调节培养基的pH都是用稀盐酸，请问可以用硫酸吗

热力消毒包括火烧、煮沸、流动蒸气、高热蒸气、干热灭菌等。能使病原体蛋白凝固变性，失去正常代谢机能。

（1）火烧 凡经济价值小的污染物，金属器械和尸体等均可用此法。简便经济、效果稳定。

（2）煮沸 耐煮物品及一般金属器械均用本法，100℃1～2分钟即完成消毒，但芽胞则须较长时间。炭疽杆菌芽胞须煮沸30分钟，破伤风芽胞需3小时，肉毒杆菌芽胞需6小时。金属器械消毒，加1～2%碳酸钠或0.5%软肥皂等碱性剂，可溶解脂肪，增强杀菌力。棉织物加1%肥皂水15l/kg，有消毒去污之功效。物品煮沸消毒时，不可超过容积3/4，应浸于水面下。注意留空隙，以利对流。

（3）流动蒸气消毒　相对湿度80～100%，温度近100℃，利用水蒸气在物何等表面凝聚，放出热能，杀灭病原体。并当蒸气凝聚收缩产生负压时，促进外层热蒸气进入补充，穿至物品深处，加速热量，促进消毒。

（4）高压蒸气灭菌(湿热灭菌） 通常压力为98.066kPa，温度121～126℃，15～20分钟即能彻底杀灭细菌芽胞，适用于耐热、潮物品。

（5）干热灭菌 干热空气传导差，热容量小，穿透力弱，物体受热较慢。需160～170℃，1～2小时才能灭菌。适用于不能带水份的玻璃容器，金属器械等。

化学消毒法

根据对病原体蛋白质作用，分为以下几类。

1．凝固蛋白消毒剂 包括酚类、酸类和醇类。

（1）酚类 主要有酚、来苏、六氯酚等。具有特殊气味，杀菌力有限。可使纺织品变色，橡胶类物品变脆，对皮肤有一定的刺激，故除来苏外应用者较少。

苯酚（石炭酸）（carbolic acid）：无色结晶，有特殊臭味，受潮呈粉红色，但消毒力不减。为细胞原浆毒，对细菌繁殖型1：80～1：110溶液，20℃30分钟可杀死，但不能杀灭芽胞和抵抗力强的病毒。加肥皂可皂化脂肪，溶解蛋白质，促进其渗透，加强消毒效应，但毒性较大，对皮肤有刺激性，具有恶臭，不能用于皮肤消毒。

来苏（煤酚皂液）（lysol）：以47.5%甲酚和钾皂配成。红褐色，易溶于水，有去污作用，杀菌力较石炭酚强2～5倍。常用为2～5%水溶液，可用于喷洒、擦试、浸泡容器及洗手等。细菌繁殖型10～15分钟可杀灭，对芽胞效果较差。

六氯酚（hexochlorophane）：为双酚化合物，微溶于水，易溶于醇、酯、醚，加碱或肥皂可促进溶解，毒性和刺激性较少，但杀菌力较强。主要用于皮肤消毒。以2.5～3%六氯酚肥皂洗手可减少皮肤细菌80～90%，有报告可产生神经损害，故不宜长期使用。

（2）酸类 对细菌繁殖体及芽胞均有杀灭作用。但易损伤物品，故一般不用于居室消毒。5%盐酸可消毒洗涤食具，水果，加15%食盐于2.5%溶液可消毒皮毛及皮革，10l/kg加热30℃浸泡40小时。乳酸常用于空气消毒，100m3空间用10g乳酸熏蒸30分钟，即可杀死葡萄球菌及流感病毒。

（3）醇类 乙醇（酒精）（ethyl alcohol）75%浓度可迅速杀灭细菌繁殖型，对一般病毒作用较慢，对肝炎病毒作用不肯定，对真菌孢子有一定杀灭作用，对芽胞无作用。用于皮肤消毒和体温计浸泡消毒。因不能杀灭芽胞，故不能用于手术器械浸泡消毒。异丙醇(isopropylalcohol)对细菌杀灭能力大于乙醇，经肺吸收可导致麻醉，但对皮肤无损害，可代替乙醇应用。

2．溶解蛋白消毒剂 主要为碱性药物，常用有氢氧化钠、石灰等。

（1）氢氧化钠 白色结晶，易溶于水，杀菌力强，2～4%溶液能杀灭病毒及细菌繁殖型，10%溶液能杀灭结核杆菌，30%溶液能于10分钟杀灭芽胞，因腐蚀性强，故极少使用，仅用于消灭炭疽菌芽胞。

（2）石灰（CaO）遇水可产生高温并溶解蛋白质，杀灭病原体。常用10～20%石灰乳消毒排泄物，用量须2倍于排泄物，搅拌后作用4～5小时。20%石灰乳用于消毒炭疽菌污染场所，每4～6小时喷洒一次，连续2～3次。刷墙2次可杀灭结核芽胞杆菌。因性质不稳定，故应用时应新鲜配制。

