食品中维生素e含量检验为什么要用脱醛乙醇
第一篇 高效液相色谱法2 原理样品中的维生素A及维生素E经皂化提取处理后,将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中.用高效液相色谱法C18反相柱将维生素A和维生素E分离,经紫外检测器检测,并用内标法定量测定.最小检出量分别为VA：0.8ng；α－E：91.8ng；γ－E：36.6ng；δ－E：20.6ng. 3 试剂实验用水为蒸馏水.试剂不加说明为分析纯. 3.1 无水乙醚：不含有过氧化物. 3.1.1 过氧化物检查方法：用5mL乙醚加1mL 10%碘化钾溶液,振摇1min,如有过氧化物则放出游离碘,水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉液,水层呈蓝色.该乙醚需处理后使用. 3.1.2 去除过氧化物的方法：重蒸乙醚时,瓶中放入纯铁丝或铁末少许.弃去10%初馏液和10%残馏液. 3.2 无水乙醇：不得含有醛类物质. 3.2.1 检查方法：取2mL银氨溶液于试管中,加入少量乙醇,摇匀,再加入10%氢氧化钠溶液,加热,放置冷却后,若有银镜反应则表示乙醇中有醛. 3.2.2 脱醛方法：取2g硝酸银溶于少量水中.取4g氢氧化钠溶于温乙醇中.将两者倾入1L乙醇中,振摇后,放置暗处两天(不时摇动,促进反应),经过滤,置蒸馏瓶中蒸馏,弃去初蒸出的50mL.当乙醇中含醛较多时,硝酸银用量适当增加. 3.3 无水硫酸钠. 3.4 甲醇：重蒸后使用. 3.5 重蒸水：水中加少量高锰酸钾,临用前蒸馏. 3.6 10%抗坏血酸溶液(m/V)：临用前配制. 3.7 1∶1氢氧化钾溶液. 3.8 10%氢氧化钠溶液(m/V). 3.9 5%硝酸银溶液(m/V). 3.10 银氨溶液：加氨水至5%硝酸银溶液中,直至生成的沉淀重新溶解为止,再加10%氢氧化钠溶液数滴,如发生沉淀,再加氨水直至溶解. 3.11 维生素A标准液：视黄醇(纯度85%)或视黄醇乙酸酯(纯度90%)经皂化处理后使用.用脱醛乙醇溶解维生素A标准品,使其浓度大约为1mL相当于1mg视黄醇.临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度. 3.12 维生素E标准液：α－生育酚(纯度95%),γ－生育酚(纯度95%),δ－生育酚(纯度95%).用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品,使其浓度大约为1mL相当于1mg.临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素E的准确浓度. 3.13 内标溶液：称取苯并〔e〕芘(纯度98%),用脱醛乙醇配制成每1mL相当于10μg苯并〔e〕芘的内标溶液. 3.14 pH1～14试纸. 4 仪器和设备4.1 实验室常用设备. 4.2 高压液相色谱仪带紫外分光检测器. 4.3 旋转蒸发器. 4.4 高速离心机4.4.1 小离心管：具塑料盖1.5～3.0mL塑料离心管(与高速离心机配套). 4.5 高纯氮气. 4.6 恒温水浴锅. 4.7 紫外分光光度计. 5 操作步骤5.1 样品处理5.1.1 皂化称取1～10g样品(含维生素A约3μg,维生素E各异构体约为40μg)于皂化瓶中,加30mL无水乙醇,进行搅拌,直到颗粒物分散均匀为止.加5mL 10%抗坏血酸,苯并〔e〕芘标准液2.00mL,混匀.加10mL1：1氢氧化钾,混匀.于沸水浴上回流30min使皂化完全.皂化后立即放入冰水中冷却. 5.1.2 提取5.1.2.1 将皂化后的样品移入分液漏斗中,用50mL水分2～3次洗皂化瓶,洗液并入分液漏斗中.用约100mL乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣,乙醚液并入分液漏斗中.如有残渣,可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗.轻轻振摇分液漏斗2min,静置分层,弃去水层. 5.1.3 洗涤5.1.3.1 用约50mL水洗分液漏斗中的乙醚层,用pH试纸检验直至水层不显碱性(最初水洗轻摇,逐次振摇强度可增加). 