影响薄层色谱rf值的因素有哪些

rf值不能光看展开剂极性，还和固定相关系很大，比如你用的是硅胶板还是氧化铝板，是硅胶G还是硅胶H，硅胶颗粒大小，硅胶层的厚薄，硅胶的含水量等，都会很大的影响rf值，最好通过实验微调展开剂极性以适应你所用的薄层板，不可一概而论

单一溶剂的极性大小顺序为：

石油醚（小）→环己烷→四氯化碳→三氯乙烯→苯→甲苯→二氯甲烷→氯仿→乙醚→乙酸乙酯→乙酸甲酯→丙酮→正丙醇→甲醇→吡啶→乙酸（大）

混合溶剂的极性顺序：

苯∶氯仿（1+1）→ 环己烷∶乙酸乙酯（8+2）→氯仿∶丙酮（95+5）→苯∶丙酮（9+1）→苯∶乙酸乙酯（8+2）→氯仿∶乙醚（9+1）→苯∶甲醇（95+5） →苯∶乙醚（6+4）→环己烷∶乙酸乙酯（1+1）→氯仿∶乙醚（8+2）→氯仿∶甲醇（99+1）→苯∶甲醇（9+1）→氯仿∶丙酮（85+15）→苯∶乙醚（4+6）→苯∶乙酸乙酯（1+1）→氯仿∶甲醇（95+5）→氯仿∶丙酮（7+3）→苯∶乙酸乙酯（3+7）→苯∶乙醚（1+9）→乙醚∶甲醇（99+1）→乙酸乙酯∶甲醇（99+1）→苯∶丙酮（1+1）→氯仿∶甲醇（9+1）

8.3. 薄层色谱（TLC）的使用指南

综述：薄层色谱（TLC）是一种非常有用的跟踪反应的手段，还可以用于柱色谱分离中合适溶剂的选择。薄层色谱常用的固定相有氧化铝或硅胶，它们是极性很大（标准）或者是非极性的（反相）。流动相则是一种极性待选的溶剂。在5.301中以及大多数实验室实验中，都将使用标准硅胶板。将溶液中的反应混合物点在薄板上，然后利用毛细作用使溶剂（或混合溶剂）沿板向上移动进行展开。根据混合物中组分的极性，不同化合物将会在薄板上移动不同的距离。极性强的化合物会“粘”在极性的硅胶上，在薄板上移动的距离比较短。而非极性的物质将会在流动的溶剂相中保留较长的时间从而在板上移动较大的距离。化合物移动的距离大小用Rf值来表达。这是一个位于0～1之间的数值，它的定义为：化合物距离基线（最先点样时已经确定）的距离除以溶剂的前锋距离基线的距离。

薄层色谱（TLC）实验步骤：

1) 切割薄板。通常，买来的硅胶板都是方形的玻璃板，必需用钻石头玻璃刀按照模板的形状进行切割。在切割玻璃之前，用尺子和铅笔在薄板的硅胶面上轻轻地标出基线的位置（注意不要损坏硅胶面）。借助锋利的玻璃切割刀和一把引导尺，你便可方便地进行玻璃切割。当整块玻璃被切割后，你就可以进一步将其分成若干独立的小块了。（开始的时候，也许你会感到有一些难度，但经过一些训练以后，你便会熟练地掌握该项技术。

2) 选取合适的溶剂体系。化合物在薄板上移动距离的多少取决于所选取的溶剂不同。在戊烷和己烷等非极性溶剂中，大多数极性物质不会移动，但是非极性化合物会在薄板上移动一定距离。相反，极性溶剂通常会将非极性的化合物推到溶剂的前段而将极性化合物推离基线。一个好的溶剂体系应该使混合物中所有的化合物都离开基线，但并不使所有化合物都到达溶剂前端， Rf值最好在0.15~0.85之间。虽然这个条件不一定都能满足，但这应该作为薄层色谱分析的目标（在柱色谱中，合适的溶剂应该满足Rf在0.2~0.3之间）。那么，应该选取哪些溶剂呢？一些标准溶剂和他们的相对极性（从LLP中摘录）列于如下：

强极性溶剂：

甲醇〉乙醇〉异丙醇

中等极性溶剂：

乙氰〉乙酸乙酯〉氯仿〉二氯甲烷〉**〉甲苯

非极性溶剂：

环己烷，石油醚，己烷，戊烷

常用混合溶剂：

乙酸乙酯/己烷：常用浓度0~30%。但有时较难在旋转蒸发仪上完全除去溶剂。

**/戊烷体系：浓度为0~40%的比较常用。在旋转蒸发器上非常容易除去。

乙醇/己烷或戊烷：对强极性化合物5~30%比较合适。

二氯甲烷/己烷或戊烷：5~30%，当其他混合溶剂失败时可以考虑使用。

3) 将1~2mL选定的溶剂体系倒入展开池中，在展开池中放置一大块滤纸。

4) 将化合物在标记过的基线处进行点样。我们用的点样器是买来的，此外，点样器也可从加热过的Pasteur吸管上拔下（你可以参照UROP）。在跟踪反应进行时，一定要点上起始反应物、反应混合物以及两者的混合物。

5) 展开：让溶剂向上展开约90%的薄板长度。

6) 从展开池中取出薄板并且马上用铅笔标注出溶剂到达的前沿位置。根据这个算Rf的数值。

7) 让薄板上的溶剂挥发掉。

8) 用非破坏性技术观察薄板。最好的非破坏性方法就是用紫外灯进行观察。将薄板放在紫外灯下，用铅笔标出所有有紫外活性的点。尽管在5.301中不用这种方法，但我们将采用另一常用的无损方法--用碘染色法。（你可以参看UROP）。

