中盐安徽红四方股份有限公司怎么样

A股上市公司2021年一季报已披露完毕，中报预报也逐渐拉开了序幕，在已经披露完毕的一季报中，我们来梳理一些低估值高成长的上市公司，以飨读者！

梳理指标主要有：1.滚动市盈率低于20倍；2.一季度净利润同比增长超过100%；3.未来一年净利润复合增速实现翻番；

梳理出16家上市公司，具体到行业方面，化工板块个股居多，从2021年一季度净利增长幅度来看，净利同比增超10倍的3家上市公司，分别为新安股份，滨化股份，金晶 科技 ；

其中，排在增幅榜首位的是新安股份，一季度净利增超1323%，滨化股份，金晶 科技 一季度净利分别以1251%，1097%位居第二第三；

其它一季度净利润增幅居前的还有紫天 科技 ，潮宏基，神马股份等；

从机构预测未来一年净利复合增速来看，立华股份以315.06%的增速排在首位，紧随其后的是三友化工和博汇纸业，复合净利润增速分别为287.34%，236.05%；

其他未来一年净利润复合增幅居前的还有阳煤化工，神马股份等；

1.晨鸣纸业：滚动市盈率10.16倍，一季度净利润同比增长481.4%，未来一年净利润复合增速185.23%；

中国造纸龙头，世界纸业10强；拥有全球规模最大、工艺装备最先进的林浆纸一体化工程，形成了以高档胶版纸、铜版纸、白卡纸、轻涂纸、生活纸、静电复印纸、热敏纸、格拉辛纸为主导的高中档并举的八大系列产品结构，年浆纸产能420多万吨；

公司是全国唯一一家A、B、H三种股票上市公司；

2.紫天 科技 ：滚动市盈率12.71倍，一季度净利润同比增长970.3%，未来一年净利润复合增速104.79%；

主营业务为现代广告服务业务。公司的主要产品为液压机、机械压力机、广告服务业。

近几年来，公司注重技术改造，连续的大规模技改投入，公司液压机产品加工、装配综合能力和水平已跃居国内同行业领先水平。

3.博汇纸业：滚动市盈率12.92倍，一季度净利润同比增长337.2%，未来一年净利润复合增速236.05%；

白卡纸龙头，“博汇”牌书写纸、涂布白卡纸是国家火炬计划产品；公司生产胶印纸、书写纸、包装纸、纸板、造纸木浆等；

19年9月，子公司江苏博汇纸业有限公司投资建设的“二期年产75万吨高档包装纸板项目”已正式投产

4.城投控股：滚动市盈率13.69倍，一季度净利润同比增长280.4%，未来一年净利润复合增速109.67%；

城投控股主营业务是地产开发业务、地产运营业务、股权投资业务。业务及服务涵盖商品房、租赁住房、保障房、 科技 园区开发、城市旧区改造、直接股权投资、私募股权投资基金管理。

5.滨化股份：滚动市盈率14.07倍，一季度净利润同比增长1251%，未来一年净利润复合增速133.41%；

国内最大的粒碱生产商，国内食品级烧碱龙头；公司烧碱上下游配套完善，已建立循环经济一体化的产业模式；

公司拥有离子膜烧碱产能61万吨/年，其中粒碱产能20万吨/年，片碱产能20万吨/年；

6.中盐化工：滚动市盈率14.69倍，一季度净利润同比增长315.8%，未来一年净利润复合增速125.38%；

世界金属钠龙头，国内纯碱行业龙头之一；拥有“盐—煤—电—电石－PVC－烧碱”的一体化循环经济产业链；公司目前拥有PVC产能40万吨/年，糊树脂产能4万吨/年

7.三友化工：滚动市盈率14.70倍，一季度净利润同比增长378.9%，未来一年净利润复合增速287.34%；

粘胶短纤产品差别化率行业第一，国内首家通过欧洲一级生态纺织品质量认证企业，国内唯一拥有三代纤维产品的公司；截至19年底拥有粘胶短纤维年产能78万吨，市占率约21%；

8.金晶 科技 ：滚动市盈率15.47倍，一季度净利润同比增长1097%，未来一年净利润复合增速181.56%；

玻璃、纯碱行业龙头，中国平板玻璃标准的制定者；已形成纯碱、玻璃、玻璃深加工产业链；产品涵盖浮法玻璃、深加工玻璃等，产能3000万重量箱；

计划在马来西亚建设1条500t/d前板玻璃生产线和1条500t/d背板玻璃配套联线钢化深加工生产线；

9.阳煤化工：滚动市盈率15.53倍，一季度净利润同比增长150.6%，未来一年净利润复合增速224.19%；

一家主要从事化工产品和化工机械设备的生产和销售。主要产品为尿素、聚氯乙烯、烯烃、烧碱、双氧水、甲醇、丙烯、离子膜烧碱、三氯化磷、三聚氰胺、乙二醇、化工设备、贸易等。

