RNA 酚污染 怎么避免

通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。0T3z(F&_,D6c%^"h6YA6_RNA提取的一般步骤-O:Y+x$p#s8U4M9S所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。(O(g^+K)f+i&]%P实验步骤：*l&d6s5e(q1F(g2|j,^0s破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。6D8}.QY,g*X1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。"s%f,`0[1d*m!]0e2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。&X.P)i)YL#u/[3、沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc（pH-5.2）或异丙醇。2@0d&z7?+i,g1@4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。3@%V"o9v+I1J2o9k"z5、融解RNA一般使用TE。L5f.n6}(S1t%Z&J6、保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g离心5分钟。&P3[7m*^$U$_"?:F"xu*N(?(I氯化锂法提取总RNA："u}'I!r'^'^&l本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片断丢失的缺陷。#~*S:}9`*r4Z3P试验试剂："d$r6Q+_.I8Q1、氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M)尿素、360g(6M)加水至1L，过滤灭菌】7_8w1t"o9a'q!i4Z2、悬浮液【10mM?Tris-HCL(pH7.6),1mM?EDTA(pH8,0),0.5%SDS】!m8Q4R,]&y:b#`7d试验步骤：7[6?$`*}o7_Z'{1、对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5－10ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中。&Y)b:E,Q"l/^Q:\$s2、匀桨液在0－4℃放置4小时后，12000g离心30分钟。x-C6D-N/N0K!t2a3、取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液，重复步骤2。)y-x)S0K9y6j,e4、沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15－30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟。3d2v'i1~(~*D5、取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心。L4a'Q4u"l:a*K%Z$?(e6、70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。3}r0[/Q'G9q7、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。0f.X%R(H%B7g!y7j5u$C'|)[%~!J3D:Q蛋白酶－热酚法6|"^0b*[)P3S*c4b4H4l本方法适合于病毒RNA的提取*I(i+b#r!K试验试剂：$?4[7H9`)J1、蛋白酶K（终浓度50ug/ml）,J5pl6V/t7[/I2、2×缓冲液：1%SDS?20mMTris-HCL(pH7.6)?0.2MnaCL9h,p]y+\$Z)O试验步骤：#W3v8G1[$]5y1、提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,37℃40-50分钟。-K0p/E'G0M#Q-z7n,{#d2、加入等体积65℃预热的酚溶液，轻徭,在65℃保温5分钟后再轻徭。w!`W(~,E:i3^3、离心，取上清，氯仿抽提一次。,|(Z0dj2@7m+d2Q&xH4、取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心(10000g,10min)。7[/w,h2d6U$k5、70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。%A5Y{(w%]3a*y,Oe)P6、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。植物RNA提取过程中难点的相应对策植物RNA提取过程中难点的相应对策)o5B7d/Q3_酚类化合物的干扰及对策：a9D*Z3K?7W许多植物组织特别是植物的果实（如苹果、樱桃、李子、葡萄等）和树木类植物中富含酚类化合物。酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。因而从幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，针叶类植物的针叶中多酚的含量比在落叶植物的叶子中要高得多。在植物材料匀浆时，酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应（browningeffect）。被氧化的酚类化合物（如醌类）能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化。但Newbury等发现RNA提取的难易程度与材料中酚类物质的总量之间并无相关性，因此认为不是所有的酚类化合物都影响RNA的提取。