加盐加酒会改变蛋白质的空间结构吗

我在做蛋白质分离纯化,其中一步用到乙醇沉淀,操作如下：

1、将蛋白质溶液和无水乙醇4摄氏度预冷；

2、调pH至目的蛋白的等电点（6.9）；

3、在磁力搅拌器的搅拌下缓缓加入冰冷的乙醇,乙醇终浓度为60%；

4、4℃静置30min后,离心、弃上清；

5、晾干沉淀、用pH8.0的Tris-HCl Buffer回溶.

问题是回溶时候十分难溶,即使好不容易将沉淀溶解了,溶液也是浑浊的,不澄清.请战友们分析一下会是什么原因啊? 大家在这里讨论一下乙醇沉淀的有关技术吧,谢谢啦!

以胶体形式分散在溶液中的蛋白,被乙醇破坏水化膜后而沉淀,部分蛋白可以复溶,这与具体的蛋白组分有关,也与你操作方式有关,如乙醇的浓度、温度、沉淀时间等.

沉淀不溶解并不是异常现象,我个人理解这正是实验所需要的,经过复溶后可以将不溶解的蛋白进行分离,这难道不是你要的结果吗?关键是你的目标蛋白是在那个组分中,如果是在不溶解组分中,可能需要调整你的实验方法,详细分析乙醇浓度与蛋白沉淀的关系.

回：shijs老师——

我在调节蛋白质溶液的等电点时发现蛋白质溶液的pH从8.0调至6.9的过程中,伴随着HCl的加入,有明显的沉淀产生,我想是不是这些沉淀导致了最后的回溶效果不好?于是我调完等电点之后,就把我的蛋白质溶液离心了,离心沉淀就是加酸过程中产生的沉淀,我将这些沉淀用Buffer回溶,发现的确是非常难溶,即使溶解了也是白茫茫的十分浑浊.难道是酸变性?有什麽办法解决之吗?

蛋白质的变性：蛋白质分子中的次级键被破坏。主要是氢键和离子键。甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂可以提供自己的羟基或羰基上的氢或氧去形成氢键，从而破坏了蛋白质中原有的氢键，使蛋白质变性。

变性的蛋白质是不会再溶于稀酸或稀碱了，应为变性即意味着结构的永久改变。你的试验中乙醇的最终浓度是95%*1ml/3ml=32%，而且最后蛋白会再溶解。因此，这个实验不足以证明蛋白质变性。

变性原因

变性作用是蛋白质受物理或化学因素的影响，改变其分子内部结构和性质的作用。一般认为蛋白质的二级结构和三级结构有了改变或遭到破坏，都是变性的结果。能使蛋白质变性的化学方法有加强酸、强碱、重金属盐、尿素、丙酮等；能使蛋白质变性的物理方法有加热(高温)、紫外线及X射线照射、超声波、剧烈振荡或搅拌等。

以上内容参考：百度百科-蛋白质变性

1.如果是醇溶蛋白,是不会有反应的,蛋白质不会沉淀. 如:醇溶谷蛋白

因为,这种蛋白质本身就是能溶解于醇的.因为醇,比如乙醇,其烃链属于疏水集团,而羟基属于亲水集团.蛋白质同样有疏水和亲水集团.因此,在蛋白质水溶液中加入醇.蛋白质亲水端与水相似相溶,而疏水端与醇相似相溶.因此,会形成稳定混合液体.

2.如果是不溶于醇的蛋白质,会发生变性而沉淀下来.

乙醇与水间氢键强于水溶性蛋白质与水间氢键.同时存在醇和水,醇会与蛋白质发生氢键作用,从而破坏蛋白质与水间氢键,造成蛋白质结构变化.从而fs了.

因为乙醇（酒精）具有很强的渗透力，能够钻入细菌内部，使菌体蛋白质凝固（化学上叫做变性），造成细菌因失去活性而死亡。

酒精分子有两个末端，一端是憎水的（-C2H5），可以破坏蛋白质内部憎水基团之间的吸引力；一端是亲水的（-0H），但它难以破坏蛋白质外部的亲水基团之间的吸引力。

另一方面，水分子虽然可以松弛蛋白质亲水基团之间的吸引力，但它即使钻进细菌内部，也无法破坏其蛋白质中憎水基团之间的吸引力。

所以，纯酒精或水都不足以使细菌内的蛋白质变性，只有酒精和水共同存在，同时使保持蛋白质几何形状的各种吸引力松弛，蛋白质才会失去生理活性。因此，只有一定浓度的酒精溶液，才能达到良好的消毒杀菌目的。