10.神马股份：滚动市盈率16.24倍，一季度净利润同比增长551.8%，未来一年净利润复合增速223.57%；

中国聚酰胺行业的领军企业之一，尼龙66工业丝、帘子布产能规模全球领先；公司主营尼龙66工业丝、帘子布、切片等产品，尼龙66切片产能18万吨/年；

11.百隆东方：滚动市盈率16.81倍，一季度净利润同比增长212.6%，未来一年净利润复合增速109.40%；

国内色纺纱龙头，年生产色纺纱18万吨以上；拥有自主品牌“BROS”高端色纺纱；在越南西宁建立极具现代化气息的大型生产基地，越南百隆已形成90万纱锭产能，占目前百隆全部产能的60%；

12.潮宏基：滚动市盈率16.91倍，一季度净利润同比增长562.5%，未来一年净利润复合增速105.69%；

从事中高端 时尚 消费品的品牌管理和产品的设计、研发、生产及销售，主要产品为珠宝首饰和 时尚 女包，核心业务是对“CHJ潮宏基”、“VENTI梵迪”和“FION菲安妮”三大品牌的运营管理；

公司已发展成为珠宝首饰行业的的领先企业之一，尤其在K金珠宝首饰领域处于行业领先地位；

13.我爱我家：滚动市盈率17.03倍，一季度净利润同比增长205.3%，未来一年净利润复合增速112.59%；

与“链家”并列为国内房产中介两大龙头，在长租公寓业务上，拥有27万套55万间在管房屋套数；

14.新安股份：滚动市盈率17.41倍，一季度净利润同比增长1323%，未来一年净利润复合增速128.12%；

我国第二大有机硅单体生产企业，拥有有机硅单体权益产能34万吨/年；围绕有机硅单体合成，形成硅矿冶炼、硅粉加工、单体合成、下游制品加工的完整产业链，生产硅橡胶、硅油、硅树脂、硅烷偶联剂四大系列产品；

15.立华股份：滚动市盈率18.34倍，一季度净利润同比增长246.4%，未来一年净利润复合增速315.06%；

我国黄羽鸡养殖第二大企业，采用“公司+合作社+农户”的合作养殖模式，主要销往华东；

2020年将在各地推进数家黄羽鸡屠宰加工的建设，以满足一体化养鸡子公司冰鲜鸡的加工需求；

16.万盛股份：滚动市盈率18.48倍，一季度净利润同比增长488.8%，未来一年净利润复合增速119.04%；

磷系阻燃剂全球龙头，有机磷系阻燃剂的下游行业主要为聚氨酯、工程塑料、软质 PVC 材料、橡胶、环氧树脂等行业；

20年7月30日，公司董事会会议审议通过了《关于拟与山东省潍坊滨海经济技术开发区管委会签订功能性新材料一体化生产项目合同书的议案》，该项目建设内容主要包括：7万吨三氯氧磷、12万吨新材料阻燃剂及特种阻燃助剂、2万吨高端环氧树脂及助剂、2万吨表面活性剂，共计23万吨新材料助剂；