但一般认为所谓的“缩合鞣质”即聚合多羟基黄酮醇类物质（如原花色素类物质）是影响RNA提取的一类化合物。目前去除酚类化合物的一般途径是在提取的初始阶段防止其被氧化，然后再将其与RNA分开。9b0S!}0U6|9k/l!v"vg1~/@防止酚类化合物被氧化的方法："vy,a4k7n/Z1、还原剂法：一般在提取缓冲液中加入(-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸来防止酚类物质被氧化，有时提取液中(-巯基乙醇的浓度可高达2％。(-巯基乙醇等还可以打断多酚氧化酶的二硫键而使之失活。Su等认为在过夜沉淀RNA时加入(-巯基乙醇（终浓度1％）可以防止在此过程中酚类化合物的氧化。硼氢化钠（NaBH4）是一种可还原醌的还原剂，用它处理后提取缓冲液的褐色可被消减，醌类化合物可被还原成多酚化合物。&H.z.p+~&t%t5G&G1M-P/q!u2、螯合剂法：螯合剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO－N＝基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强。原花色素类物质中含有许多芳环上的羟基，因而可以与PVP或不溶性的PVPP形成稳定的复合物，使原花色素类物质不能成为多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步骤中被除去。用PVP去除多酚时pH值是一个重要的影响因素，在pH8.0以上时PVP结合多酚的能力会迅速降低〔11〕。当原花色素类物质量较大时，单独使用PVPP无法去除所有的这类化合物，因而需要与其它方法结合使用。p%N0w/t7r3、Tris-硼酸法：如果提取缓冲液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以与酚类化合物依*氢键形成复合物，从而抑制了酚类物质的氧化及其与RNA的结合。这一方法十分有效，所以Lбpez-Gбmez等在提取缓冲液中不再加入其它还原剂。但如果Tris-硼酸浓度过高（＞0.2M）则会影响RNA的回收率。#p8]0^8K3a4、牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原－抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与RNA结合的机会，因此提高了RNA的产量。BSA与PVPP结合使用提取效果会更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用时要加入肝素以抑制RNase的活性。)~#H/y(P7Q)j4G*w1G8l5、丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料，可以有效地从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA。@+?-X/V9z8T8H:B3C!W'C酚类化合物的去除：&z#h)G0H&]$I1N"f.l9N通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。与PVP、不溶性PVPP或BSA结合的多酚，可以直接通过离心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提时除去。Manning利用高浓度的2-丁氧乙醇（50％）来沉淀RNA，而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50％2-丁氧乙醇的缓冲液洗涤RNA沉淀以去除残留的多酚。他认为即使多酚被氧化，其氧化产物仍可以溶解在高浓度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，无需再用NaBH4来处理。5C6Y8a1SV:`2~多糖的干扰及对策：6I-b3R4~$T&O多糖的污染是提取植物RNA时常遇到的另一个棘手的问题。植物组织中往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与RNA很相似，因此很难将它们分开。在去除多糖的同时RNA也被裹携走了，造成RNA产量的减少；而在沉淀RNA时，也产生多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液。由于多糖可以抑制许多酶的活性，因此污染了多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。在常规的方法中，通过SDS-盐酸胍处理可以部分去除一些多糖；在高浓度Na+或K+离子存在条件下，通过苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通过LiCl沉淀RNA也可以将部分多糖留在上清液中。但即使通过这些步骤仍会发现有相当多的多糖与RNA混杂在一起，所以还需要用更有效的方法来解决植物RNA分离纯化时多糖污染的问题。7['X/e,d8x(B-p(|9C&n用低浓度乙醇沉淀多糖是一个去除多糖效果较好的方法。在RNA提取液或溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度10％～30％，可以使多糖沉淀下来，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的匀浆液中加入乙醇，如Lewinsohn等在从裸子植物的木质茎中提取RNA时，在匀浆上清液中加入乙醇至终浓度10％以沉淀多糖。但Tesniere等在从葡萄浆果组织中提取RNA时，是在用CsCl超离心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入终浓度30％乙醇来沉淀多糖的，进一步纯化了RNA样品。!i5b5m*z9G8M4~-N/D另一个常用的方法是醋酸钾沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉组织的RNA时在匀浆上清液中加入1/3体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液以沉淀多糖；Ainsworth在提取酸模植物花组织的RNA时加入的是1/5体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液。