9) 用破坏性方式观测薄板。当化合物没有紫外活性的时候，只能采用这种方法。在5.301中，提供了很多非常有用的染色剂。使用染色剂时，将干燥的薄板用镊子夹起并放入染色剂中，确保从基线到溶剂前沿都被浸没。用纸巾擦干薄板的背面。将薄板放在加热板上观察斑点的变化。在斑点变得可见而且背景颜色未能遮盖住斑点之前，将薄板从加热板上取下。

10) 根据初始薄层色谱结果修改溶剂体系的选择。如果想让Rf变得更大一些，可使溶剂体系极性更强些；如果想让Rf变小，就应该使溶剂体系的极性减小些。如果在薄板上点样变成了条纹状而不是一个圆圈状，那么你的样品浓度可能太高了。稀释样品后再进行一次薄板层析，如果还是不能奏效，就应该考虑换一种溶剂体系。

11) 做好TLC标记，计算每个斑点的Rf值，并且在笔记本中画出图样。

TLC显色试剂的选择

显色试剂

显色剂可以分成两大类：一类是检查一般有机化合物的通用显色剂；另一类是根据化合物分类或特殊官能团设计的专属性显色剂。显色剂种类繁多，本章只能列举一些常用的显色剂。 l．通用显色剂

硫酸常用的有四种溶液：硫酸-水(1：1)溶液；硫酸-甲醇或乙醇(1：1)溶液；1.5mol／L硫酸溶液与0.5-1.5mol／L硫酸铵溶液，喷后110oC烤15min，不同有机化合物显不同颜色。

0.5％碘的氯仿溶液 对很多化合物显黄棕色。

中性0.05％高锰酸钾溶液 易还原性化合物在淡红背景上显黄色。

碱性高锰酸钾试剂 还原性化合物在淡红色背景上显黄色。 溶液I：1％高锰酸钾溶液；溶液Ⅱ：5％碳酸钠溶液；溶液I和溶液Ⅱ等量混合应用。

酸性高锰酸钾试剂 喷1.6％高锰酸钾浓硫酸溶液(溶解时注意防止爆炸)，喷后薄层于180oC加热15～20min。

酸性重铬酸钾试剂 喷5％重铬酸钾浓硫酸溶液，必要时150oC烤薄层。

5％磷钼酸乙醇溶液 喷后120oC烘烤，还原性化合物显蓝色，再用氨气薰，则背景变为无色。

⑧铁氰化钾-三氯化铁试剂 还原性物质显蓝色，再喷2mol／L盐酸溶液，则蓝色加深。 溶液I：1％铁氰化钾溶液；溶液Ⅱ：2％三氯化铁溶液；临用前将溶液I和溶液Ⅱ等量混合。

2．专属性显色剂 由于化合物种类繁多，因此专属性显色剂也是很多的，现将在各类化合物中最常用的显色剂列举如下：

(1) 烃类

①硝酸银／过氧化氢 检出物：卤代烃类。 溶液：硝酸银O.1g溶于水lml，加2-苯氧基乙醇lOOml，用丙酮稀释至200ml，再加30％过氧化氢1滴。 方法：喷后置未过滤的紫外光下照射； 结果：斑点呈暗黑色。

②荧光素／溴 检出物：不饱和烃。 溶液：I．荧光素0.1g溶于乙醇lOOml；Ⅱ．5％溴的四氯化碳溶液。 方法：先喷(I)，然后置含溴蒸气容器内，荧光素转变为四溴荧光素(曙红)，荧光消失，不饱和烃斑点由于溴的加成，阻止生成曙红而保留荧光，多数不饱和烃在粉红色背景上呈黄色。

③四氯邻苯二甲酸酐 检出物：芳香烃。 溶液：2％四氯邻苯二甲酸酐的丙酮与氯代苯(10：1)的溶液。 方法：喷后置紫外光下观察

摘要：

以硅胶G板为固定相、甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水(体积比为10∶5∶4.5∶0.2)为流动相,

研究建立了蔗糖酯薄层色谱分析方法。在蔗糖酯上行展开后,用脲-磷酸-水饱和正丁醇溶

液显色,斑点呈蓝色,蔗糖单酯的Rf值为0.16,多酯的Rf值为0.38～0.93。在

70 ℃显色20 min的最佳条件下,蔗糖单酯的检测量为25 μg～250 μg时,其斑点面积与其检

测量有良好的线性关系。用归一法和外标法对该分析方法的准确度进行考察和认证,两种方

法对已知单酯含量的S-1570样品测定结果的t-检验结果分别为|t|=0.627(＜2

.571)和|t|=1.123(＜2.571),相对标准偏差(RSD)(n=6)分别为3.03%和3

.08%,最低检出限为0.1 μg。用该方法对不同蔗糖酯样品中的单酯含量进行了测定,为研

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铼的分离与富集常采取蒸馏、共沉淀、离子交换与吸附、溶剂萃取、液膜分离等方法进行。