1、凉水塔，分为高、中、低温。

还有一种是蒸发式冷却器。用氟里昴降温。多用于冷冻机。

2、用冷冻盐水或冷冻乙二醇，能过换热器同冷却水进行热交换降温。当然这种情况适用于冷却水量较小的情况。

盐水制冰是应用较广泛、历史悠久的一种间接冷却制冰方法，制出的冰坚实、不易融化，便于贮藏和搬运，在国内渔业、食品业、运输业及医疗机构等行业中使用的比较普遍。

中文名称

盐水制冰

特点

坚实、不易融化，便于贮藏和搬运

应用领域

渔业、食品业、运输业及医疗机构

英译

Salt water ice

性质

间接冷却制冰方法

二氧化碳压缩机液态氮气价格盐水间接冷却制冰制冰盐水池制冰芒硝制冰螺杆式蒸汽膨胀发电机盐水冰点水蒸气的温度硝石制冰视频

制冰介绍

盐水制冰是应用较广泛、历史悠久的一种间接冷却制冰方法，制出的冰坚实、不易融化，便于贮藏和搬运，在国内渔业、食品业、运输业及医疗机构等行业中使用的比较普遍。

工艺流程

盐水制冰属于间接冷却系统。传统做法的盐水制冰池中，蒸发器盐水池和制冰盐水池合二为一个制冰池，并用隔板将两者隔开，利用盐水搅拌器使盐水在两个盐水池中循环，冰桶放在制冰盐水池中。盐水在蒸发器盐水池中被降温后，在搅拌器的作用下进入制冰盐水池对冰桶降温，温度升高后的盐水由另一侧流入蒸发器盐水池再行冷却。在盐水制冰设备汇总，制冷剂在蒸发器内吸收盐水的热量，使盐水降温并保持在-10~-14℃左右。当冰桶中的水被冻结后，由吊车依次将冰桶组吊出制冰池放进融冰槽融冰，而后利用倒冰架脱水，并经滑冰道进入冰库储存或直接运走。脱水后的空冰桶经注水后再放入制冰池中继续生产，如此循环。

盐水要求

有关温度的确定

1)盐水温度t1 t1直接影响结冰速度及冰的质量。t1降低，结冰速度加快，但要求蒸发温度较低，使制冷系数下降t1升高，则不利于盐水与冰桶之间的换热，结冰速度减慢。一般t1取-10℃

2)盐水温度与蒸发温度的温差t2 取较大的t2 虽可加快盐水和制冷剂的换热，有利于盐水的降温，但随着t2 增大，必将要求更低的蒸发温度，会导致压缩机单位功耗的增加。因此，蒸发温度与盐水温度之差取5℃。

3)盐水的凝固温度 要使盐水在制冰池中不断循环，就必须保证它在低温下不会冻结。如果盐水的凝固温度接近蒸发温度，盐水就有冻结的危险。但若要求盐水的凝固温度过低，则因盐水浓度的增加使搅拌器的功耗增大。因此，一般将盐水凝固温度定为比蒸发温度低6~8℃。

设备布置

盐水制冰设备主要包括制冰池、蒸发器、冰桶及冰桶架、融冰池、倒冰架、注水器、吊车等，可自行设计、加工，也可从生产厂家购成套设备。

1.制冰池

制冰池用于盛装盐水溶液、蒸发器及冰桶等，一般6~8mm厚的钢板焊接而成。制冰池中焊有隔板，将制冰池分成放置蒸发器和制冰桶两部分。

2.蒸发器

常用的蒸发器有螺旋管式、V型管式、立管式多种。根据制冰池的大小和结构，蒸发器在制冰过程中有集中布置和分散布置等方式。

3.冰桶架和冰桶

冰桶架是搁置在制冰池上的钢制框架，用于搁置冰桶和提冰。冰桶多用1.5~2.0mm厚镀锌钢板制成，可采用焊接形式，也可采用铆钉连接形式。焊接形式的焊缝设在短边中缝处，铆接形式的铆缝设在长边短边交接缝处。桶的上下两端均有钢板箍加固。为了便于脱冰，应做成上大下小的矩形。冰桶架、冰桶制成及试漏后需涂刷防锈漆。

4.搅拌器

盐水搅拌器有立式和卧式两类。

卧式搅拌器由外壳、轴承架、轴、叶轮以及填料压盖等组成。搅拌器伸进制冰池内，由安装在制冰池一端的电动机通过带轮带动工作，因而转动轴与制冰池壁面的密封性要求较高，安装维修麻烦。但卧式搅拌器工作时阻力较小。

立式搅拌器也是成套设备，它由叶轮、主轴、电动机等组成。立式搅拌器的电动机安装在制冰池一端上部，电动机与叶轮通过联轴器连接。工作时，盐水由斗形外壳的上面进入，通过叶轮搅拌，从侧面的出水口送出。出水口设置在蒸发器底板下部，使盐水全部通过蒸发器。立式搅拌器不存在传动轴与制冰池壁面的密封问题，维修较方便。但立式搅拌器工作时阻力较大。

蒸发器盐水池中盐水的流速不小于0.7m/s，制冰盐水池中盐水的流速为0.5m/s。搅拌器应布置在与融冰池相对应的一端，以免吊起的冰桶滴落盐水腐蚀电动机。

5.融冰池

融冰池是用钢板焊成或用混凝土制成的长方形水池，尺寸应比冰桶架大一些。通常在池中设摇摆架，以加快冰块脱模，池上设有进水和排水管道，以便补充高温水及排除低温水。融冰池布置在制冰池出冰侧的一端。