Hughes等在提取棉花叶和花粉的RNA时是加1/3体积的8.5M醋酸钾（pH6.5）溶液到匀浆液中以除去多糖等杂质。在提取某些植物材料的RNA时，是将上述两种方法结合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA时，是在匀浆液中加入0.25体积的无水乙醇和0.11体积的5M醋酸钾溶液以去除多糖杂质。Su等在去除褐藻的多糖时，单独使用乙醇或醋酸钾都无效，只有两者结合使用效果最佳。6c9|5q1b9[5l1s+nFang等认为缓冲液中含有高浓度的NaCl有助于去除多糖。Chang等在提取松树RNA时，缓冲液中NaCl的浓度为2.0M和1.0M，通过氯仿抽提和乙醇沉淀RNA将RNA与多糖分离。Manning是将胡萝卜种子等材料苯酚提取后的上清液稀释，调节Na+离子浓度至80mM，然后加入0.4体积的2-丁氧乙醇来沉淀去除多糖。3B1h#M'{+{0U%U,K2@,v蛋白杂质的影响及对策：$@-G5o(f1s9_2V*G2n/^蛋白质是污染RNA样品的又一个重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦属于蛋白质，因而要获得完整的、高质量的RNA就必须有效地去除蛋白杂质。常规的方法是在冷冻的条件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取缓冲液中含有蛋白质变性剂，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等，这样在匀浆时可以使蛋白质变性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K来降解蛋白杂质。进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质。'T7v(F1J9@+EWilcockson利用蛋白质与RNA在高氯酸钠溶液中的溶解度不同将它们分离。在70％高氯酸钠溶液中，RNA的溶解度大于蛋白质的溶解度，因而将大部分蛋白质沉淀下来。接着在离心上清液中加入两倍体积的无水乙醇，这时RNA能沉淀下来而能溶于70％高氯酸钠溶液中的残留蛋白质仍然留在上清液中。这样可以除去绝大部分的蛋白质。3qe/\*I"A&@次级代谢产物的影响及对策：:N3|)NfK#np'f6h0J2A0{从植物组织中提取高质量RNA的另一个难点是许多高等植物组织尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物，这些次级代谢产物很容易与RNA结合并与RNA共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的RNA的分离。因不能确定这些次级产物具体是什么物质，所以，目前还没有什么特殊的方法来解决这个问题。Baker等综合Hughes等的选择性沉淀法、Chirgwin的氯化铯梯度离心法和Iversen等的RNA回收方法纯化了松树种子、成熟松树针叶等植物组织的RNA。(Ms5O%f!H-Q*\(m"`(}由于植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性，使得植物组织RNA的提取相对于其它生物材料来说要困难的多。实践中经常会发现，即使同一种植物的不同组织其RNA提取方法会有很大的不同；含有某种干扰因素的不同植物材料，其适用的RNA提取方法可能不同；即使是同一种植物同一种组织材料，但来源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一样。所以，对于某一植物或其组织来说，其相应的RNA提取方法必需经过摸索和实践才能确立。#S0a#G7L3S&A随着植物分子生物学研究领域的拓宽，可以肯定地说，在作为其研究基础的植物材料RNA提取过程中还会出现新的难点，但随着不断地探索和经验的积累，科学工作者们一定会迅速地解决这些难点，为植物分子生物学的发展铺平道路。植物RNA提取中的一些特殊方法植物RNA提取中的一些特殊方法$e*[2U(E%h'[多酚类植物的RNA提取：!j!d,]2V(R!B&o苹果棉花等多酚类植物提取RNA用TRIZOL一般提不出来。这个方法是验证过有效的,提取的RNA纯度不是特别高,但是用作northern足够。6j&d2u(\6W8_&o4E1X1t实验试剂：#s7s8H!R#W1y#g提取buffer200ml：NaCl1.1688g100mMTris2.4228g10mM(tris-HCl8.0)EDTA5.8450g10mMSDS2.0000g1%NaOH调至8.0,定至200ml,加200ulDEPC融解.*j)st2@)t4W'F试验步骤：!Ta0I*C(w5S"E*A'W1、1.5ml离心管用液N2冷冻吼加入0.1g样品,立即加入500ul酚氯仿,再加入500ul提取buffer,剧烈振荡1-2min,冰上放置5min。"F3S0V5@0s7i1T2、4度12000rpm离心15min,上清转入新管,加氯仿异戊醇抽提一次。)H'L7d#d"y8@3、取600ul异丙醇,-20度沉淀20min.&w:m2r:I4\4l#J4、12000rpm离心10min。!I.Y.\8b7A5、沉淀用70度乙醇洗。k!T.D1[0w+?)_0D5?6、8000rpm5min。"Ay#}'F(`5}6I+N!x7、沉淀晾干,溶于30ulDEPC水。^0Q-R+`5j(n'['m9M#m/r3o2O!T6z$`1m&e.^银杏等木本裸子植物的RNA提取方法：&Ai&V!H0`?6R银杏、香机等木本裸子植物，酚类和多糖等次生物质含量较多，对RNA的分离和纯化有很大干扰，严重影响了提取RNA的质量和产量，给相关的分子生物学实验的进行带来阻碍。