62.5.2.1 蒸馏分离法

利用R2O7(或HReO4)的易挥发性，在200～220℃滴加氢溴酸或盐酸于高沸点酸如高氯酸、硫酸或磷酸溶液中，或滴加硝酸于硫酸溶液中可将铼蒸馏出来。用饱和碳酸钠溶液为吸收液，部分As3+、Se4+、Se6+、Te4+和Hg，及大部分Sb3+、Sb5+、Os、Cr、Sn、Ge、Tl+和少量钼随铼一并进入蒸馏液中。蒸馏时以水蒸汽、二氧化碳、氮气或空气为载气。如利用水蒸汽通入硫酸溶液，在270～290℃下蒸馏铼，仅Se4+、Se6+、As3+及Re-一并进入蒸馏液中，而Hg、Mo、Bi及Te只有很少量被蒸馏出来。

62.5.2.2 共沉淀分离法

(1)以砷(Ⅲ)为聚集剂

在4mol/LHCl或3mol/LH2SO4中，以砷(Ⅲ)为聚集剂，通入硫化氢可使微量铼与之共沉淀，生成的棕褐色Re2S7易溶于含过氧化氢的氢氧化铵或氢氧化钠溶液中。

(2)高铼酸亚铊

在pH4～6的乙酸盐溶液中，高铼酸(ReO-4)与铊(Ⅰ)生成高铼酸亚铊沉淀，可与铜、锌、镉、钴、镍、铝、锰、钙、镁等分离，钼酸与铊(Ⅰ)也生成沉淀，可用柠檬酸掩蔽(10mg柠檬酸可掩蔽16mg钼)。

(3)氯化四苯(TPAC)

在5mol/LHCl至6mol/LNH4OH中均可用TPAC定量地沉淀ReO-4。Hg2+、Bi3+、Pb2+、Ag+、Sn2+、VO2+，以及MnO-4、ClO-4、IO-4、I-、Br-、F-和SCN-等离子干扰测定。VO3-4及WO2-4无干扰。如在含有0.6mol/L酒石酸盐的氨性介质中且调节pH8～9的溶液中进行沉淀，则可与Hg2+、Bi3+、Ni2+、Fe3+、Pb2+、Ag+、Sn2+、VO2+、Zn2+、Cu2+、SO2-4、PO3-4、AsO3-3、VO3-4、MoO2-4、WO2-4、BO3-3等分离，MnO-4与铼同时沉淀。

(4)高氯酸四苯(TPAP)

微克量铼可在酸性、中性或碱性溶液中定量地与TPAP生成沉淀，MoO2-4不沉淀。在碱性溶液中(约2mol/LNaOH)进行沉淀，铼可与大量MoO2-4、WO2-4、AsO3-3、AsO3-4、ZnO2-2、AlO-2、CrO2-4、VO2-3、SeO2-3、NO-3、PO3-4等分离，析出的沉淀溶于热水后用2mol/LHClO4或过量高氯酸处理以交换出高铼酸离子，可用于光度法测定辉钼矿中的铼。

在pH<7.5，以铁(Ⅲ)共沉淀钼，ReO-4留在溶液中。

在pH3.5～7.5的乙酸盐缓冲溶液中，8-羟基喹啉可沉淀钼而铼留于溶液中。

在冷的(1+9)硫酸或盐酸溶液中，在Fe3+存在下，用Th4+、Rb2+或AsO3-4为聚集剂，铜铁试剂可定量地沉淀钼，残余的铜铁试剂用三氯甲烷萃取除去，铼留于水溶液中。

62.5.2.3 离子交换与吸附法

(1)纸色层析分离

以异丙醇-浓硝酸-水(7+2+2)的混合溶液为展开剂，使铼与钨、钼分离。Rf值分别为0.90、0.33和0。此法可分离10倍～100倍钨及钼存在下的1μg的铼。

(2)阳离子交换树脂

在pH1.5～5.0的盐酸中，钼以MoO2-4形式与大多数金属(铁、铜、镍、锰、铝等)一并被树脂吸附，而ReO-4进入淋洗液中，可使铼与钼分离。

(3)阴离子交换树脂

阴离子交换树脂分离富集情况及其他树脂交换分离富集铼，见表62.16、表62.17。

表62.16 阴离子交换树脂分离富集情况

续表

表62.17 其他树脂交换分离富集铼

(4)活性炭吸附

常温下(25℃)，活性炭在pH8.2～9.0时，对铼、钼的吸附率分别为E(Re):96.1%～93.0%，E(Mo):0.7%～0.001%。此条件能成功分离铼和钼。

62.5.2.4 溶剂萃取法

(1)萃取分离钼

a.羟基喹啉-氯仿。在pH1.5～5.6的乙酸-乙酸铵缓冲溶液中，1g/L8-羟基喹啉/氯仿可萃取钼及钨，铼不被萃取。

b.铜铁试剂-氯仿。在1mol/LH2SO4中，用10g/L铜铁试剂-氯仿可定量萃取分离钼，铼不被萃取。

c.乙基黄原酸钾-三氯甲烷。在2mol/LHCl或pH9～11的溶液中，钼与乙基黄原酸钾生成配合物定量地被三氯甲烷萃取，铼不被萃取，适用于分离含铜的钼精矿中的铼。

d.N-苯甲酰苯胲-氯仿。在0.752～2mol/LH2SO4或pH3的盐酸介质中，钼定量地被N-苯甲酰苯胲-氯仿萃取，可从微克量的铼中分离毫克量的钼。

e.磷钼杂多酸-乙酸戊酯。在0.52～0.7mol/LHCl中，钼作为磷钼杂多酸定量地被乙酸戊酯萃取，铼不被萃取。

(2)萃取分离铼

a.喹啉。在4mol/LNaOH溶液中，ReO-4定量地被喹啉萃取，可与50mg的Mo6+，100mgW6+、V5+、Se4+、As3+、As5+分离，蒸发除去喹啉或用水和四氯化碳反萃取使铼转入水相。

