CTAB法结合基因组提取试剂盒——提取高纯度基因组DNA

CTAB法原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性.在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.

CTAB提取缓冲液的经典配方

Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏；

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性；

NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,在于液相中； CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离；

β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除

PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合,有效去除多糖.

用酚抽提细胞DNA时,有什么作用?

使蛋白质变性,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶.蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相.

使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用.缺点：1.能溶解10-15%的水,从而溶解一部分poly(A)RNA.2.不能完全抑制RNase的活性.

氯仿的作用?

氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层.

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚.（酚易溶于氯仿中）

用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时,通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇,为什么?

异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡.异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡产生.另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定.

用乙醇沉淀DNA时,为什么加入单价的阳离子?

用乙醇沉淀DNA时,通常要在溶液中加入单价的阳离子,如NaCl 或 NaAc,Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,而易于聚集沉淀.

简言之,无论哪种抽提方法,药品的作用基本都是一样的.

Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏。

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性。

NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中。

Cβ-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA。CTAB 4g

NaCl 16.364 g。

1M Tris-HCl 20ml( PH8.0)。。

0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌。

冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇（400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

扩展资料：

适当的加一下热，比如50度或者60度，可以快速溶解，般这个温度对试剂的品质没有什么影响如果不是浓度太高的话。

如果浓度太高，可能冷却后又会沉淀析出来。

在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl) CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物而不沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

2×CTAB提取缓冲液成分：2%(w/v)CTAB，100mM Tris (pH 8.0)，20mM EDTA,1.4 MNaCl,，0.2%(v/v) 还原剂(随用随加) 。

参考资料来源：百度百科——十六烷基三甲基溴化铵

一）CTAB法

CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7

mol/L

NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3

mol/L

NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。

（二）SDS法

利用高浓度的SDS，在较高温度（55—65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀（最常用的是加入5M的KAc于冰上保温，在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。

以下是在提取热带水果DNA时设计的两种不同方法步骤，对比起来CTAB法好，在禾本科植物效果差不多！

1、

CTAB法

1）

在所需量的CTAB抽提液中加入2－巯基乙醇，使终浓度达2％（v/v）。将此溶液预热至65℃。

对于每克新鲜的叶组织大约需要4ml的2－ME/CTAB抽提液。

2）

用液氮（－196℃）或干冰（－78℃）冷却粉碎器/匀浆器，将0.5

g植物组织粉碎成细粉，然后将组织转移到2.0

ml离心管。

3）

加入800

µl预热的2－Me/CTAB，混合使之充分湿润，于65℃温育20

min，不时颠倒混匀。

4）

待冷至室温后，加入800

µl氯仿/异戊醇（24：1），颠倒混匀至溶液呈乳浊状----但不要振荡。25℃，10000

rpm离心10

min。

5）

上清（~700

µl）转移至另一干净的离心管中，加入5

µl

RNaseA贮液，37℃温育30

min。

6）

加入700

µl氯仿/异戊醇，颠倒混匀，25℃，10000

rpm离心10

min。

7）

上清（~600

µl）转移至另一干净的1.5

ml离心管中，加入600

µl异丙醇，颠倒混匀，室温或-20℃放置20

min。

8）

25℃，12000

rpm，离心10

min，收集沉淀。

9）

去上清，加1

ml70%乙醇洗涤沉淀两次。（25℃，12000

rpm，离心10

min）

10）凉干DNA，溶于50

µl

ddH2O，4℃保存备用。

2、

SDS法

①

将0.3

g植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，将粉末转至2

ml离心管中。

②

加入1.2

ml预热至65℃的提取缓冲液（其中加入3

μl

β—巯基乙醇，增加DNA的稳定性），置65℃水浴中放置30分钟，不时颠倒混匀。。

③

加入0.45

ml

5M的醋酸钾，混匀，冰浴20分钟，在10000

rpm离心20

min。需要的话，Miracloth纱布过滤除去沉淀，上清液转入另一离心管中。

④

加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000

rpm离心15

min。

⑤

转移上清液到另一新离心管中，加5

μl

RNaseA贮液，37℃温育30

min。

⑥

加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000

rpm离心15

min。

⑦

转移上清液到另一新离心管中，加入0.7V异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30分钟沉淀核酸。

⑧

25℃，12000

rpm，离心10

min，收集沉淀。

⑨

弃上清，70％乙醇洗两次。

⑩

凉干DNA，溶于50

µl

ddH2O，4℃保存备用。