6.倒冰架

倒冰架是将融冰后的冰桶翻倒，使块冰滑出冰桶的设备。多用槽钢、角钢和钢板制作，成L形，两端用轴承支撑。两端装有平衡锤，用于减缓倒冰时的速度和已于复位。

7.滑冰台

滑冰台为具有漏水缝并带有一定坡度的木板台，用于接收倒冰架倒出的冰块，并由此滑入贮冰间。滑冰台应有2%~4%的坡度，靠近墙处应有反向坡度，以免冰块接近墙体。滑冰台的宽度应大于倒冰架，长度为冰块长度的3倍。

8.水预冷器

水预冷器用于制冰水的预冷，以减少制冰池内蒸发器的负荷，缩短制冰时间。水预冷器为长方体水箱，可设置在加水器上方，也可单独安装。箱内装有蒸发器，箱端有搅拌机，以加速热量传递。

9.加水器

它是把自来水或预冷后的制冰水加注到冰桶的装置。加水器由与冰桶数相应的旋转水嘴、定量水箱组成，以确保向各个冰桶中同时等量加水。加水器内每个格的容量为一个冰桶容积的90%。

10.吹气装置

吹起装置是用于制取透明冰的专用设备，主要包括罗茨风机、空气罐及输送管道。在制取透明冰时，罗茨风机将压缩后的高压气体存贮在空气罐里，通过送气管道送入冰桶中，以排除制冰水中溶入的空气，达到制取透明冰的目的。

11.吊车

吊车应为能水平和垂直移动的装置，用于冰桶出冰、加水、入池时的吊运。吊车上升速度为4~8m/min，水平速度为20~30m/min。吊车上有两根同时起落的钢丝绳，必须正对冰桶架上的两个吊环。

此外，对于大、中型制冰间，还可设置冰桶架推进机构等设备，以加快冻结速度。

目前，许多生产厂家已有了制冰成套设备

6.1 内蒙古伊泰煤炭股份有限公司

6.1.1 公司简介

6.1.2 2007年1-12月伊泰煤炭经营状况分析

6.1.3 2008年1-9月伊泰煤炭经营状况分析

6.1.4 伊泰投入巨资发展煤化工项目

6.2 内蒙古远兴能源股份有限公司

6.2.1 公司简介

6.2.2 2007年1-12月远兴能源经营状况分析

6.2.3 2008年1-9月远兴能源经营状况分析

6.2.4 远兴能源加快煤化工产业发展

6.3 内蒙古伊东煤炭集团有限责任公司

6.3.1 公司简介

6.3.2 2007年伊东集团循环经济产业基地建设概况

6.3.3 2008年伊东与西蒙合资上马煤制甲醇项目

6.3.4 未来伊东集团发展的战略规划

6.4 神华蒙西煤化股份有限公司

6.4.1 公司简介

6.4.2 神西煤化工产业实行循环经济成效显著

6.4.3 2008年神西主要生产经营指标

6.4.4 2008年上半年神西经营利润创新高

6.5 其他企业介绍

6.5.1 中汇煤化工（内蒙古）有限公司

6.5.2 内蒙古三维煤化工科技有限公司

6.5.3 通辽金煤化工有限公司

6.5.4 神华包头煤化工有限公司

6.5.5 呼伦贝尔东能化工有限公司

6.5.6 呼伦贝尔金新化工有限公司

重点项目有

在高利润的驱动下，2006年至2008年，在煤炭资源丰富的鄂尔多斯、锡林郭勒、呼伦贝尔等煤炭集中地，煤化工开始“井喷”。很快便形成了包括大唐多伦煤制烯烃项目、新奥集团二甲醚项目、包头神华煤制烯烃项目、通辽煤化工乙二醇项目、神华集团煤直接液化项目、伊泰集团间接法煤制油项目等较大规模的煤化工项目等33项煤化工重点项目。这些项目的投资规模均以数十亿、数百亿计算。截至2008年，煤化工投资总额几乎占到化工产业总额的37.6%，共计420亿元。