b.丁酮。在5mol/LNaOH溶液中，ReO-4可被丁酮萃取(3次萃取几乎接近定量)。可与Au、Ag、Bi、Cd、Fe2+、Ga、Mo6+、Pb、Pt4+、Sb3+、W、Zn等分离，用水和氯仿(7+10)反萃取，铼进入水相。

c.甲基异丁酮。在4mol/LH2SO4中，微克量ReO-4定量地被甲基异丁酮萃取，可与Mo(Ⅵ)(<0.18%)等分离，铼可用稀氢氧化钠反萃取。

d.8-巯基喹啉-三氯甲烷。在5～11.5mol/LHCl中，铼的8-巯基喹啉配合物被三氯甲烷萃取。

e.三辛胺/三壬胺-二甲苯/三氯甲烷。在1～6.0mol/LH2SO4中，ReO-4定量地被三辛胺、三壬胺的二甲苯或三氯甲烷萃取，可与Zn、Cd、Co、Ni、Mn2+、Cr3+、Fe、In、Bi、Cu、Al、Ca、Mg、V5+、W5+、Mo6+等分离，被萃取的微量钼可用饱和草酸溶液洗除，加入草酸钠或硫酸钠有利于抑制微量钼的萃取，萃取的铼可用50～100g/L的氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化铵溶液反萃取。

f.三丁胺-氯仿。在pH1～6.5HCl介质中，ReO-4定量地被三丁胺-氯仿萃取，可与60倍的Mo6+，600倍的Fe3+，6000倍的Ni，7000倍的Co、Pb，10000倍的Ag、Cu，12000倍的Cd等分离，被共萃取的微量Mo6+，可用饱和草酸钠溶液洗除。

g.N-苄替苯胺-氯仿。在3.5～4.5mol/LH2SO4中，ReO-4定量地被N-苄替苯胺(C6H5CH2NHC6H5)/氯仿萃取，可与Cu、Cd、As3+、Bi、Fe3+、Sb3+、Cr3+、Co、Ni、Ga、In、Ce3+、Ca、Mg、Sr、Se4+、Te4+、Ag、Hg2+、Tl3+等分离，Pd2+、Pt4+、V5+、Fe3+、Cr6+、Os6+、Ru6+、Ti4+、Ce4+与ReO-4同时被萃取，但除Pd2+、Pt4+以外的其他元素加入抗坏血酸后均不被萃取，U6+和Th也部分被共萃取，柠檬酸、酒石酸、草酸、抗坏血酸对萃取ReO-4无影响。有机相中的铼可用反萃取。

h.氯化四苯-三氯甲烷或二氯乙烷。在pH8～9且含用酒石酸或柠檬酸盐的溶液中，ReO-4与氯化四苯离子生成的缔合物可定量地被三氯甲烷或二氯乙烷萃取。当溶液中钼与铼之比为106∶1可定量分离钼。20mg的Se4+、Ni、Fe3+、Pb、Zn、Cu2+、AsO2-3、AsO3-4、WO2-4、SiO2-3、SO2-4、PO3-4不被萃取。有机相中的铼可用浓盐酸反萃取，也可在有机相直接测定铼。或将萃取液蒸干后，用水浸取并通过Dowex-50阴离子交换树脂(H+型)，四苯离子被树脂交换吸附，ReO-4进入洗脱液中。

i.其他溶剂萃取。见表62.18。

表62.18 其他溶剂萃取

62.5.2.5 液膜分离法

以二苯并-18-冠-6(DBC)-L113B-(CCl4+n-Hrxance)-NaClO4溶液组成的液膜体系。在下列条件下:膜相，DBC-L113B-(CCl4+n-Hrxance)体积比为7+4+89内相，0.2mol/LNaClO4溶液，油内比为1+1外相2mol/LH2SO4介质，乳水比为20+100室温(15～36℃)，搅拌速度250r/min富集时间8min。200μgRe(Ⅶ)的迁移率(回收率)达99.5%～100.5%。50mgMo6+、W6+、Fe3+、Al3+、Cu2+、Ni2+、Mn2+、Sr2+、Ba2+、Zn2+、Mg2+、Sn4+、La3+、Y3+、Cr3+、Bi3+、K+、Na+、Li+、NH+4、Cd2+、Cs+，20mgCa2+、Pb2+，5mgPt4+、Pd2+等(均为最大限量)，大量Cl-、SO2-4、NO-3、SO2-4、PO3-4等，都不被迁移富集或不影响富集铼。K+存在下，对迁移铼极为有利。富集方法用于钼精矿、多金属矿和合金中铼的硫脲光度法测定，效果较佳。

在用柱色谱分离混合物时，将已溶解的样品加入到已装好的色谱柱顶端，吸附在固定相（吸附剂）上，然后用洗脱剂（流动相）进行淋洗，流动相带着混合物的组分下移。样品中各组分在吸附剂上的吸附能力不同，一般来说，极性大的吸附能力强，极性小的吸附能力相对弱一些。且各组分在洗脱剂中的溶解度也不一样，而被解吸的能力也就不同。非极性组分由于在固定相中吸附能力弱，首先被解吸出来，被解吸出来的非极性组分随着流动相向下移动与新的吸附剂接触再次被固定相吸附。随着洗脱剂向下流动，被吸附的非极性组分再次与新的洗脱剂接触，并再次被解吸出来随着流动相向下流动。而极性组分由于吸附能力强，因此不易被子解吸出来，随着流动相移动的速度比非极性组分要慢得多（或基本不移动）。这样经由反复的吸附和解吸后，各组分在色谱柱上构成了一段一段的层带，若是有色物质，可以看到不同的色带。跟着洗脱过程的进行从柱底端流出。每一色带代表一个组分，分离收集不同的色带，再将脱洗剂蒸发，就可以得到单一的纯物质。