5.1.4 浓缩5.1.4.1 将乙醚提取液经过无水硫酸钠(约5g)滤入与旋转蒸发器配套的250～300mL球形蒸发瓶内,用约10mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次,并入蒸发瓶内,并将其接至旋转蒸发器上,于55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚,待瓶中剩下约2mL乙醚时,取下蒸发瓶,立即用氮气吹掉乙醚.立即加入2.00mL乙醇,充分混合,溶解提取物. 5.1.5 将乙醇液移入一小塑料离心管中(4.4.1),离心5min(5000rpm).上清液供色谱分析.如果样品中维生素含量过少,可用氮气将乙醇液吹干后,再用乙醇重新定容.并记下体积比. 5.2 标准曲线的制备5.2.1 维生素A和维生素E标准浓度的标定方法取维生素A和各维生素E标准液若干微升,分别稀释至3.00mL乙醇中,并分别按给定波长测定各维生素的吸光值.用比吸光系数计算出该维生素的浓度.测定条件如下表所示. 表1 标 准 加入标准的量 s,μl 比吸光系数波 长 λ,nm 视 黄 醇 γ－生育酚 δ－生育酚 α－生育酚 10.00 100.0 100.0 100.0 1835 71 92.8 91.2 325 294 298 298 浓度计算： 5.2.2 标准曲线的制备本方法采用内标法定量.把一定量的维生素A、γ－生育酚、α－生育酚、δ－生育酚及内标苯并〔e〕芘液混合均匀.选择合适灵敏度,使上述物质的各峰高约为满量程70%,为高浓度点.高浓度的1/2为低浓度点(其内标苯并〔e〕芘的浓度值不变),用此二种浓度的混合标准进行色谱分析,结果见色谱图.维生素标准曲线绘制是以维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标,维生素浓度为横坐标绘制,或计算直线回归方程.如有微处理机装置,则按仪器说明用二点内标法进行定量. 本方法不能将β－E和γ－E分开,故γ－E峰中包含有β－E峰. 5.3 高效液相色谱分析5.3.1 色谱条件(推荐条件) 5.3.1.1 预柱：ultrasphere ODS 10μm,4mm×4.5cm. 5.3.1.2 分析柱：ultrasphere ODS 5μm,4.6mm×25cm. 5.3.1.3 流动相：甲醇∶水＝98∶2.混匀.于临用前脱气. 5.3.1.4 紫外检测器波长：300nm.量程0.02. 5.3.1.5 进样量：20μL. 5.3.1.6 流速：1.7mL/min. 5.4 样品分析取样品浓缩液20μL,待绘制出色谱图及色谱参数后,再进行定性和定量. 5.4.1 定性：用标准物色谱峰的保留时间定性. 5.4.2 定量：根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值,以此值在标准曲线上查到其含量.或用回归方程求出其含量. 6 计算 式中：X2——某种维生素的含量,mg/100g；C——由标准曲线上查到某种维生素含量,μg/mL；V——样品浓缩定容体积,mL；m——样品质量, g. 用微处理机二点内标法进行计算时,按其计算公式计算或由微机直接给出结果. 7 结果的允许差同一实验室,同时测定或重复测定结果相对偏差绝对值≤10%. 第二篇 比色法8 原理维生素A在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用,产生蓝色物质,其深浅与溶液中所含维生素A的含量成正比.该蓝色物质虽不稳定,但在一定时间内可用分光光度计于620nm波长处测定其吸光度. 9 试剂本实验用水均为蒸馏水. 9.1 无水硫酸钠：同3.3. 9.2 乙酸酐. 9.3 乙醚：同3.1. 9.4 无水乙醇：同3.2. 9.5 三氯甲烷：应不含分解物,否则会破坏维生素A. 9.5.1 检查方法三氯甲烷不稳定,放置后易受空气中氧的作用生成氯化氢和光气.检查时可取少量三氯甲烷置试管中加水少许摇振,使氯化氢溶到水层.加入几滴硝酸银液,如有白色沉淀即说明三氯甲烷中有分解产物. 