苯酚法提取rna的缺点

实验原理

由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。

稀碱法使用稀碱（本实验用0.2%NaOH溶液）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。

酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。

RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。

试剂和器材

一、试剂

0.04MNaOH溶液；95%乙醇；无水乙醇；乙醚；1.5M硫酸；浓氨水；0.1M硝酸银

酸性乙醇溶液，30ml乙醇加0.3ml HCl

三氯化铁浓盐溶液，将2ml 10％三氯化铁（FeCl3· 6H2O）溶液加入400ml浓HCl

苔黑酚乙醇溶液，称取6g 苔黑酚溶于95％乙醇100ml

定磷试剂：

17％硫酸：将17ml浓硫酸（比重1084）缓缓倾入83ml水中；

2.5％钼酸铵：2.5g 钼酸铵溶于100ml水中；

10％抗坏血酸溶液：10g 抗坏血酸溶于100ml 水，棕色并保存溶液；

临用时将三种溶液和水按下列比例混合：

17％硫酸：2.5％钼酸铵：10％抗坏血酸：水＝1：1：1：2（V/V）

二、材料

干酵母粉。

三、器材

乳钵；容量瓶（10ml），移液管（2.0ml, 5.0ml），量筒（10, 50ml），沸水浴，离心机，布氏漏斗，抽滤瓶，石蕊试纸，滴管等。

操作方法

一、酵母RNA提取

称5g干酵母粉置于100ml烧杯中，加入40ml0.2%NaOH溶液，沸水浴上加热30min，经常搅拌。然后加入数滴乙酸溶液使提取液呈酸性（石蕊试纸检查），3000r/min离心15min。取上清液，加入10ml酸性乙醇，边加边搅动。加毕，静置，待RNA沉淀完全后，离心。滤渣先用乙醇洗两次，每次用10ml。再用无水乙醇洗两次，每次10ml，洗涤时间可用细玻璃棒小心搅动沉淀。最后用布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量，计算：

二、RNA组份鉴定

取2g 提取的核酸，加入1.5M硫酸10ml, 沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。

1．嘌呤碱：取水解液1ml 加入过量浓氨水。然后加入1ml 0.1M硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱地银化合物沉淀。

2．核糖：取水解液1ml， 三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。

3．磷酸：取水解液1ml，加定磷试剂1ml。在水浴中加热观察溶液是否变成蓝色。

一、材料

水稻叶片或小鼠肝组织.

二、设备

研钵,冷冻台式高速离心机,低温冰箱,冷冻真空干燥器,紫外检测仪,电泳仪,电泳槽.

三、试剂

1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水,然后加入0.01%的DEPC（体积/体积）,处理过夜后高压灭菌.

2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇,（用高温灭菌器皿配制）,然后装入高温烘烤的玻璃瓶中,存放于低温冰箱.

3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/L Tris·Cl(pH7.6),0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTA(pH8.0),0.1% SDS.

4、洗脱缓冲液：10mmol/L Tris·Cl (pH7.6),1mmol/L EDTA (pH8.0),0.05% SDS.

四、操作步骤

（一）动植物总RNA提取-Trizol法

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克.用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染.RNA可直接用于Northern斑点分析,斑点杂交, Poly(A)+分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆.

1、将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%.

2、研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒.

3、取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟.

4、弃去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500g离心5分钟.

5、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度.然后将RNA溶于水中,必要时可55℃-60℃水溶 10分钟.RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃.

[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作.

2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年.

（二）mRNA提取

由于mRNA末端含有多poly(A)+,当总RNA流径oligo(dT)纤维素时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上,在低盐浓度或蒸馏水中,mRNA可被洗下,经过两次oligo(dT) 纤维素柱,可得到较纯的mRNA.

1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素.

2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床体积为0.5-1.0ml,用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床.

3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床,直到流出液的pH值小于8.0.

4、将（一）中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温,加入等体积2x柱层析缓冲液,上样,立即用灭菌试管收集洗出液,当所有RNA溶液进入柱床后,加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液.

5、测定每一管的OD260,当洗出液中OD为0时,加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液,以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液.

6、测定OD260,合并含有RNA的洗脱组分.

7、加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2), 2.5倍体积的冰冷乙醇, 混匀, -20℃30分钟.

8、4℃下12000g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗 涤沉淀,4℃下12000g离心5分钟.

9、小心弃去上清液,沉淀空气干燥10分钟,或真空干燥10分钟.

10、用少量水溶解RNA液,即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）.

[注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上.

2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净,然后用层析柱加样缓冲液平衡,并加入0.02%叠氮钠（NaN3）冰箱保存,重复使用.每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床.

兔肝RNA的制备：

实验目的

1.学习从兔肝中提取RNA的方法.

2.通过地衣酚显色法测定RNA的含量.

实验原理

细胞内大部份RNA均与蛋白质结合在一起,并且多以核蛋白的形式存在.因此,分离制备RNA时,首先遇到的是必须使RNA与蛋白解离,并除去蛋白质.由于RNA的种类来源和存在形式不同,所用的制备方法各异,一般常用的方法有,盐酸胍法,去污剂法和苯酚法.其中,以苯酚法使用较为广泛.产品纯度高,适合小规模生产.