2009年，内蒙古将研究国家产业政策，根据政策导向和市场需求，加大对化工产业的调控力度，避免盲目发展。将重点拓展煤化工领域，为尽快形成千万吨级煤化工生产能力奠定基础。2009年将以洁净煤气化为龙头，围绕“化肥、甲醇、芳烃、合成油”四条主线，进一步推进新型煤化工产品链，形成千万吨级煤化工生产能力。在内蒙古蒙西地区，重点推进大型煤炭液化、煤焦化、甲醇、二甲醚、甲醇制烯烃、煤焦油深加工项目建设；蒙东地区主要推进煤基烯烃、甲醇、二甲醚、焦化、腐植酸、尿素等大型项目建设。将确保神华集团鄂尔多斯煤制油项目达产达标，重点抓好神华包头煤制烯烃项目、大唐多伦煤基烯烃、三联化工集团公司聚氯乙烯项目、中盐吉兰泰聚氯乙烯二期、中天合创二甲醚、神华煤焦化等一系列化工续建项目和计划开工项目的建设工作。

内蒙古已初步规划在东部地区发挥优势，建设呼伦贝尔、霍林河、锡林浩特3个大型煤化工基地，把内蒙古东部地区建成国家重要的现代煤化工基地。内蒙古规划到2010年在建甲醇生产能力达540万吨（二甲醚100万吨）、低温热解褐煤生产能力1,500万吨。到2020年，内蒙古东部地区将建设成为国家重要的现代煤化工基地。

中国投资网 2009-2012年内蒙古煤化工产业投资分析及前景预测报告

内蒙古煤化工重点企业

6.1 内蒙古伊泰煤炭股份有限公司

6.1.1 公司简介

6.1.2 2007年1-12月伊泰煤炭经营状况分析

6.1.3 2008年1-9月伊泰煤炭经营状况分析

6.1.4 伊泰投入巨资发展煤化工项目

6.2 内蒙古远兴能源股份有限公司

6.2.1 公司简介

6.2.2 2007年1-12月远兴能源经营状况分析

6.2.3 2008年1-9月远兴能源经营状况分析

6.2.4 远兴能源加快煤化工产业发展

6.3 内蒙古伊东煤炭集团有限责任公司

6.3.1 公司简介

6.3.2 2007年伊东集团循环经济产业基地建设概况

6.3.3 2008年伊东与西蒙合资上马煤制甲醇项目

6.3.4 未来伊东集团发展的战略规划

6.4 神华蒙西煤化股份有限公司

6.4.1 公司简介

6.4.2 神西煤化工产业实行循环经济成效显著

6.4.3 2008年神西主要生产经营指标

6.4.4 2008年上半年神西经营利润创新高

6.5 其他企业介绍

6.5.1 中汇煤化工（内蒙古）有限公司

6.5.2 内蒙古三维煤化工科技有限公司

6.5.3 通辽金煤化工有限公司

6.5.4 神华包头煤化工有限公司

6.5.5 呼伦贝尔东能化工有限公司

6.5.6 呼伦贝尔金新化工有限公司

重点项目有

在高利润的驱动下，2006年至2008年，在煤炭资源丰富的鄂尔多斯、锡林郭勒、呼伦贝尔等煤炭集中地，煤化工开始“井喷”。很快便形成了包括大唐多伦煤制烯烃项目、新奥集团二甲醚项目、包头神华煤制烯烃项目、通辽煤化工乙二醇项目、神华集团煤直接液化项目、伊泰集团间接法煤制油项目等较大规模的煤化工项目等33项煤化工重点项目。这些项目的投资规模均以数十亿、数百亿计算。截至2008年，煤化工投资总额几乎占到化工产业总额的37.6%，共计420亿元。

2009年，内蒙古将研究国家产业政策，根据政策导向和市场需求，加大对化工产业的调控力度，避免盲目发展。将重点拓展煤化工领域，为尽快形成千万吨级煤化工生产能力奠定基础。2009年将以洁净煤气化为龙头，围绕“化肥、甲醇、芳烃、合成油”四条主线，进一步推进新型煤化工产品链，形成千万吨级煤化工生产能力。在内蒙古蒙西地区，重点推进大型煤炭液化、煤焦化、甲醇、二甲醚、甲醇制烯烃、煤焦油深加工项目建设；蒙东地区主要推进煤基烯烃、甲醇、二甲醚、焦化、腐植酸、尿素等大型项目建设。将确保神华集团鄂尔多斯煤制油项目达产达标，重点抓好神华包头煤制烯烃项目、大唐多伦煤基烯烃、三联化工集团公司聚氯乙烯项目、中盐吉兰泰聚氯乙烯二期、中天合创二甲醚、神华煤焦化等一系列化工续建项目和计划开工项目的建设工作。