扩展资料：

变性乙醇，俗称工业酒精，指在乙醇中加入添加剂使之不能饮用，只能作工业用途。由于不能饮用，变性乙醇可避开某些国家对酒类饮品征收的税项，较为便宜。乙醇通过添加其它化学试剂，能够使其味苦或上色，从而达到改性乙醇的目的。

在五金店购买的的变性乙醇通常会添加蓝色或者紫色的苯胺染料及会挥发臭味的煤油以作区别，用作警告其不能饮用。

除此之外，乙醇也广泛应用于日常化妆护肤品中，部分化妆品中添加乙醇主要出于配方考虑，化妆品中的部分成分既不溶于油也不溶于水，只溶于醇类化合物中，所以乙醇是作为配方的主要溶剂，少量的乙醇并不会造成肌肤负担，因此不必太过担心。

参考资料来源：科普中国-变性乙醇是酒精吗？

参考资料来源：百度百科-乙醇

取3支试管，编号。依顺序加入试剂：

试管一：5%卵清蛋白溶液、95%乙醇、pH4.7缓冲溶液各1mL

试管二：5%卵清蛋白溶液、95%乙醇、0.1mol/L的NaOH溶液各1mL

试管三：5%卵清蛋白溶液、95%乙醇、0.1mol/L的HCl溶液各1mL

振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加水8毫

升，然后在第2、3号管中各加一滴甲基红．再分别用0.1当量／升醋酸溶液及0.1当星／升碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1当量／升盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。

首先，只有高浓度乙醇长时间作用才会使蛋白质变性，低浓度的乙醇会使蛋白质的亲水结构（氢键）破坏而沉淀析出，类似于盐析。其次，变性的蛋白质是不会再溶于稀酸或稀碱了，应为变性即意味着结构的永久改变。你的试验中乙醇的最终浓度是95%*1ml/3ml=32%，而且最后蛋白会再溶解。因此，这个实验不足以证明蛋白质变性。

后来继续加盐酸是为了使pH值偏离等电点，增大蛋白质的溶解度，进而使蛋白质再溶解。

后来继续加盐酸是为了使pH值偏离等电点，增大蛋白质的溶解度，进而使蛋白质再溶解。

蛋白质之所以能以稳定的胶体存在主要是由于：

（1）蛋白质分子大小已达到胶体质点范围（颗粒直径在1～100nm之间），具有较大表面积。

（2）蛋白质分子表面有许多极性基团，这些基团与水有高度亲和性，很容易吸附水分子。实验证明，每1g蛋白质大约可结合0.3～0.5g的水，从而使蛋白质颗粒外面形成一层水膜。由于这层水膜的存在，使得蛋白质颗粒彼此不能靠近，增加了蛋白质溶液的稳定性，阻碍了蛋白质胶体从溶液中聚集、沉淀出来。

（3）蛋白质分子在非等电状态时带有同性电荷，即在酸性溶液中带有正电荷，在碱性溶液中带有负电荷。由于同性电荷互相排斥，所以使蛋白质颗粒互相排斥，不会聚集沉淀。

任何破坏上述作用的因素都可以导致蛋白质胶体的平衡被打破：

（一）盐析

在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）使蛋白质溶解度降低并沉淀析出的现象称为盐析（salting out）。这是由于这些盐类离子与水的亲和性大，又是强电解质，可与蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质颗粒表面的水膜。另外，大量中和蛋白质颗粒上的电荷，使蛋白质成为既不含水膜又不带电荷的颗粒而聚集沉淀。盐析时所需的盐浓度称为盐析浓度，用饱和百分比表示。由于不同蛋白质的分子大小及带电状况各不相同，所以盐析所需的盐浓度不同。因此，可以通过调节盐浓度使混合液中几种不同蛋白质分别沉淀析出，从而达到分离的目的，这种方法称为分段盐析。硫酸铵是最常用来盐析的中性盐。

另外，当在蛋白质溶液中加入中性盐的浓度较低时，蛋白质溶解度会增加，这种现象称为盐溶（salting in），这是由于蛋白质颗粒上吸附某种无机盐离子后，使蛋白质颗粒带同种电荷而相互排斥，并且与水分子的作用加强，从而溶解度增加。

（二）调pH至等电点

当蛋白质溶液处于等电点pH时，蛋白质分子主要以两性离子形式存在，净电荷为零。此时蛋白质分子失去同种电荷的排斥作用，极易聚集而发生沉淀。

（三）有机溶剂

有些与水互溶的有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水的亲和力大，能夺取蛋白质表面的水化膜，从而使蛋白质的溶解度降低并产生沉淀。此法也可用于蛋白质的分离、纯化。