1、 TLC

柱层析要害在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择适当。而淋洗剂的挑选是通过TLC断定。TLC的作用除了跟踪反应过程，检测试剂和原料纯度外，一个主要的用处就是为柱层析选择适当的淋洗剂。

目标产物的Rf值在0.2～0.3左右时，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一至两倍后的溶剂。因为层析柱和薄板不同，即便两者使用的硅胶都相同，然而在把TLC剖析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释，但又不能稀释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。

须要留神的是：某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不即是在别的展开剂中也只显示一个点。因而在寻找展开剂时，多尝试多少种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开，普通以目的产物的Rf值在0.3-0.5为最佳。点不能点得太浓，否则轻易重叠不易断定，由于如果两个点相近的话，一浓就变成一个点了。板上点的展开的清楚水平跟溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关，只有两者比拟适合才干有一个较好的分离效果。

取舍适当的展开剂是重要义务，一般常用溶剂按照极性从小到大的次序排列大略为：石油醚<环已烷<四氯化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<正丙醇<乙醇<甲醇<水，单纯的展开剂一般不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂。通常使用一个高极性和低极性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增添辨别度的作用，常用的溶剂组合有：石油醚/乙酸乙酯，石油醚/丙酮，石油醚/乙醚，石油醚/二氯甲烷，乙酸乙酯/甲醇，二氯甲烷/乙酸乙酯，二氯甲烷/甲醇，氯仿/乙酸乙酯。丙酮，甲醇等溶剂需注意含水量，如含水较多可用无水硫酸镁等干燥剂处置，氯仿需使用无水氯化钙除去1％的醇。

开展剂的比例要靠尝试。良多时候，展开剂的抉择要靠本人一直变换展开剂的组成来达到最佳效果。个别把两种溶剂混合时，采取高极性/低极性的体积比为1/2-3的混杂溶剂，假如有离开的迹象，再调剂比例，到达最佳后果，如果不分开的迹象，最好是换溶剂。有些时候展开剂中参加少量的酸碱物资（乙酸、三乙胺、氨水）会起到很好的分别效果。

用TLC判定物质的纯度与含量时，往往要和其它分析手腕相联合，因为某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。产品点检测要更多地使用专用显色剂，如果仅用紫外灯，会丧失较多产品，紫外的敏锐度一般比显色剂低1-2个数目级。显色剂的使用与配制见附1。

2、装柱：

装柱一般分为湿法和干法两种，无论干法仍是湿法，固定相的上名义必定要平坦，并且固定相的高度一般为15?左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会因为扩散或拖尾导致分离效果不好。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。如果样品量在100mg以下，则能够考虑使用附2所述办法，应用薄层层析硅胶。

湿法装柱柱效比较高，合适分离少量的比较难分离的物质，一般使用200～300目的硅胶，颗粒比较粗的硅胶（200目以下）因为不易调成糊状，所以不适合湿法装柱。

在干净干燥的层析柱（无砂芯柱）下端放置少量脱脂棉，再铺约0.5?厚的石英砂或无水硫酸钠铺平，然落后行装柱。将吸附剂（氧化铝或硅胶）用洗脱剂中极性最低的洗脱剂调成糊状，在柱内先加入约3/4柱高的洗脱剂，再将调好的吸附剂边敲边倒入柱中，同时，翻开下旋活塞，在色谱柱下面放一个清洁并且干燥的锥形瓶或烧杯，接受洗脱剂。当装入的吸附剂有一度高度时，洗脱剂下贱速度变慢，待所用吸附剂全体装完后，用流下来的洗脱剂转移残留的吸附剂，并将柱内壁残留的吸附剂淋洗下来。在此过程中，应不断敲打色谱柱，以使色谱柱填充平匀并没有气泡。柱子填充完后，在吸附剂上端覆盖一层约0.5cm厚的石英砂或无水硫酸钠。笼罩石英砂或无水硫酸钠的目的是：a使样品匀称地流入吸附剂表面；b当加入洗脱剂时，它可以避免吸附剂表面被损坏。在整个装柱过程中，柱内洗脱剂的高度始终不能低于吸附剂最上端，否则柱内会出现裂缝和睦泡。

干法装柱是指将干的固定相直接倒入层析柱中，也可以先在层析柱中加入3/4的洗脱剂，而后倒入固定相。干法装柱快捷便捷，分离混合物时如无特别请求一般采用干法。

干法快速装柱一般如下操作。在清洁干燥的层析柱（无砂芯柱）下端放置少量脱脂棉，将液体出口覆盖，脱脂棉要压紧且上端平整，也可加入石英砂或无水硫酸钠使其平整。一次性加入层析需要的所有硅胶，然后再轻小扣打柱子，至硅胶界面平整且不再降落为止。然后用真空泵直接抽，可以间断的开启封闭活塞，使硅胶更密实。

