 95％乙醇，研磨至糊状，再加10-15ml 95％乙醇，离心35min，提取上清液过滤于三角瓶中，残渣用10ml 95％乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。（3） 如无新鲜叶片，也可用事先制好的叶干粉提取。取新鲜叶片（以菠菜叶最好），先用105℃杀青，再在80℃下烘干，研成粉末，密闭储存。用时称叶粉2g放入小烧杯中，加95％乙醇20-30ml 浸提，并随时搅动。待乙醇呈深绿色时，滤出浸提液备用。分离：（1） 取圆形定性滤纸一张（直径11cm），将其剪成滤纸条（9cm×3cm），用滴管吸取乙醇叶绿体色素提取液，沿纸条的长度方向涂在纸条的一边（距边约1cm），使色素扩散的宽度限制在0.5cm以内，风干后，再重复操作数次。（2） 在层析缸中加入适量的推动剂，将滤纸条带有色素的一端插入层析缸中，使滤纸条下端浸入推动剂中。迅速盖好层析缸盖。此时，推动剂借毛细管引力顺滤纸条向上扩散，并把叶绿体色素向上推动，不久即可看到各种色素的条带。（3） 当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，即可看到分离的各种色素：叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。用铅笔标出各种色素的位置和名称。

叶绿体中色素的提取与分离实验中应该用无水乙醇，因为叶绿体色素不溶于水，有水会影响色素的溶解，使实验提取液色素含量减少，实验效果变差。没有无水乙醇时用95%乙醇代替但要加无水碳酸钠，是为了吸去水分，变成无水乙醇。

把新鲜的叶子剪碎，放在烧瓶中，加水使之淹没。用酒精灯加热煮沸，倒去水后，加入70～75％酒精（所加的量，仍以淹没为宜）。在瓶口插上一个玻璃漏斗，把烧瓶放在水浴锅中加热煮沸。若没有水浴锅，可用大烧杯代替。由于叶子内的色素溶解在酒精中，所以烧瓶内的溶液逐渐变为深绿色。然后过滤（过滤时，滤纸要用70～75％的酒精润湿，并且要紧贴在漏斗壁上）。

取3毫升滤液放入一支干净试管，再加入5毫升汽油和几滴水，用大拇指按紧管口，上下摇动几分钟，在试管架上

放置片刻后，则溶液分成上下两层，上层是轻的汽油层，主要含有叶绿素及胡萝卜素，故显绿色。下层是酒精层，主要含有叶黄素，故显黄色。