目前，RNA的提取方法很多，采取常规的Trizol试剂盒、SDS等方法不能提取银杏RNA，而ShujunChang等(1993)的CTAB法，提取RNA质量也较差，降解也十分严重。对其提取步骤进行改进，得到质量较高的银杏RNA样品。/s4i*Vk8S)x试验试剂：!]!M(q#E7N3t`#i.m([1、1Mtris:12.11gTris，溶于60mL水中，用浓盐酸调至Ph8.0，定容至lOOmL.用灭菌的DEPC水溶解。`4c9{)p2\4t2、500mMEDTA:18.61gEDTA"H2O加入80mL水中，搅拌溶解，用NaOH调pH至8.0，定容至100mL。V#x*j!H4y!G4M#q3c5P3、10mol/LLiCL:42.4gLiCL,100mL水溶解即可。9i)@a'\&w+cp*g4、提取缓冲液(DEPC水处理):2%CTAB（蛋白质变性剂）.2%PVPK30（去除多酚类物质）100mMTris-HCL(Ph8.0)25mMEDTA（金属鳌合剂）2.0MNaCL（去除多糖和CTAB）配法:2gCTAB,2gPVP,10mL1mol/Ltris,5mL500mMEDTA,11.7gNaCL,定容到100mL。)o+\5E!XO#A(M+P8H*K9n0q5、亚精胺(提取时加少量)（RNA酶抑制剂）#J9g6O/h(u'd6、4%0一疏基乙醇(提取时加)（去除多酚类物质）'De,d(J.K$z!O9f7、氯仿异戊醇(24:1)（抽提蛋白质）)U)A+]4\#Q8、10MLiCL（沉淀大分子RNA）7M+b)g4J4m5C0f-\9、SSTE（溶解RNA）1.0MNaCL0.5%SDS1mMEDTA(PH8.0)10mMTrisHCL(pH8）配法:2.9gNaCL,0.25gSDS,0.5mL1Mtris,100uL500mMEDTA,pH8.0,定容至50mL。.m5z+J3X0V&\6e7Y#R试验准备：_5z9}"f%q6t1、研钵和玻璃器皿用锡纸包好，200℃以上向温烘烤2小时以上，或180*C高温烘烤4小时。X7n3w,W2}9M2、塑料制品(枪头和离心管)最好用新的，并且用报纸包好，121'C高压灭菌，灭菌40min，或连续两次121'C高压灭菌，每次灭菌20min，然后用烘箱烘千。X*f+~,v7}.a3、所有溶液配制好后，加DEPC水使DEPCuJ浓度为0.1%,37℃过夜，1211C高压灭菌40min.(其中Tris因为不能用DEPC处理，所以Tris用DEPC处理的水溶液灭菌后配制。))x&B,{%e"^&F:s0q试验步骤："Y6U+`2C*\4X2a#r【根据文献(ShujunChang,1993)CTAB法，稍作改进。】F^+e9I#h/Q7m*A*]1、将4mL提取液加入到lOmL离心管c卜650C水域加热。$D+?4w7\3J:w,M2、用液氮冷却研钵，在研钵中加入少量的抗氧化剂PVP，取1g低温冷冻的银杏叶片，迅速置于研钵中，不时加入液氮以防止研磨过程中叶片融化，充分研磨后，立即加入到预热好的提取缓冲液中，用手摇功混匀。6C4i+L/Z*C5G)v3、65℃，水域1min后冷却至室温。(N2@)U:S,{9M"e8f4、加入等体积(4mL)的氯仿:异戊X17(2=L:1)，混匀，10000rpm,40C，离心10min。(H6Po1y8p#?5、小心吸取上清液，加入等体积(4mL)的仿:异戊醇(24:1),混匀，10000rpm,40C,离心10min。.{#k/z5r:x:v1x6、吸取上清液，加1/4体积的IOMLiCL,混合，4℃沉淀过夜，然后10000rpm离心20min。7xP4o6z1D![8}7、用枪吸干，用500uLSSTE溶解沉淀，转到1.5mL离心管.加等体积氯仿:异戊醇混匀，10000rpm,40C，离心10min。,H2b7C1d*[6r4c8、离心吸取取上清液，加两倍体积的无水乙醉，-70℃沉淀至少30min，或一200C下沉淀2h。"W*c'Y1P-t5K)^,`9、12000rpm,40C,离心20min，去上请用70%的乙醇洗两次，吹干沉淀。1x,S*X0V"y6F/l10、用40uLDEPC处理的水溶解沉淀，得到RNA样品。8f2C-S4R3O9R4Te&{11、除用于电泳和紫外检测外，其余RNA-70℃冰箱保存备用。Q0o7V.]9x,{1i:__!U*X1m5G9A(W%U改良Krapp提取法：1r)r#s3~|.q1v.w试验试剂：'C7Z1^)J5A&f&W(Kd1、RNA抽提掖：母液：4mol异硫氰酸胍20mmolEDTA20mmolMESpH7.0。工作液：取400ml母液加入1.7ml2-ME贮存在4℃条件下备用。/a.I$E.RS%z2、RNA重悬液：2molLiCl10mmolNaAc调整终体积为250ml，pH5.2，灭菌后贮存在4℃条件下备用。2uJ1S9V8a.j试验步骤：)O/o,L#q-D8v)U1、取新鲜植物材料0.5~1g，冷冻干燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨，然后加入10mlRNA抽提掖充分混匀。7nQ:B"SN9B!J$u2、4℃条件下8000rpm离心10min，将上层水相转移至一干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿抽提掖，在4℃条件下8000rpm离心10min。1N:K+]3R"a7`3、上清液转移至一干净离心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次（加入10ml氯仿充分混匀后，在4℃条件下8000rpm离心10min.）。$p+y,P/^-w/E'g"k0y:[4、小心将上清液转移至另一干净离心管中，加入1/10vol3molNaAc和2vol冷无水乙醇，在-80℃条件下沉淀2小时。:t&M8O1O!C-w5a5、在4℃条件下8500rpm离心30min.，小心弃去上清液，沉淀重悬于RNA重悬液中，置于4℃条件下1小时。9b7Z#K4v(y%l8Q0a8N)I%|6、4℃条件下8500rpm离心10min.，弃去上清液，沉淀溶于适当体积的DEOC处理水中。检测后分装，置于-70℃条件下保存。