干法装柱后要用洗脱剂均衡装好的层析柱，一般用低极性的洗脱剂淋洗至溶剂于硅胶之间吸附放热景象消散为止，这一点尤其在待分离物质极性比较小和对热敏感的时候无比重要。

3、上样：

上样也有干法和湿法之分。

干法就是把待分离的样品稀释后用少量溶解度较好的溶剂溶解后,骆鼎昌到军工单位，在加入恰好可以完全吸附溶剂量的硅胶，拌匀后再旋蒸去溶剂。如斯得到的粉末再警惕加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层平整。需要注意的是硅胶的用量，硅胶用量太大，样品质变多，不利于样品的分离；硅胶用量太少，如遇溶解度差的产品会梗塞全部层析柱,实行党委领导下的院长分工负责制，导致流速变慢甚至完整不流。硅胶用量一般规矩：①液体样品，称2-3倍于上样量的硅胶用于吸附样品，称10-25倍于上样量的硅胶用于填充固定相；②油状样品，称1.5-2倍于上样量的硅胶用于吸附样品，称10-25倍于上样量的硅胶用于填充固定相；③固体样品，称1-1.5倍于上样量的硅胶用于吸附样品，称10-25倍于上样量的硅胶用于填充固定相；如果极难分，也可以用50-100倍量的硅胶装柱。

湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁平均加入。然后用少量淋洗剂洗涤后，再加入。湿法较方便，少量样品一般采用此法。

4、淋洗：

淋洗剂是将分离物从吸附剂上洗脱下来所用的溶剂，所以也称为洗脱剂或简称溶剂。其极性大小和对被分离物各组分的溶解度大小对于分离效果十分重要。如要淋洗剂的极性弘远于被分离物的极性，则淋洗剂将受到吸附剂的强烈吸附，从而将本来被吸附的待分离物“顶替”下来，随过剩的淋洗剂冲下而起不到分离作用；如果淋洗剂的极性远小于各组分的极性，则各组分被吸附剂强烈吸附而留在固定相中，不能随流动相向下挪动，也不能达到分离的目的。如要淋洗剂对于被分离物各组分溶解度太大，被分离物将会过多、过快地溶解于其中并被迅速洗脱而不能很好地分离；如果溶解度太小，则会造成谱带疏散，甚至完全不能分开。常用溶剂的极性大小顺序也因所用吸附剂的品种不同而不尽相同，初步肯定后再上柱分离。如要所有色带都行进甚慢则应改用极性较大溶解机能也较大的溶剂，反之则改用极性和溶解性都较小的溶剂，直至取得满足的分离效果。

除了分离效果外还应该考虑：①在常温至沸点的温度规模内可与被分离物长期共存不产生任何化学反响，也不被吸附剂或被分离物催化而发生本身的化学反映；②沸点较低以利回收；③毒性较小，操作保险；④恰当考虑价钱是否合算，起源是否便利；⑤回收溶剂正常不应作为终极纯化产物的淋洗剂。

淋洗剂的用量往往较大，故最好使用单一溶剂以利回收。只有在选不出合适的单一溶剂时才使用混合溶剂。混合溶剂一般由两种可以无穷混溶的溶剂组成，先以不同的配比在薄层板上实验，选出最佳配比，再按该比例配制好，像单一溶剂一样使用。如要必需在层析过程中转变淋洗剂的极性，不能把一种溶剂敏捷换成另一种溶剂，而应当将极性稍大的溶剂按一定的百分率逐步加到正在使用的溶剂中去，逐渐进步其比例，直至所需要的配比。一条教训法则称为“幂指数增加”，例如，原淋洗剂为环己烷，如欲加入二氯甲烷以增长其极性，则不应即时换为二氯甲烷，而应使用这两种溶剂的混合液，其中二氯甲烷的比例顺次为5%，15%，45%，最后再换为污浊的二氯甲烷。每次加大比例后，须待流出液量为吸附剂装载体积的3倍时再进一步加大比例。这只是一般方法，其目标在于防止后面的色带前进过快，追上前面的色带，造成穿插带。但如果两色带间有很广阔的空缺带，不会造成交叉，则亦可直接换成后一种溶剂，所以应依据详细情况机动应用。

5、收集：

柱层析实际上是在扩散和分离之间的衡量。太低的洗脱强度并不好，推举用梯度洗脱。一般情况下收集的情况如下：10mg上样量，1g硅胶，0.5ml收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶，20～50ml收一馏分。详细情形要对待分离的物质决议，附2文有一定参考价值。

附1：

显色剂实用范畴及其配制方式

显色剂 适用范围 配制方法 硫酸 大部门有机物 40%体积比乙醇溶液 碘 生物碱、氨基酸、肽、脂、皂甙、不饱和或者芳香族化合物 在广口瓶中，按1：3分量比加入碘和硅胶 茚三酮 氨基酸、氨类、伯胺 1.5g茚三酮，100ml正丁醇，3ml醋酸 溴甲酚绿 羧酸，pKa<=5.0 100ml乙醇， g溴甲酚绿，滴加0.1M的NaOH水溶液，刚好出现蓝色即至。 香草醛 胺类（黄色） 15g香草醛，250ml乙醇，2.5ml硫酸 氯化铁 苯酚类 1%氯化铁的乙醇水溶液（50%） 荧光黄 芬芳族、杂环 0.05%荧光黄的甲醇水溶液（50%） 高锰酸钾 含还原性基团,情趣用品，双键、羟基、氨基、醛 1.5gKMnO4,10gK2CO3,1.25ml10%NaOH，200ml水，使用期3个月 二硝基苯肼 醛和酮 1.2g硝基苯肼,20ml乙醇,6ml硫酸,8ml水 硫酸铈 生物碱 10%硫酸铈(IV)的硫酸水溶液(15%) 柱层析技术的数学分析

