苯酚法提取rna的缺点

RNA抽取一般使用Trizol法抽提:

Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。

Trizol作用原理:

在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。

水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。

与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。

RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。

在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA（转运RNA），rRNA（核糖体RNA），mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。

参考资料来源：百度百科-RNA

1、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯萃取，高速离心后取上清，所得DNA大小为100-150kb

2、甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。

3、玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。

4、异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）

5、表面活性剂快速制备法：用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。

6、加热法快速制备：加热96℃-100℃，五分钟，然后离心后取上清，可用于PCR反应。

7、碱变性快速制备：先用NaOH作用20分钟，再加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。

扩展资料：

DNA提取原则：

1、保证核酸一级结构的完整性；

2、核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

3、其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；

4、其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。

参考资料来源：百度百科——DNA提取

一、材料

水稻叶片或小鼠肝组织.

二、设备

研钵,冷冻台式高速离心机,低温冰箱,冷冻真空干燥器,紫外检测仪,电泳仪,电泳槽.

三、试剂

1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水,然后加入0.01%的DEPC（体积/体积）,处理过夜后高压灭菌.

2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇,（用高温灭菌器皿配制）,然后装入高温烘烤的玻璃瓶中,存放于低温冰箱.

3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/L Tris·Cl(pH7.6),0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTA(pH8.0),0.1% SDS.

4、洗脱缓冲液：10mmol/L Tris·Cl (pH7.6),1mmol/L EDTA (pH8.0),0.05% SDS.

四、操作步骤

（一）动植物总RNA提取-Trizol法

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克.用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染.RNA可直接用于Northern斑点分析,斑点杂交, Poly(A)+分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆.

1、将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%.

2、研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒.

3、取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟.

4、弃去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500g离心5分钟.

5、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度.然后将RNA溶于水中,必要时可55℃-60℃水溶 10分钟.RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃.

[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作.

2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年.

（二）mRNA提取

由于mRNA末端含有多poly(A)+,当总RNA流径oligo(dT)纤维素时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上,在低盐浓度或蒸馏水中,mRNA可被洗下,经过两次oligo(dT) 纤维素柱,可得到较纯的mRNA.

1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素.

2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床体积为0.5-1.0ml,用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床.

3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床,直到流出液的pH值小于8.0.

4、将（一）中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温,加入等体积2x柱层析缓冲液,上样,立即用灭菌试管收集洗出液,当所有RNA溶液进入柱床后,加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液.

5、测定每一管的OD260,当洗出液中OD为0时,加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液,以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液.

6、测定OD260,合并含有RNA的洗脱组分.

7、加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2), 2.5倍体积的冰冷乙醇, 混匀, -20℃30分钟.

8、4℃下12000g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗 涤沉淀,4℃下12000g离心5分钟.

9、小心弃去上清液,沉淀空气干燥10分钟,或真空干燥10分钟.

10、用少量水溶解RNA液,即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）.

[注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上.

2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净,然后用层析柱加样缓冲液平衡,并加入0.02%叠氮钠（NaN3）冰箱保存,重复使用.每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床.

兔肝RNA的制备：

实验目的

1.学习从兔肝中提取RNA的方法.

2.通过地衣酚显色法测定RNA的含量.

实验原理

细胞内大部份RNA均与蛋白质结合在一起,并且多以核蛋白的形式存在.因此,分离制备RNA时,首先遇到的是必须使RNA与蛋白解离,并除去蛋白质.由于RNA的种类来源和存在形式不同,所用的制备方法各异,一般常用的方法有,盐酸胍法,去污剂法和苯酚法.其中,以苯酚法使用较为广泛.产品纯度高,适合小规模生产.

动物组织中以肝脏器官RNA含量较为丰富.经组织匀浆用苯酚处理并离心后RNA溶于上层被酚饱和的水相中,DNA和蛋白质则留在酚层中,向水层中加入乙醇后,RNA即以白色絮状沉淀析出.此法能较好的除去DNA和蛋白质.上述方法提取的的RNA具有生物活性.工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA；其工艺简单,所提取的核酸均为变性RNA,只能用作制备核苷酸原料.本实验就是将兔肝组织,在酚与十二烷基硫酸钠的存在下,RNA与蛋白质分离使蛋白质变性凝固.RNA溶解在水相中,用乙醇使RNA从水相中沉淀,达到分离.

RNA含量的测定,除了可用紫外吸收法及定磷法外,常用地衣酚法测定,其反应原理是当RNA与浓盐酸共热时,即发生降解,形成的核糖继而转变成糠醛,后者与3, 5-二羟甲苯（地衣酚orcinol)反应,在Fe3+或Cu2+催化下,生成鲜绿色的复合物．反应产物在670nm处有最大吸收.RNA在20－250微克范围内,光吸收与RNA浓度 成正比.地衣酚反应特异性较差,凡是戊糖均有此反应.DNA和其他杂质也能给出类似的颜色.

实验试剂

0.05mol/L醋酸缓冲液（PH5.0）

0.05mol/L醋酸钠35毫升, 0.2mol/L醋酸15毫升,加蒸馏水至1000毫升,混合后测PH5.0

25%SDS:称取SDS25克,溶于50％乙醇中至100毫升,室温存放.

80％酚：取苯酚80份,加蒸馏水20份,混匀后装棕色瓶中.

2mol/L醋酸钠：取无水醋酸钠16.4克,用蒸馏水溶解后配成100毫升

95％乙醇

RNA标准溶液：取酵母标准RNA配成100μg/ml溶液.

样品待测液：准确稀释成每毫升溶液含RNA干燥制品50-100μg.

地衣酚试剂：先配制0.1%三氯化铁的浓盐酸溶液,实验前以此溶液为溶剂配成0.1%地衣酚溶液.

操作步骤

RNA提取：将新鲜兔肝浸入预冷0度0.05mol/L醋酸钠缓冲液(PH5.0)中,除去肝脏处的结缔组织,除去血凝,用滤纸吸干,称取0.9克.

取0.9克肝脏,加入 0.05mol/L醋酸缓冲液(PH5.0)9毫升,250克/升.SDS1.5毫升,移入匀浆管中,匀浆后再加入等体积80%酚,再匀浆一次.

移入三角瓶中,置65度水浴中继续振摇5-8分,取出流水冷却.

离心,3000转/分,10-15分,上层为稍混浊,含有RNA的水相,中层为变性蛋白,下层为酚液,管底残渣,含有RNA.吸出上层水溶液要RNA的收获量,可向中下层液中再加1/2体积的醋酸缓冲液,同样在65度水浴中振摇提取一次,离心后所收得的上层水液,可与上述水液合并,本次实验只提取一次.

用量筒测水液的量,加入1/10体积的2mol/L醋酸钠混匀.再加入2.5倍体积预冷的95%乙醇混匀,冷却放置絮状沉淀充分形成.

离心3000转/分,10分钟,倾出上清(不要废弃,可倒入收集瓶,作蒸馏回收乙醇用.

沉淀用蒸馏水4毫升溶解,慢慢向沉淀中加入蒸馏水,不断搅拌,至沉淀完全溶解即可,待作含量测定