核糖核酸（缩写为RNA，即Ribonucleic

Acid），存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A（腺嘌呤）、G（鸟嘌呤）、C（胞嘧啶）、U（尿嘧啶），其中，U（尿嘧啶）取代了DN的T（胸腺嘧啶）。核糖核酸在体内的作用主要是引导蛋白质的合成。

RNA提取（TRlzol提取法）

1．取样，研磨（组织）： 迅速取出组织样本，在电子天平中称重约0.3-0.5 g（也可根据实际经验估测取样量），放入液氮预冷的研钵中，边研磨边加液氮，整个过程都不要使组织融化。

2．裂解：

（1）组织：按每100

mg组织加入1 mL TRIzol，继续研磨至较细粉末，将组织裂解液转移到1.5 mL 离心管中，每管约1 mL，室温放置15min以上；也可直接将研磨的较细粉末用枪头刮入已取好的含有1 mL TRIzol的1.5 mL 离心管中，4℃放置10 min，或室温放置15min以上；

（2）细胞：（悬浮细胞需预处理：4℃，3000

rpm，离心10 min，收集细胞沉淀于1.5 mL 离心管底）；弃去培养液，加入适量1xPBS洗一次，弃去1xPBS，加入1 mL

TRIzol试剂（TRIzol加入量基于细胞数（1 mL/ 0.5-1x107个）或培养瓶的面积（1 mL/10 cm2），用移液器轻吹打几次，超净台中室温放置15 min以上，转移1 mL 液体到1.5 mL 离心管中。

（3）若不马上进行提取，可放入－80℃冰箱中冻存。

3．抽提： 按0.2 mL 氯仿/ 1 mL TRIzol的比例加入氯仿，vortex 30 sec或用手剧烈摇动15 sec，室温放置2-3 min后， 4℃，12000 rpm，离心15 min；小心转移上清到一新的1.5 mL 离心管中，不要吸取中间层。

4．沉淀： 按异丙醇/上清=1:1的比例加入异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃放置30 min后，4℃，12000 rpm 离心15 min。弃上清，异丙醇不要回流过多，可再短暂离心，用移液器将剩余的异丙醇吸出。

5．漂洗： 加入1 mL 75％乙醇，用手指将沉淀块弹起，上下颠倒几次，4℃，12000 rpm 离心5 min。弃上清，75％乙醇不要回流过多，可再短暂离心，用移液器将剩余的75％乙醇吸出。

6. 风干，溶解： 超净台中自然干燥 5-10 min，不要真空离心干燥， RNA不要完全干透，以防不能完全溶解；用DEPC水溶解RNA，60-65℃助溶 5-10 min。

7. 定量： 进行Total RNA定量，如果不马上定量，将样品贮存于-80℃。

RNA定量

我们一般通过Nanodrop紫外分光光度计测定RNA样本在260nm处的吸光值来计算RNA含量。但是，DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，其性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。所以紫外法不能区分DNA和RNA，只能用来鉴定核酸的纯度和含量。

Nanodrop紫外分光光度计可以得到以下参数：

OD230 ：杂质（酚、糖原等碳水化合物）的吸光度；

OD260 ：核酸的吸光度；

OD280 ：蛋白质的吸光度；

OD260 /280 ：纯的RNA比值在1.5 ~2.1之间，如果比值低，表示受到蛋白质的污染；

OD260 /230 ：纯的RNA比值在2.0 ~2.5之间，如果比值低，表示受到有机物如糖、肽、苯酚等的污染。

RNA完整性鉴定

我们一般使用电泳、Agilent2100等仪器来鉴定RNA的完整

RIN值

RIN（RNA integrity number）代表RNA完整性的数值，对total RNA的完整性进行数字化的评估，范围在1 ~10，数值越接近10表明样品完整性越高，反之完整性越差，如下图所示。