内蒙古已初步规划在东部地区发挥优势，建设呼伦贝尔、霍林河、锡林浩特3个大型煤化工基地，把内蒙古东部地区建成国家重要的现代煤化工基地。内蒙古规划到2010年在建甲醇生产能力达540万吨（二甲醚100万吨）、低温热解褐煤生产能力1,500万吨。到2020年，内蒙古东部地区将建设成为国家重要的现代煤化工基地。

外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口（图1.8），当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌ＤＮＡ连接酶和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶。实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶都是首选的用酶。这是因为在下述反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。

ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。在加作用的底物。如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。这样，在ＤＮＡ浓度低时，质粒ＤＮＡ重新环化将卓有成效。如果连接反应中ＤＮＡ浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也有所增大。因此在ＤＮＡ浓度高时，连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。Dugaiczyk等(1975同时参见Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第２、３期合刊）从理论上探讨了ＤＮＡ浓度对连接产物性质的影响。简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j和i。j是ＤＮＡ分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的ＤＮＡ呈随机卷曲。这样，j与ＤＮＡ分子的长度成反比（因为ＤＮＡ越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互作用），因此j对给定长度的ＤＮＡ分子来说是一个常数，与ＤＮＡ深度无关。j＝[3/(3πlb0)]3/2其中l是ＤＮＡ长度，以cm计，b是随机卷曲的ＤＮＡ区段的长度。b的值以缓冲液的离子强度为转移，而后者可影响ＤＮＡ的刚度。

i是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml这里Ｎo是阿佛伽德罗常数，Ｍ是ＤＮＡ的摩尔浓度（单位：mol/L)。理论上，当j=i时，给定ＤＮＡ分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。因而在这样的条件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。而当j>i时，有利于重新环化；当i>j，则有利于产生多联体。图1.9显示了ＤＮＡ区段的大小与连接反应混合物中j:i之比分别为0.5、1、2和5时所需ＤＮＡ浓度之间关系（Ｄugaiczyk等，1985）。现在考虑如下的连接反应混合物：其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源ＤＮＡ片段。对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组基因组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响，而且还受质粒和外源ＤＮＡ末端的相对浓度的影响。当i是j的２－３倍（即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时）外源ＤＮＡ末端浓度的２倍时，有效重组体的产量可达到最大。这些条什下，连接反应终产物的大约40％都是由单体质粒与外源ＤＮＡ所形成的嵌合体。当连接混合物中线性质粒的量恒定（j:i=3）而带匹配末端的外源ＤＮＡ的量递增时，这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。

涉及带粘端的线状磷酸化质粒ＤＮＡ的连接反应应包含：

１）足量的载体ＤＮＡ，以满足j:i>1和j:i<3。对一个职pUC18一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体ＤＮＡ为20-60μg/ml。

２）末端浓度等于或稍高于载体ＤＮＡ的外源ＤＮＡ，如外源ＤＮＡ浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒ＤＮＡ或发迹克隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。

(二）粘端连接

１）用适当的限制酶消化质粒和外源ＤＮＡ。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒ＤＮＡ。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化ＤＮＡ，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。

２）按如下所述设立连接反应混合物：

a．将0.1μl载体ＤＮＡ转移到无菌微量离心管中，加等摩尔量的外源ＤＮＡ。

b．加水至7.5μl，于45℃加温５分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到０℃。

c．加入：10xT4噬菌体ＤＮＡ连接酶缓冲液 １μl

Ｔ４噬菌体ＮＤＡ连接酶 0.1Weiss单位

５mmol/L ATP 1μl

于16℃温育１－４小时

10xT4噬菌体ＤＮＡ连接酶缓冲液

200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)

50mmol/K MgCl2

50mmol/L二硫苏糖醇

500μg/ml牛血清白蛋白（组分Ｖ.Sigma产品）（可用可不用）

该缓训液应分装成小份，贮存于－20℃。

另外，再设立两个对照反应，其中含有（１）只有质粒载体；（２）只有外源ＤＮＡ片段。如果外源ＤＮＡ量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒ＤＮＡ，并尽可能多加外源ＤＮＡ，同时保持连接反应体积不超过10μl。可用至少３种不同方法来测定Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶的活性。大多数制造厂商（除New England Biolabs公司外）现在都用Weiss等，１1968)对该酶进行标化。１个Weiss单位是指在37℃下20分钏内催化１mmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]ATP所需酶时，１个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位（Modrich和Lehman,1970)或者60个粘端单位（如Ｎew England Biolabs公司所定义）。因此，0.015Ｗeiss单位的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶在16℃下30分钟内可使50％的λ噬菌体HindⅢ片段（5μg）得以连接。在本书中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶一律用Weiss单位表示。\par 目前提供的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶均为浓溶液（1-5单位/μl），可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50％甘稀释成100单位/ml的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的Ｔ４噬体ＤＮＡ连接酶于-20℃保存３个月可保持稳定。