9.5.2 处理方法试剂应先测验是否含有分解产物,如有,则应于分液漏斗中加水洗数次,加无水硫酸钠或氯化钙使之脱水,然后蒸馏. 9.6 25%三氯化锑－三氯甲烷溶液：用三氯甲烷配制25%三氯化锑溶液,储于棕色瓶中(注意勿使吸收水分). 9.7 1∶1氢氧化钾溶液. 9.8 维生素A或视黄醇乙酸酯标准液：同3.11.其标定方法同5.2.1. 9.9 酚酞指示剂：用95%乙醇配制1%溶液. 10 仪器和设备10.1 实验室常用设备. 10.2 分光光度计. 10.3 回流冷凝装置. 11 操作步骤维生素A极易被光破坏,实验操作应在微弱光线下进行,或用棕色玻璃仪器. 11.1 样品处理：根据样品性质,可采用皂化法或研磨法. 11.1.1 皂化法：适用于维生素A含量不高的样品,可减少脂溶性物质的干扰,但全部试验过程费时,且易导致维生素A损失. 11.1.1.1 皂化：根据样品中维生素A含量的不同,称取0.5～5g样品于三角瓶中,加入10mL 1∶1氢氧化钾及20～40mL乙醇,于电热板上回流30min至皂化完全为止. 11.1.1.2 提取：将皂化瓶内混合物移至分液漏斗中,以30mL水洗皂化瓶,洗液并入分液漏斗.如有渣子,可用脱脂棉漏斗滤入分液漏斗内.用50mL乙醚分二次洗皂化瓶,洗液并入分液漏斗中.振摇并注意放气,静置分层后,水层放入第二个分液漏斗内.皂化瓶再用约30mL乙醚分二次冲洗,洗液倾入第二个分液漏斗中.振摇后,静置分层,水层放入三角瓶中,醚层与第一个分液漏斗合并.重复至水液中无维生素A为止. 11.1.1.3 洗涤：用约30mL水加入第一个分液漏斗中,轻轻振摇,静置片刻后,放去水层.加15～20mL 0.5mol/L氢氧化钾液于分液漏斗中,轻轻振摇后,弃去下层碱液,除去醚溶性酸皂.继续用水洗涤,每次用水约30mL,直至洗涤液与酚酞指示剂呈无色为止(大约3次).醚层液静置10～20min,小心放出析出的水. 11.1.1.4 浓缩：将醚层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中,再用约25mL乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次,洗液并入三角瓶内.置水浴上蒸馏,收回乙醚.待瓶中剩约5mL乙醚时取下,用减压抽气法至于,立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中维生素A含量在适宜浓度范围内. 11.1.2 研磨法：适用于每克样品维生素A含量大于5～10μg样品的测定,如肝的分析.步骤简单,省时,结果准确. 11.1.2.1 研磨：精确称2～5g样品,放入盛有3～5倍样品重量的无水硫酸钠研钵中,研磨至样品中水分完全被吸收,并均质化. 11.1.2.2 提取：小心她将全部均质化样品移入带盖的三角瓶内,准确加入50～100mL乙醚.紧压盖子,用力振摇2min,使样品中维生素A溶于乙醚中.使其自行澄清(大约需1～2h),或离心澄清(因乙醚易挥发,气温高时应在冷水浴中操作.装乙醚的试剂瓶也应事先放入冷水浴中). 11.1.2.3 浓缩：取澄清提取乙醚液2～5mL,放入比色管中,在70～80℃水浴上抽气蒸干.立即加入1mL三氯甲烷溶解残渣. 12 测定步骤12.1 标准曲线的制备准确取一定量的维生素A标准液于4～5个容量瓶中,以三氯甲烷配制标准系列.再取相同数量比色管顺次取1mL三氯甲烷和标准系列使用液1mL,各管加入乙酸酐1滴,制成标准比色列.于620nm波长处,以三氯甲烷调节吸光度至零点,将其标准比色列按顺序移入光路前,迅速加入9mL三氯化锑－三氯甲烷溶液.于6s内测定吸光度,将吸光度为纵坐标,以维生素A含量为横坐标绘制标准曲线图. 12.2 样品测定于一比色管中加入10mL三氯甲烷,加入1滴乙酸酐为空白液.另一比色管中加入1mL三氯甲烷,其余比色管中分别加入1mL样品溶液及1滴乙酸酐.其余步骤同标准曲线的制备. 13 计算 式中：X——样品中含维生素A的量,mg/100g(如按国际单位,每1国际单位＝0.3μg维生素A)；c——由标准曲线上查得样品中含维生素A的含量,μg/mL；m——样品质量,g；V——提取后加三氯甲烷定量之体积,mL；100——以每百克样品计.