本文所指的柱层析技巧：

1、 Flash chromatograph加压倏地过柱，避免扩散的发生，分离效果大提高。

2、 用薄层层析硅胶装柱，柱层析硅胶干法上样，保障上样的平均性。上样高度不超过

2～3mm

3、 洗脱剂=展开剂。

4、 TLC上，二点没用重叠。

假设：柱层析也有一个Rf值。对上面的柱层析技术，该Rf值=薄层层板（TLC）的Rf值。根据作者经验，该假设成破。

问题：

设硅胶高度为h厘米，单位厘米的硅胶体积为s。TLC上有两个点，x、y，Rf分辨为Rf1和Rf2，其中Rf1>Rf2现在要把上述两个点分开。请问x什么时候出来，用什么样的吸收瓶能保证把两个点分开。

解答：

hx=x点涌现在柱下方的时候，洗脱剂总共流过的高度

hy=y点出当初柱下方的时候，洗脱剂总共流过的高度

设硅胶局部含溶剂体积为V，V确定小于h×s，当洗脱剂从上方流到柱下方的时候，x点到达h×Rf1处，y点到达h×Rf2处。要让x点到达柱下方，实在就是解下列方程：

h/hx=(h×Rf1)/h=Rf1

即：hx=h/Rf1

同理，y点达到柱下方，洗脱剂需流经hy高度，hy=h/Rf2，x，点相差离为hy-hx，斟酌到他们都有扩散，设其扩散半径雷同，都为R，对疾速柱，扩散效应都不厉害，设其值为，R=,性用品,即假设他们旁边夹着一个同样大小的中间点,则x，y点实际相差为hy-hx-2R=(hy-hx)/2,语文导读法的理论构想和基本课式（中）（转自中国著名。所以，当接受瓶总共接收到hx×s+V=h/Rf1+V体积的时候，hx开端呈现，V<h×s

如果接受瓶的体积小于(h/Rf2-h/Rf1)×s/2的时候，可足够保证分开x和y点。

1、乙醇>丙酮>乙酸乙酯>乙醚>氯仿>环己烷>

2、沸点由高到低：正戊醇-乙酸-正丁醇-吡啶-甲苯-苯-乙酸乙酯-甲醇-氯仿-丙酮-二氯甲烷-乙醚

3、洗脱能力由弱到强：水-甲醇-氢氧化钠水溶液-甲酸铵

4、硅胶,氧化铝、聚酰胺、大孔树脂、离子交换树脂,特点上书上查

1.纸色谱（PC）：适用于分离各种天然黄酮类化合物及其苷类混合物。混合物的鉴定常采用双向色谱法。以黄酮苷类来说，一般第一向展开采用某种醇性溶剂，如正丁醇-醋酸-水（4：1：5，上层）等，主要是根据分配作用原理进行分离。第二向展开溶剂则用水或其他含水溶液，如2～6%醋酸等，主要是根据吸附作用原理进行分离。

黄酮类化合物苷元中，平面性分子如黄酮、黄酮醇、查耳酮等，用含水溶剂如3%～5%HOAC展开时，几乎停留在原点不动（Rf＜0.02）；而非平面性分子如二氢黄酮、二氢黄酮醇、二氢查耳酮等，因亲水性较强，Rf 值较大（ 0.10～0.30）。黄酮类化合物分子中羟基苷化后，极性随之增大，在醇性展开剂中Rf 值相应降低，同一类型苷元，Rf值依次为：苷元＞单糖苷＞双糖苷。但在用水或2～8%醋酸、3%氯化钠水溶液或1%盐酸展开时，则苷元几乎停留在原点不动，Rf 值大小顺序为：苷元＜单糖苷＜双糖苷。

2.硅胶薄层色谱：用于分离和鉴定弱极性黄酮类化合物。分离黄酮苷元常用的展开剂是甲苯-甲酸乙酯-甲酸（5：4：1）。

3.聚酰胺薄层色谱：特别适合于分离含游离酚羟基的黄酮及其苷类。展开剂中多含有醇、酸和水。

用紫外及可见光谱对黄酮类化合物进行结构测定的一般程序：

(1)测定样品在甲醇溶液中的UV光谱。

(2)测定样品在甲醇中加入各种诊断试剂后得到的UV及可见光谱。常用的诊断试剂有甲醇钠（NaOMe）、醋酸钠(NaOAc)、醋酸钠-硼酸(NaOAc-H3BO3 )、三氯化铝(AlCl3)、三氯化铝-盐酸(Al?鄄Cl3-HCl)等。

(3)样品如为黄酮苷类，需先进行水解或甲基化后水解，得到苷元或甲基化苷元，再测定苷元或其衍生物的UV光谱。

黄酮类化合物在甲醇溶液中的UV光谱特征:

1.黄酮及黄酮醇类：黄酮、黄酮醇等多数黄酮类化合物，因分子中存在桂皮酰基及苯甲酰基组成的交叉共轭体系，故其甲醇溶液在200～400nm的区域内存在两个主要的紫外吸收带，称为峰带Ⅰ（300～400nm）及峰带Ⅱ（220～280nm）。黄酮、黄酮醇可通过带I的最大吸收峰波长予以鉴别，小于350nm者为黄酮，而大于350nm者为黄酮醇。