３）每个样品各取１－２μl转化大肠杆菌感受态细胞。

（三）平端ＤＮＡ连接

Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶不同于大肠杆菌ＤＮＡ连接酶，它可以催化平端ＤＮＡ片段的连接（Sgaramella和Khorana,1972Sgaramella和Ehrlich,1978），由于ＤＮＡ很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何ＤＮＡ分子彼此相连。然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下４个条件：

１）低浓度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。

２）不存在亚精胺一类的多胺。

３）极高浓度的连接酶（50Weiss单位．ml）。

４）高浓度的平端。

１．凝聚剂

在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致ＤＮＡ分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983Zimmerman和Pheiffer,1983ZimmermanT Ｈarrison,1985)或氯化六氨全高钴（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得适当浓度的平端ＤＮＡ的总是迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：

１）它们可使平端ＤＮＡ的连接速率加大１－３个数量级，因此可使连接反应在酶ＤＮＡ浓度不高的条件下进行。

２）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的ＤＮＡ浓度下，所有的ＤＮＡ产物也将是线状多聚体。\par 在设立含凝聚剂的连接反应时，下列资料可供参考。

（１）聚乙二醇（PEG8000）

１）用去离子水配制的ＰＥＧ8000贮存液（40％）分装成小份，冰冻保存，但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15％PEG 8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著。除PEG 800和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于０℃混合，然后加适当体积的PEG 8000（处于室温），混匀，加酶后于20℃进行温育。

２）连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至ATP浓度略有增加或ＭgCl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。

３）浓度为15％的PEG 8000可刺激带粘端的ＤＮＡ分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体。

４）PEG 8000可刺激短至８个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。

（２）氯化六氨合高钴

１）氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5μmol/L时，其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部，但只能使端连接的效率提高到原来的５倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。

２）在单价阳离子（30mmol/L KCl）存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状ＤＮＡ将点尽优势。

３）与ＰＥＧ 8000不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。

（四）质粒载体中的快速克隆

质粒克隆中最慢的步骤是所需的外源ＤＮＡ片段和相应质粒ＤＮＡ区段的电泳纯化，下面的操作方案[由S.Michaelis(个人通讯）根据Struhl(1985)的方法修订而成]是从纯化的凝胶中回收琼脂糖块，熔化后直接进行质粒和外源ＤＮＡ的连接。这一方法寻平端连接和粘端连接都同样奏效，但需大量的连接酶，而且效率要比标准操作方案约低一个数量级。

１）用适当的限制酶消化外源ＤＮＡ，其量应足以产生约0.2μg的靶片段。反应体积应为20μl或更小。在另一管中，用相应的限制酶消化约0.5μg载体ＤＮＡ，总反应体积为20μl或更小。如载体ＤＮＡ带相同的端，应用磷酸处理如下：用限制酶消化完全后，加2.5μl 100mmol/L Tris.Cl(pH8.3)、10mmol/L ZnCl2,加0.25单位牛小肠碱性磷酸酶，于37℃温育30分钟。

２）通过琼脂糖凝胶电泳分离目标片段。务必用低熔点琼脂糖灌制凝胶，务必用含溴化乙锭（0.5μg/ml）的１xTAE作为电泳缓冲液而不是常规的0.5xTBE来配制凝胶并进行电泳。

３）在长波长紫外照射下检查凝胶，根据目标条带的相对荧光强度估计所含ＤＮＡ的量（见附录Ｅ）。用刀片切出目标条带，尽可能少琼脂糖的体积（通常40-50μl)。将切下凝胶片分别放入作好标记的各个微量离心管中。

４）于70℃加热10-15分钏，使琼脂糖熔化。

５）合并熔化的小份凝胶并放到加温至37℃的中一管中，共终体积应不超过10μl,外源ＤＮＡ与质粒载体的摩尔比应接近２：１。

用另外两个管设立两个对照连反应，一个只含质粒载体，另一个只含外源ＤＮＡ片段。

６）将３个管于37℃温育5-10分钟，然后每管加10μl用冰预次的２xT４噬体ＤＮＡ连接酶混合物，在琼脂糖凝固前，充他混匀各管内容物，于16℃温育12-16小时。