乙酸乙酯的气相色谱图为什么出现2个峰
在HPLC分析中，在色谱柱正常，样品浓度适宜，分析方法合适，色谱峰在出峰时间较短的条件下，峰型应对称而尖锐。但在实际操作中，如果对样品不了解，前处理不恰当或者分析方法不合理等，会出现峰形不正常的情况，其中双峰现象就是液相色谱中常见的问题之一。色谱双峰指的是明明是同一种物质，但在色谱图中却呈现双峰，让实验人员误认为含有两种物质。
出现色谱双峰的原因一般有以下几种：
色谱柱
如果在样品分析时发现每个色谱峰都有双峰出现，尤其在采用单一纯物质时，则可以确定是色谱柱出现问题了，一般是柱头受损或者柱头固定相污染引起的。
如果进样量少，原来色谱柱正常，色谱峰的形状多为一大峰带一小峰，不一定拖尾，这一般应是柱头受堵，将色谱柱反过来接，用流动相冲洗或酸洗或其它溶剂，将堵在柱头的残留物冲掉，再反过来，一般情况下就行了。当然不反冲，正冲有时也会正常的。
如果峰拖尾，双峰强弱相差不大，柱头固定相变脏或流失可能性更大，这时可以将进样头拧开，将微孔滤片超声，柱头刮去一部分填料，重新填上新填料拧紧，不过这个对技术要求较高且不能经常做，否则用不了几次，色谱柱就会应柱效降低而报废。
如果上述不能解决问题，可能是柱塌陷造成的，此时需要更换色谱柱。
溶剂问题
目前HPLC分析多为反相色谱，流动相多为甲醇、乙腈、水，加各种添加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解，最佳的溶解方法是用流动相溶解。在实际分析中，有时候为了样品的溶解性或稳定性加入了一点的缓冲液，缓冲液的酸碱性可能会导致样品转化，从而产生双峰现象。此时需要更换缓冲液，调整溶剂pH值，或者用流动相配置样品。
此外，样品要现配现用，避免样品溶解液的有机相比例、pH值发生变化而导致的溶剂效应。
进样量
当用溶剂极性强度大的试剂，如纯甲醇、纯乙腈，纯乙醇，而分析体系中以水为主时，如果样品进样量大，如定量管为20ul，此时单一的纯物质会出现双峰，第二峰比第一峰小(每次都不太一样)，且拖尾，保留时间会提前(相对进样量少而言)，将进样量减少一半以上，峰型将变为正常。这是样品的溶剂与流动相极性相差太大，而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的，此情况下需要减少进样量。
另一个原因是，进样量不一定大，但绝对量很大，色谱图上的双峰紧靠在一起，基本上齐高，不拖尾(如果出峰很快，也可能是色谱柱问题)。将样品稀释再进样就可以了，这是由于进样量过大，色谱柱过载造成的。
pH值
体系pH值对色谱双峰的影响出现在各个环节上(前面已经提到)，尤其在缓冲液流动相平衡过程中其影响更为明显。当连续进样时，受pH的连续变化影响会经常遇到这种双峰的情况。另外，在样品分析时，流动相的pH尽量远离被分析物的等电点，否则也容易引起双峰的产生。在用离子对试剂分析时，选择不好条件也会容易引起双峰的产生。
样品特性
有些样品由于其化学结构的特点，存在互变异构现象，而这种互变异构体无法分开，而是以一个动态平衡存在。在色谱分析时，在一个特定的条件下(如pH值、流动相极性、温度等)，一种物质将出现双峰，双峰靠的很近，基本齐高，不拖尾，条件稍一变化，尤其pH，双峰现象将消失，如红霉素等。
有的样品紫外的色谱图上看不到双峰，但在LC-MS下，用质谱检测器，其质谱的总离子流图上较明显，如农药啶虫眯(吡虫清)。
试验方法本试验方法中所用滴定分析用标准溶液、杂质测定用标准溶液和试验方法中所用制剂及制品按GB
601、GB
602、GB
603之规定制备，实验用水应符合GB
6682中三级水规格。
4.1
乙酸乙酯（CH3COOC2H5）含量测定
按GB
9722之规定测定，其中：4.1.1
试验条件检测器：热传导检测器；载气及流量：氢气，60mL/min；柱长：2m；固定相：10%聚乙二醇己二酸酯涂于经石油醚浸泡、丙酮洗涤过的401有机担体[0.18～0.28mm(60～80目)]，于150℃老化4h；柱温度：120℃；汽化室温度：170℃；检测器温度：150℃；进样量:
8µL色谱柱有效板高：Heff≤20mm乙酸乙酯不对称因子：f≤2.3。各组分相对主体的相对保留值：r水，乙酸乙酯
=0.18；r甲醇，乙酸乙酯