2.查耳酮及橙酮类：共同特征是带Ⅰ很强，为主峰，而带Ⅱ较弱，为次强峰。查耳酮中，带Ⅱ位于220～270nm， 带Ⅰ位于340～390nm，有时分裂为Ⅰa (340～390nm)及Ⅰb（300～320nm）。

3.异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇：除有由A环苯甲酰基系统引起的带Ⅱ吸收（主峰）外，因B环不与吡喃酮环上的碳基共轭（或共轭很弱），带Ⅰ很弱，常在主峰的长波方向处有一肩峰。根据主峰的位置，可以区别异黄酮与二氢黄酮及二氢黄酮醇。前者在245～270nm，后者在270～295nm。

黄酮类化合物的1HMNR谱主要特征:

一、A环质子

1.5,7-二羟基黄酮：H-6及H-8将分别作为二重峰（J=2.5Hz），出现在δ5.7～6.9区域内，且H-6总是比H-8位于高场。

2.7-羟基黄酮：A环上有H-5、H-6、H-8三个芳香质子。H-5因有C-4位羰基强烈的负屏蔽效应的影响，以及H-6的邻偶作用，将作为一个二重峰（J=9.0Hz）出现在δ8.0左右。H-6因有H-5的邻偶（J=9.0Hz）及H-8的间偶（J=2.5Hz）作用，将表现为一个双二重峰。H-8 因有H-6的间位偶合作用，显现为一个裂距较小的二重峰（J=2.5Hz）。

二、B环质子

1.4’-氧取代黄酮：B环质子分为H-3’，H-5’和H-2’，H-6’两组，各以相当于2个氢的双峰信号（（J=8.5Hz）出现在δ6.5～7.9区域。H-3’，H-5’的化学位移总是比H-2’，H-6’的化学位移值小，原因是有4’-OR取代基的屏蔽作用，以及C环对H-2’，H-6’的负屏蔽效应。

2.3’,4’,5’-三氧取代黄酮类：当B环有3’,4’,5’-羟基时，则H-2’及H-6’将作为相当于两上质子的一个单峰，出现在δ6.50～7.50范围内。

三、C环质子

1.黄酮类：H-3常常作为一个尖锐的单峰信号出现在δ6.30处。

2.异黄酮类：异黄酮上的H-2，因正好位于羰基的β位，且通过碳和氧相接，故将作为一个单峰出现在比一般芳香质子较低的磁场区（δ7.60～7.80）。

3.二氢黄酮及二氢黄酮醇类

①二氢黄酮类：H-2与两个磁不等同的H-3偶合（Jtrans=11.0Hz，Jcis=5.0Hz），故作为一个双二重峰出现，中心位于δ5.2处。两个H-3，因有相互偕偶（J=17.0Hz）及H-2的邻偶，将分别作为一个双二重峰出现，中心位于δ2.80处，但往往相互重迭。

②二氢黄酮醇类：在天然存在的二氢黄酮醇中，H-2及H-3多为反式二直立键，故分别作为一个二重峰出现（J=11.0Hz）。H-2位于δ4.9前后，H-3则位于δ4.30左右。

流化喷雾干燥是近十年来迅速发展的一种制粒技术。该技术利用流化床干燥器使粉末呈流化态，再喷洒药液（或黏合剂），使之与粉末黏合成颗粒。其将浸膏与粉末混合、干燥、粉碎、制粒等工序合并在一起，具有工艺简单、减少污染机会、减轻劳动强度、可连续生产等优点。最近几年，各种符合GMP要求的流化干燥设备不断创新，使这项技术日趋成熟。

在该项研究中，技术人员采用FLP型流化造粒包衣机对全浸膏粉胶囊及部分生药粉加浸膏的胶囊，分别用流化喷雾干燥制粒工艺进行了小试制备。

首先，制备含生药加浸膏的养血胶囊，即将中药提取液浓缩至相对密度达1.15～1.18，将生药粉粉碎成细粉（100目），按生药粉∶浸膏为1∶1的重量比，将生药粉置流化床内，加热至80℃，抽风，使粉末流化，采用顶喷式喷洒浓缩液，50分钟后结束喷液，沸腾干燥15分钟，将所得颗粒分填胶囊。随后，制备全浸膏的清热胶囊，即将药液浓缩到相对密度1.14～1.18的范围，取该品种干浸膏细粉（100目），按浸膏粉∶浸膏液为1∶1的重量比，将上述浸膏粉置于流化床内，之后使药粉流化，喷洒药液，床内温度控制在40℃以下，50分钟后喷液完成，沸腾干燥15分钟，将所得颗粒分填胶囊。所得样品为均匀细粒状浅褐棕色粉末。

研究表明，颗粒粒径与喷洒药液的雾化程度、喷洒过程中流化床内的温度有关。液滴大，温度低，颗粒粒径大；反之则小。用新工艺方法制备的颗粒粒径在45～60目之间，外观性状均较常规方法为好，颗粒均匀，颜色稍浅，溶散也较常规方法快。并且新工艺制得的颗粒剖面可见许多微孔。用这些细颗粒填充胶囊，流动性好，装量比常规制法稳定，装量差异小。研究人员对制备的细颗粒与传统工艺制得的颗粒按产品质量标准检验，结果表明，薄层分析的斑点以新工艺法明显清晰，这可能与两种方法加热时间长短不同对所含成分的影响有关。