RNA降解程度对各个测序项目的影响

① 转录组测序： 降解程度会影响5’ 端的数据质量；

② micRNA测序： 由于本身的片段较小，受降解的影响较小；

③ 降解组测序： 若受到外源降解，回复给内源性降解，受影响较大；

④ lncRNA和circRNA测序： rRNA去除方式建库，样本降解影响小。

原核污染对各个测序项目的影响

① 转录组测序： 一般不影响数据，轻微污染时可无视，污染较严重时需增加建库起始量；

②micRNA测序： 对数据影响较小，一般是按污染比例对数据的比对率和有效数据量产生影响，轻微污染时可无视，污染比例较高时需加测数据量；

③ 降解组： 情况同转录组；

④ lncRNA和circRNA测序： 影响极大，建库方式决定了如果污染，若不给予处理，数据可能完全没法用，故对该问题需要高度警戒。

常见问题分析

得率低：

① 样品裂解或匀浆处理不彻底；

② RNA沉淀未完全溶解。

A260/A280<1.65（RIN<7）：

 ①检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高；

 ②样品匀浆时加的试剂量太少；

 ③ 匀浆样品时未在室温放置5分钟；

 ④ 吸取水相时混入了有机相；

 ⑤ RNA沉淀未完全溶解。

   RNA降解：

  ①组织取出后没有马上处理或冷冻；

  ②待提取RNA的样品保存在了-5至-20℃；

  ③细胞在用胰酶处理时过度；

  ④溶液或离心管未经RNase去除处理；

  ⑤电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5。

DNA污染：

①样品匀浆时加的试剂量太少；

②样品中含有有机溶剂(如乙醇，DMSO等)，强缓冲液或碱性溶液蛋白聚糖和多糖污染：沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中，每使用1mlTRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl)混合离心，按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。

关于百奥益康

北京百奥益康医药科技有限公司（以下简称“百奥益康”）是天津百奥医药科技有限公司的全资子公司，公司由资深的单细胞高通量测序技术科学家团队创立，致力于打造中国先进的肿瘤单细胞诊疗品牌，为科研和临床提供单细胞诊断仪器、诊断试剂、医学诊断技术分析等全套解决方案，高效赋能肿瘤个体化诊疗。

百奥益康是国内为数不多实现“研发+市场”自主大幅增长的落地团队。公司管理团队、技术团队和营销团队有丰富的单细胞领域服务和研发经验，曾成功领导打造了国内领先的单细胞科研服务团队，与10x Genomics、BD、MissionBio等国际领先的单细胞平台公司有深入合作，对单细胞检测相关技术、产品、应用有深厚积淀。依托配置合理、经验丰富的科学家团队，百奥益康实现了单细胞测序技术创新发展，能更加快捷、稳定地完成从样本处理、高通量单细胞分离、测序文库构建，到数据分析和临床意义挖掘等单细胞关键技术流程，提供涵盖单细胞诊断仪器、诊断试剂、医学诊断技术分析等在内的完整技术解决方案。 

主营业务

百奥益康科研服务以单细胞服务为主体，配以其他以高通量测序和芯片为基础的多组学服务，提供一站式的科研服务，从而实现从单细胞水平到bulk水平系统完整的解决方案。

1、测OD比值，260/280要是大于2.0应该是有RNA的污染

2、跑电泳，如果DNA条带的下面有明显的RNA带，那就是确定有RNA污染了

我们实验室一般用吉恩特-P01的盒子，基本上不存在RNA

苯酚法提取rna的缺点细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。

将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。

RNA提取时，就变性剂的选择来说，CTAB（CTAB法）比异硫氰酸胍（RIZOL试剂法）和　SDS（改良热硼酸法）更有效。

就CTAB法来说，由于以CTAB为变性剂，同时加入PVP和β一巯基乙醇共同作用变性蛋白、抑制RNase的活性，使用无水乙醇或异丙醇沉淀杂蛋白和总核酸等，然后再选择性地分离出RNA。

纯度分析：纯净的RNA样品其OD260/OD280的比值应介于1.2.0,小于此比值说明有蛋白或苯酚污染,如果比值大于2.0则可能被异硫氰酸胍污染；OD260/OD230比值应大于2.0,如果小于此比值说明有小分子及盐类污染.用RNA反转录和做RACE对RNA要求既要纯度高,且浓度约1微克左右.……………………

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详细资料请参考：

1)Promega有哪些系统用于提取总RNA及poly(A)+RNA？

2)RNAgents®总RNA提取系统的工作原理怎样？

3)RNAgents®总RNA提取系统的一般得率是多少？

4)RNAgents®总RNA提取系统的各组分的功能是什么？

5)RNAgents®总RNA提取系统中平衡的苯酚：氯仿：异戊醇的配比是多少？

6)对初始材料的用量有什么限制？

7)提取RNA用作RT-PCR的方法作了哪些修改？

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1)Promega有哪些系统用于提取总RNA及poly(A)+RNA？