=0.27；r乙醇，乙酸乙酯
=0.42；r乙酸甲酯，乙酸乙酯
=0.72。4.1.2
定量方法按GB
9722中8.2条之规定测定，需校正组分水、甲醇和乙醇相对于乙酸乙酯的质量校正因子分别为f水/乙酸乙酯
=0.55,
f甲醇/乙酸乙酯
=0.65,
f乙醇/乙酸乙酯
=0.74。4.2
密度测定按GB
611中5.1条之规定测定。4.3
色度测定量取50mL试样，注入100mL比色管中，按GB
605之规定测定。4.4
杂质测定
试样量取须精确至0.1mL。4.4.1
蒸发残渣量取222.2mL(200g)试样[化学纯取55.5mL(50g)]，按GB
9740之规定测定。4.4.2
水分同4.1条。4.4.3
酸度量取10mL95%乙醇，加2滴酚酞指示液(10g/L)，摇匀，用氢氧化钠滴定分析用标准溶液[c(NaOH)=0.02mol/L]滴定至溶液呈粉红色，并保持30s。加11mL(10g)试样，用氢氧化钠滴定分析用标准溶液[c(NaOH)=0.02mol/L]滴定至溶液呈粉红色，并保持30s。
目的探索工作场所空气中乙醇的气相色谱检测法.方法用洁净100
ml注射器在工作场所常规采样,在给定的色谱条件下,24
h内分析完毕.结果工作场所中乙醇浓度在39.5～3
850
mg/m3(参照美国工作场所最高容许浓度1
900
mg/m3[1])之间时,方法的相对标准偏差(RSD)为1.3%～4.3%,回归方程式Y=32857X-21.3,相关系数r=0.9990,方法检测限为2.0
mg/m3,样品放置24
h损失＜10%.本法的精密度、回收率、稳定性都能达到样品分析的要求,在此分析条件下,样品中共存的甲醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇不干扰测定[2.3],与共存物分离良好.结论本方法建立了一种采样方法简便,分析快速准确,完全可应用于工作场所空气中乙醇浓度测定.
分离度（resolution，又称为解析度、分辨率）是色谱图中相邻两峰分离程度的量度。两峰间的分离程度受两峰尖的距离和两峰各自峰宽的制约。若保持峰宽不变，加大峰间的距离则分离程度加大，即分离度与两峰的保留时间之差成正比；若保持两峰间距离不变，使峰的宽度减小，两峰分离程度亦将增大，即分离程度与峰宽成反比。分离度，就我所做的色谱方面讲，分离度resolution——R等于相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。简单说，就我所用的HPLC在工作时，得到的图谱有很多峰，看每个峰离的远不远，基线会不会连在一起，是否互相干扰的。又称分辨率,为了判断分离物质对色谱柱在色谱柱中的分离情况,常用分离度作为柱的总分离效能指标.用R表示.R等于相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比. 相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R越大，表明相邻两组分分离越好。一般说当R＜1时，两峰有部分重叠；当R=1.0时，分离度可达98%；当R=1.5时，分离度可达99.7%。通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。当R＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。R＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7%。R≥1.5称为完全分离。《中国药典》规定R应大于1.5。 分离度计算公式：R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)
它是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入待测样品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）又叫做高压或高速液相色谱、高分离度液相色谱或近代柱色谱,以液体为流动相，采用高压输液系统，是色谱法的一个重要分支。