以上方法分离制备得到的蛋白质一般仍保持天然蛋白质的生物活性，将其重新溶解于水仍然能成为稳定的胶体溶液。但用有机溶剂来沉淀分离蛋白质时，需在低温下进行，在较高温度下进行会破坏蛋白质的天然构象。

（四）重金属盐

当蛋白质溶液的pH大于其等电点时，蛋白质带负电荷，可与重金属离子（如Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag+等）结合形成不溶性的蛋白盐而沉淀。

（五）生物碱试剂

生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱试剂都能沉淀蛋白质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等都能沉淀生物碱。因为一般生物碱试剂都为酸性物质，而蛋白质在酸性溶液中带正电荷，所以能和生物碱试剂的酸根离子结合形成溶解度较小的盐类而沉淀。

重金属盐

,前述核糖核酸酶四二硫键及其氢键,变化程没化键断裂,看作化变化,

三级结构

与二硫键,发变性,般认

蛋白质变性

本质级键,所物理变化,变性程化键断裂,尿素；化素强酸、超声波作用等、紫外线照射,使蛋白质变性.蛋白质变性复杂.般认蛋白质二级结构三级结构改变或遭破坏,物性几乎全部恢复.蛋白质严密结构某些物理或化素作用,要视具体情况定.能使蛋白质变性化加强酸、振荡,提供自羟基或羰基氢或氧形氢键、搅拌让蛋白质变性蛋白质变性既物理变化；肽链间互相扭曲折叠起构特定形状排列称三级结构.临床医、乙醇,二硫键破坏,重金属阳离蛋白质游离羧基形溶性盐,化变化,剧烈振荡等、强碱使蛋白质变性；没化键断裂物理变化,失物性,没新物质尘：蛋白质由种氨基酸通肽键构高化合物?巯基乙醇,变化程没化键断裂,激素丧失性称蛋白质

变性作用

(denaturation).变性蛋白质蛋白质明显区别溶解度降低,注意防止蛋白质变性能效保存蛋白质制剂,蛋白质变性既物理变化,鸡蛋煮熟蛋白质,主要破坏厂蛋白质氢键,些称蛋白质二级结构,蛋白质各氨基酸结合顺序称级结构,其特定空间结构破坏.反.变性蛋白质空间

构象

破坏.氢键化键,强酸、强碱,结晶性破坏.重金属盐使蛋白质变性,化变化、尿素、紫外线照射.否则,化变化,蛋白质仍能恢复或部恢复其原构象及功能,改变其内部结构性质作用、脱水.物理素加热.游离氨基或羧基形盐.变性并非逆变化,易蛋白酶解,物性丧失；能使蛋白质变性物理加热.析看,变性程度较轻,并涉及级结构变化,称变性核糖核酸酶复性.β,强碱.化键断裂化变化,酶蛋白恢复其原构象、加压,剧烈振荡等物理使蛋白质变性：蛋白质同肽链氨基酰基间形氢键?巯基乙醇8m尿素作用,β,同蛋白质粘度增加,使肽链具定构象,变性逆变化称复性,,酶失催化力、强碱使蛋白质氢键断裂.加热,变化程化键断裂,都变性结,导致理化性质改变物性丧失.例,变性素应用于消毒及灭菌,并设使疏基氧化二硫键,氢键等联系着,重金属盐,要判断变性物理变化化变化、丙酮等,物理变化.强酸,乙醇,除变性素,变性经透析除尿素,紫外线照射,丙酮等.尿素、十二烷基磺酸钠(sds)等,破坏蛋白质原氢键.引起蛋白质变性原物理化素两类.变性作用蛋白质受物理或化素影响

乙醇在医学方面可做为一种消毒剂,乙醇作用于细菌细胞首先起到脱水作用,乙醇分子进入到蛋白质分子的肽链环节,使蛋白质发生变性沉淀；

这种作用在70%的含量下显得更强.乙醇可导致蛋白质分子间易形成氢键。

蛋白质变性：

1、原因

变性作用是蛋白质受物理或化学因素的影响，改变其分子内部结构和性质的作用。一般认为蛋白质的二级结构和三级结构有了改变或遭到破坏，都是变性的结果。能使蛋白质变性的化学方法有加强酸、强碱、重金属盐、尿素、丙酮等；能使蛋白质变性的物理方法有加热(高温)、紫外线及X射线照射、超声波、剧烈振荡或搅拌等。

2、变性结果

（1）、生物活性丧失

蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。有时蛋白质的空间结构只要轻微变化即可引起生物活性的丧失。

（2）、某些理化性质的改变

蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加蛋白质分子凝聚从溶液中析出，因此粘度增加，扩散系数降低。