动物组织中以肝脏器官RNA含量较为丰富.经组织匀浆用苯酚处理并离心后RNA溶于上层被酚饱和的水相中,DNA和蛋白质则留在酚层中,向水层中加入乙醇后,RNA即以白色絮状沉淀析出.此法能较好的除去DNA和蛋白质.上述方法提取的的RNA具有生物活性.工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA；其工艺简单,所提取的核酸均为变性RNA,只能用作制备核苷酸原料.本实验就是将兔肝组织,在酚与十二烷基硫酸钠的存在下,RNA与蛋白质分离使蛋白质变性凝固.RNA溶解在水相中,用乙醇使RNA从水相中沉淀,达到分离.

RNA含量的测定,除了可用紫外吸收法及定磷法外,常用地衣酚法测定,其反应原理是当RNA与浓盐酸共热时,即发生降解,形成的核糖继而转变成糠醛,后者与3, 5-二羟甲苯（地衣酚orcinol)反应,在Fe3+或Cu2+催化下,生成鲜绿色的复合物．反应产物在670nm处有最大吸收.RNA在20－250微克范围内,光吸收与RNA浓度 成正比.地衣酚反应特异性较差,凡是戊糖均有此反应.DNA和其他杂质也能给出类似的颜色.

实验试剂

0.05mol/L醋酸缓冲液（PH5.0）

0.05mol/L醋酸钠35毫升, 0.2mol/L醋酸15毫升,加蒸馏水至1000毫升,混合后测PH5.0

25%SDS:称取SDS25克,溶于50％乙醇中至100毫升,室温存放.

80％酚：取苯酚80份,加蒸馏水20份,混匀后装棕色瓶中.

2mol/L醋酸钠：取无水醋酸钠16.4克,用蒸馏水溶解后配成100毫升

95％乙醇

RNA标准溶液：取酵母标准RNA配成100μg/ml溶液.

样品待测液：准确稀释成每毫升溶液含RNA干燥制品50-100μg.

地衣酚试剂：先配制0.1%三氯化铁的浓盐酸溶液,实验前以此溶液为溶剂配成0.1%地衣酚溶液.

操作步骤

RNA提取：将新鲜兔肝浸入预冷0度0.05mol/L醋酸钠缓冲液(PH5.0)中,除去肝脏处的结缔组织,除去血凝,用滤纸吸干,称取0.9克.

取0.9克肝脏,加入 0.05mol/L醋酸缓冲液(PH5.0)9毫升,250克/升.SDS1.5毫升,移入匀浆管中,匀浆后再加入等体积80%酚,再匀浆一次.

移入三角瓶中,置65度水浴中继续振摇5-8分,取出流水冷却.

离心,3000转/分,10-15分,上层为稍混浊,含有RNA的水相,中层为变性蛋白,下层为酚液,管底残渣,含有RNA.吸出上层水溶液要RNA的收获量,可向中下层液中再加1/2体积的醋酸缓冲液,同样在65度水浴中振摇提取一次,离心后所收得的上层水液,可与上述水液合并,本次实验只提取一次.

用量筒测水液的量,加入1/10体积的2mol/L醋酸钠混匀.再加入2.5倍体积预冷的95%乙醇混匀,冷却放置絮状沉淀充分形成.

离心3000转/分,10分钟,倾出上清(不要废弃,可倒入收集瓶,作蒸馏回收乙醇用.

沉淀用蒸馏水4毫升溶解,慢慢向沉淀中加入蒸馏水,不断搅拌,至沉淀完全溶解即可,待作含量测定

RNA提取时，就变性剂的选择来说，CTAB（CTAB法）比异硫氰酸胍（RIZOL试剂法）和　SDS（改良热硼酸法）更有效；就CTAB法来说，由于以CTAB为变性剂，同时加入PVP和β一巯基乙醇共同作用变性蛋白、抑制RNase的活性，使用无水乙醇或异丙醇沉淀杂蛋白和总核酸等，然后再选择性地分离出RNA。所以CTAB法是一种很好得总RNA得提取方法。

1、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯萃取，高速离心后取上清，所得DNA大小为100-150kb

2、甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。

3、玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。

4、异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）

5、表面活性剂快速制备法：用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。

6、加热法快速制备：加热96℃-100℃，五分钟，然后离心后取上清，可用于PCR反应。

7、碱变性快速制备：先用NaOH作用20分钟，再加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。

扩展资料：

DNA提取原则：

1、保证核酸一级结构的完整性；

2、核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

3、其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；

4、其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。

参考资料来源：百度百科——DNA提取

酵母rna的提取及组分鉴定实验报告如下。

目的和要求，了解核酸的组成及其提取原理及方法。掌握鉴定核酸组分的方法。

基本原理，由十RNA的来源很多，因提取制备方法也很各异。一般有苯酚法，去污剂法和盐酸瓜法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶十十层被酚饱和的水相中。DNA和蛋白质训留在酚层中。il水层加入乙醇后，RNA即以自色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。

工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。

酵母的作用

美国、日本及欧洲一些国家在普通的粮食制品如面包、蛋糕、饼干和烤饼中掺入5%左右的食用酵母粉以提高食品的营养价值。酵母自溶物可作为肉类、果酱、汤类、乳酪、面包类食品、蔬菜及调味料的添加剂。

在婴儿食品、健康食品中作为食品营养强化剂。由酵母自溶浸出物制得的5′－核苷酸与味精配合可作为强化食品风味的添加剂。从酵母中提取的浓缩转化酶用作方蛋夹心巧克力的液化剂。

从以乳清为原料生产的酵母中提取的乳糖酶，可用于牛奶加工以增加甜度，防止乳清浓缩液中乳糖的结晶，适应不耐乳糖症的消费者的需要。