Promega用于提取总RNA及poly(A)+RNA的系统包括：

：用RNAgents®总RNA提取系统从组织及培养的细胞中提取总RNA。

：用SV总RNA提取系统从组织，血液及培养的细胞中提取总RNA。

：用PolyATtract®mRNA提取系统从总RNA中提取poly(A)+RNA。

：用PolyTtract®ystem1000从组织及培养的细胞中提取poly(A)+RNA。

：用PolyTtract®Series

9600TMmRNA从少量样品中快速提取mRNA（cDNA第一条链的纯化）。

2)RNAgents®提取总RNA提取系统的工作原理怎样？

RNAgents®总RNA提取系统用溶剂法为基础，从多种材料中快速，有效地提取总RNA。

简单而言，有亚硫氢胍及巯基乙醇时，制组织匀浆，可使内源的RNA酶失活，n-月桂肌氨酸将核蛋白复合物变性。用酸平衡的苯酚：氯仿：异戊醇抽提后，RNA脱离DNA及蛋白，从混合液中层析到水相。抽提后，用异丙醇将RNA沉淀浓缩。用RNAgents®总RNA提取系统所得RNA纯度好，用途广，适用于PolyATtract®mRNA提取系统。如RNA中必须完全去除染色体DNA，需用1-2个单位的无RNA酶污染的DNA酶处理。然后用65oC加热10分钟，或用苯酚及氯仿抽提使DNA酶失活。

3)RNAgents®总RNA提取系统的一般得率是多少？

得率受多个因素的影响，包括组织来源及培养的细胞数。如提取的RNA量多，可通过光吸收测定（A260读数）来定量RNA，

1OD=40ugRNA。

RNAgents®总RNA提取系统的一般得率

组织

总RNA得率

Hela细胞

1.6mgRNA/10的8次方个细胞

鼠内脏

2.3mgRNA/g组织

鼠脾

8.3mgRNA/g组织

鼠肺

1.9mgRNA/g组织

鼠肾

3.1mgRNA/g组织

鼠肝

8.1mgRNA/g组织

4)RNAgents®总RNA提取系统的各组分的功能是什么？

(1)

变性剂:

柠檬酸钠溶液中含亚硫氢胍，巯基乙醇，n-月桂肌氨酸

。可变性细胞内及核蛋白复合物，释放RNA。这些试剂还可有效抑制核酸酶。

(2)

苯酚：氯仿：异戊醇（125：24：1）（pH4.7）:酸平衡苯仿可抽提去除杂物。DNA及蛋白沉淀到有机相，RNA留在水相。酸性有机溶剂的抽提可免除用氯化锂选择沉淀RNA。用锂沉淀导致小于5.8sRNA的丢失，并不利于下游操作。

(3)

乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，及沉淀RNA所需。

(4)

异丙醇：沉淀浓缩RNA。

5)RNAgents®总RNA提取系统中平衡的苯酚：氯仿：异戊醇的配比是多少？

苯酚：氯仿：异戊醇的配比是125：24：1，用42mM柠檬酸钠溶液平衡(pH4.3-4.7)。这一配比可有效去除染色体DNA。残留染色体DNA会干扰RT-PCR。

6)对初始材料的用量有什么限制？

最初的设计方案是用作提取比较大量的RNA，RNAgents®总RNA提取系统可从5mg

组织，或5倍10的5次方的细胞中提取RNA。少量RNA提取的步骤可见RNAgents®总RNA提取系统技术手册TB087。初始材料用量的上限是每次用1g组织。

7)提取RNA用作RT-PCR的方法作了哪些修改？

快速提取RNA用作RT-PCR，可省去在变性溶液中液化和沉淀的步骤。简化的步骤可在90分钟内完成。

http://www.promega.com.cn/files/changjian/rnagents.htm

希望对你的理解有帮助！

一、材料

水稻叶片或小鼠肝组织.

二、设备

研钵,冷冻台式高速离心机,低温冰箱,冷冻真空干燥器,紫外检测仪,电泳仪,电泳槽.

三、试剂

1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水,然后加入0.01%的DEPC（体积/体积）,处理过夜后高压灭菌.

2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇,（用高温灭菌器皿配制）,然后装入高温烘烤的玻璃瓶中,存放于低温冰箱.

3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/L Tris·Cl(pH7.6),0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTA(pH8.0),0.1% SDS.

4、洗脱缓冲液：10mmol/L Tris·Cl (pH7.6),1mmol/L EDTA (pH8.0),0.05% SDS.

四、操作步骤

（一）动植物总RNA提取-Trizol法

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克.用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染.RNA可直接用于Northern斑点分析,斑点杂交, Poly(A)+分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆.

1、将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%.

2、研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒.

3、取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟.

4、弃去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500g离心5分钟.

5、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度.然后将RNA溶于水中,必要时可55℃-60℃水溶 10分钟.RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃.

[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作.

2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年.

（二）mRNA提取

由于mRNA末端含有多poly(A)+,当总RNA流径oligo(dT)纤维素时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上,在低盐浓度或蒸馏水中,mRNA可被洗下,经过两次oligo(dT) 纤维素柱,可得到较纯的mRNA.

1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素.

2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床体积为0.5-1.0ml,用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床.

3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床,直到流出液的pH值小于8.0.

4、将（一）中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温,加入等体积2x柱层析缓冲液,上样,立即用灭菌试管收集洗出液,当所有RNA溶液进入柱床后,加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液.