２xT４噬菌体ＤＮＡ连接酶混合物可制备如下：

1mol/L Tris.Cl(pH7.6) 1.0μl

100mmol/L氯化镁 1.0μl

200mmol/L三硫苏糖醇 1.0μl

10mmol/L ATP 1.0μl

水 5.5μl

Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶 １Ｗeiss单位

混匀后放置于冰浴上。

７）连接反应行将结束时，取出贮存于-70的３管各200μl的冻存大肠杆菌感受态细胞

８）于70℃中热10-15分钟重新溶化连接混合物中的琼脂糖。

９）立即从每管连接混全物中取出５μl加到200μl大肠杆菌感受态细胞中，小心摇晃，快速地混匀内容物。从剩下每管连接混合物中分别再取５μl重复以上步骤，将转化混合物在冰浴上放置30分钟。

10）完成转化方案的其余各步 分子克隆化是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。克隆(clone,clon)一词源于希腊文Klon，原意为树木的枝条。在生物学中其名词含义系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖(细胞)系；其动词(clone,cloned,cloning)含义指在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中，即分子克隆技术。将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA和cDNA克隆两类。cDNA克隆是以mRNA为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA)，再与载体DNA分子连接引入寄主细胞。每一cDNA反映一种mRNA的结构，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。特点是：①有些生物，如RNA病毒没有DNA，只能用cDNA克隆；②cDNA克隆易筛选，因为cDNA库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一个mRNA的信息；③cDNA能在细菌中表达。cDNA仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。分子克隆化-方法(1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA。(2)载体DNA的选择：①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松驰型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。②噬菌体DNA：常用的λ噬菌体的DNA是双链，长约49kb，约含50个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。M13噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体，又能方便地制备单链DNA，用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交。③拷斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体－质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb的外源DNA片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。(3)DNA片段与载体连接：DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接。④人工接头分子连接，在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率。以λ或Cos质粒为载体时，形成线性多连体DNA分子，载体与DNA片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。(4)引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大，转化困难。②转导，病毒类侵染宿主菌的过程称为转导，一般转导的效率比转化高。(5)克隆的选择：①直接筛选：有些载体带有可辨认的遗传标记，能有效地将重组分子与本底区分。例如：有些λ噬菌体携带外源基因后形成的噬菌斑就会从原来的混浊变为清亮；还有些载体分子携带外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的颜色有明显变化，如蓝色变为无色；有些λ噬菌体能侵染甲菌而不能侵染乙菌，携带外源DNA片段后便能侵染乙菌，因此乙菌释放的噬菌体均为重组分子。②间接筛选：有引起载体分子带有一个或多个抗药性标记基因，当外源DNA插入到抗药基因区后，基因失活，抗性消失。如一质粒有A和B两个抗药性基因，当外源基因插入到B基因区后，便只抗A药而不抗B药。因此能在A药培养基上正常生长而不能在B药培养上生长的便是重组分子。③核酸杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到硝酸纤维膜等支持物上，变性后固定在原位，然后与标记的核酸探针进行杂交。阳性点的位置就是所需要的克隆。④免疫学方法：如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。分子克隆化-重要意义分子克隆技术是70年代才发展起来的，它的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域，打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新物种的大门。它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。在医学方面，利用分子克隆技术已将胰岛素，人、牛和鸡的生长激素、人的干扰素、松驰素、促红细胞生长激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用发酵工业进行了大规模生产。还可提高微生物本身所产生的蛋白酶类和抗生素类药物的产量。在基因治疗方面。通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠肿瘤细胞，在温度高时可逆转为正常细胞。为治疗半乳糖血症，用带有大肠杆菌乳糖操纵子的λ噬菌体去感染半乳糖血症患者的离体培养细胞，发现这种细胞的半乳糖苷酶达到了正常水平，并确实能代谢半乳糖。在工业生产方面，以分子克隆技术为主体的基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，四者紧密联系、常综合利用。许多化学试剂如丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、环氧乙烷、乌头酸和水杨酸等都可能利用分子克隆技术得到产品。在环境保护方面，人们根据需要进行基因操作，将某种微生物的基因转入另一微生物，创造一些对有害物质降解能力更强的新菌种，以分解工业污水中的有毒物质。在食品工业方面，细菌可为人类生产有价值的蛋白质、氨基酸和糖等。在农业生产方面，植物遗传工程对提高农作物的产量、培育新的农作物品种提供了可能。有许多外源基因导入植物获得成功。