5、测定每一管的OD260,当洗出液中OD为0时,加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液,以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液.

6、测定OD260,合并含有RNA的洗脱组分.

7、加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2), 2.5倍体积的冰冷乙醇, 混匀, -20℃30分钟.

8、4℃下12000g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗 涤沉淀,4℃下12000g离心5分钟.

9、小心弃去上清液,沉淀空气干燥10分钟,或真空干燥10分钟.

10、用少量水溶解RNA液,即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）.

[注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上.

2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净,然后用层析柱加样缓冲液平衡,并加入0.02%叠氮钠（NaN3）冰箱保存,重复使用.每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床.

兔肝RNA的制备：

实验目的

1.学习从兔肝中提取RNA的方法.

2.通过地衣酚显色法测定RNA的含量.

实验原理

细胞内大部份RNA均与蛋白质结合在一起,并且多以核蛋白的形式存在.因此,分离制备RNA时,首先遇到的是必须使RNA与蛋白解离,并除去蛋白质.由于RNA的种类来源和存在形式不同,所用的制备方法各异,一般常用的方法有,盐酸胍法,去污剂法和苯酚法.其中,以苯酚法使用较为广泛.产品纯度高,适合小规模生产.

动物组织中以肝脏器官RNA含量较为丰富.经组织匀浆用苯酚处理并离心后RNA溶于上层被酚饱和的水相中,DNA和蛋白质则留在酚层中,向水层中加入乙醇后,RNA即以白色絮状沉淀析出.此法能较好的除去DNA和蛋白质.上述方法提取的的RNA具有生物活性.工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA；其工艺简单,所提取的核酸均为变性RNA,只能用作制备核苷酸原料.本实验就是将兔肝组织,在酚与十二烷基硫酸钠的存在下,RNA与蛋白质分离使蛋白质变性凝固.RNA溶解在水相中,用乙醇使RNA从水相中沉淀,达到分离.

RNA含量的测定,除了可用紫外吸收法及定磷法外,常用地衣酚法测定,其反应原理是当RNA与浓盐酸共热时,即发生降解,形成的核糖继而转变成糠醛,后者与3, 5-二羟甲苯（地衣酚orcinol)反应,在Fe3+或Cu2+催化下,生成鲜绿色的复合物．反应产物在670nm处有最大吸收.RNA在20－250微克范围内,光吸收与RNA浓度 成正比.地衣酚反应特异性较差,凡是戊糖均有此反应.DNA和其他杂质也能给出类似的颜色.

实验试剂

0.05mol/L醋酸缓冲液（PH5.0）

0.05mol/L醋酸钠35毫升, 0.2mol/L醋酸15毫升,加蒸馏水至1000毫升,混合后测PH5.0

25%SDS:称取SDS25克,溶于50％乙醇中至100毫升,室温存放.

80％酚：取苯酚80份,加蒸馏水20份,混匀后装棕色瓶中.

2mol/L醋酸钠：取无水醋酸钠16.4克,用蒸馏水溶解后配成100毫升

95％乙醇

RNA标准溶液：取酵母标准RNA配成100μg/ml溶液.

样品待测液：准确稀释成每毫升溶液含RNA干燥制品50-100μg.

地衣酚试剂：先配制0.1%三氯化铁的浓盐酸溶液,实验前以此溶液为溶剂配成0.1%地衣酚溶液.

操作步骤

RNA提取：将新鲜兔肝浸入预冷0度0.05mol/L醋酸钠缓冲液(PH5.0)中,除去肝脏处的结缔组织,除去血凝,用滤纸吸干,称取0.9克.

取0.9克肝脏,加入 0.05mol/L醋酸缓冲液(PH5.0)9毫升,250克/升.SDS1.5毫升,移入匀浆管中,匀浆后再加入等体积80%酚,再匀浆一次.

移入三角瓶中,置65度水浴中继续振摇5-8分,取出流水冷却.

离心,3000转/分,10-15分,上层为稍混浊,含有RNA的水相,中层为变性蛋白,下层为酚液,管底残渣,含有RNA.吸出上层水溶液要RNA的收获量,可向中下层液中再加1/2体积的醋酸缓冲液,同样在65度水浴中振摇提取一次,离心后所收得的上层水液,可与上述水液合并,本次实验只提取一次.

用量筒测水液的量,加入1/10体积的2mol/L醋酸钠混匀.再加入2.5倍体积预冷的95%乙醇混匀,冷却放置絮状沉淀充分形成.

离心3000转/分,10分钟,倾出上清(不要废弃,可倒入收集瓶,作蒸馏回收乙醇用.

沉淀用蒸馏水4毫升溶解,慢慢向沉淀中加入蒸馏水,不断搅拌,至沉淀完全溶解即可,待作含量测定