3．氧化蛋白类消毒剂 包括含氯消毒剂和过氧化物类消毒剂。因消毒力强，故目前在医疗防疫工作中应用最广。

（1）漂白粉应用最广。主要成分为次氯酸钙[Ca(ClO)2，含有效25～30%，性质不稳定，可为光、热、潮湿及CO2所分解。故应密闭保存于阴暗干燥处，时间不超过1年。有效成份次氯酸可渗入细胞内，氧化细胞酶的硫氢基因，破坏胞浆代谢。酸性环境中杀菌力强而迅速，高浓度能杀死芽胞，粉剂中用于粪、痰、脓液等的消毒。每升加干粉200克，搅拌均匀，放置1～2小叶，尿每升加干粉5克，放置10分钟即可。10～20%乳剂除消毒排泄物和分泌物外，可用以喷洒厕所，污染的车辆等。如存放日久，应测实际有效氯含量，校正配制用量。漂白粉精的粉剂和片剂含有效氯可达60～70%，使用时可按比例减量。

（2）氯胺—T（chloramine T） 为有机氯消毒剂，含有效氯24～26%，性较稳定，密闭保持1年，仅丧失有效氯0.1%。微溶于水（12%），刺激性和腐蚀性较小，作用较次氯酸缓慢。0.2%1小时可杀灭细菌繁殖型，5%2小时可杀灭结核杆菌，杀灭芽胞需10小时以上。各种铵盐可促进其杀菌作用。1～2.5%溶液对肝炎病毒亦有作用。活性液体须用前1～2小时配制，时间过久，杀菌作用降低。

（3）二氯异氰尿酸钠(sod．dichlorisocynurate)又名优氯净，为应用较广的有机氯消毒剂，含氯60～64.5%。具有高效、广谱、稳定、溶解度高、毒性低等优点。水溶液可用于喷洒、浸泡、擦沫，亦可用干粉直接消毒污染物，处理粪便等排泄物，用法同漂白粉。直接喷洒地面，剂量为10～20g/m2。与多聚甲醛干粉混合点燃，气体可用熏蒸消毒，可与92号混凝剂（羟基氯化铝为基础加铁粉、硫酸、双氧水等合成）以1：4混合成为“遇水清”，作饮水消毒用。并可与磺酸钠配制成各种消毒洗涤液，如涤静美，优氯净等。对肝炎病毒有杀灭作用。

此外有氯化磷酸三钠、氯溴二氰尿酸等效用相同。

（4）过氧乙酸(peroxy—acetic acid)亦名过氧醋酸，为无色透明液体，易挥发有刺激性酸味，是一种同效速效消毒剂，易溶于水和乙醇等有机溶剂，具有漂白的腐蚀作用，易挥发的刺激性酸味，是一种高效速效消毒剂，易溶于水和乙醇等有机溶剂，具有漂白和腐蚀作用，性不稳定，遇热、有机物，重金属离子、强大碱等易分解。0.01～0.5%，0.5～10分钟可杀灭细菌繁殖体，1%5分钟可杀灭芽胞，常用浓度为0.5～2%，可通过浸泡、喷洒、擦抹等方法进行消毒，在密闭条件下进行气雾（5%浓度， 2.5ml/m2）和熏蒸(0.75～1.0g/m3)消毒。

（5）过氧化氢3～6%溶液，10分钟可以消毒。10～25%60分钟，可以灭菌，用于不耐热的塑料制品，餐具、服装等消毒。10%过氧化氢气深胶喷雾消毒室内污染表面；180～200ml/m3，30分钟能杀灭细菌繁殖体；400ml/m3，60分钟可杀灭芽胞。

过氧化氢蒸汽(HPV)消毒技术正迅速成为制药、生物技术和医疗卫生行业生物净化方法的选择，对与高压锅相同的生物指示剂-嗜热脂肪芽孢杆菌达到6-log的杀灭率。在试运行或停工期间可采用广泛的消毒产品和服务对设施进行生物净化。 Bioquell采用专利的Clarus双循环技术合并PLC程控将灭菌循环的效果最佳化，当过氧化氢在房间或舱体的表面形成微冷凝时达到生物消毒，这个阶段可以在显微镜下看到一个肉眼不可见的亚微米级的过氧化氢薄层，科学研究证实这个低温、无残留的过程已经在蒸汽发生阶段开始杀灭微生物。微冷凝的形成确保形成了微生物杀灭的最佳条件，当达到凝露点时，减少一个对数级别（1- log）微生物的时间（D值）最短。从灭菌动力学曲线可以看到微生物的数量陡降，伴随着微冷凝的形成，生物指示剂数量曲线从舒缓变得急剧下降。

（6）过锰本钾 1～5%浓度浸泡15分钟，能杀死细菌繁殖体，常用于食具、瓜果消毒。

4．阳离子表面活性剂（ Cationic surfactants）主要有季铵盐类，高浓度凝固蛋白，低浓度抑制细菌代谢。有杀菌浓度，毒性和刺激性小，无漂白及腐蚀作用，无臭、稳定、水溶性好等优点。但杀菌力不强，尤其对芽胞效果不佳，受有机物影响较大，配伍禁忌较多，为其缺点。国内生产有新洁尔灭，消毒宁（度米苍）和消毒净，以消毒宁杀菌力较强，常用浓度0.5～1.0‰，可用于皮肤，金属器械，餐具等消毒。不宜作排泄物及分泌物消毒用。

5．烷基化消毒剂

（1）福尔马林　为34～40%甲醛溶液，有较强大杀菌作用。1～3%溶液可杀死细菌繁殖型，5%溶液90分钟或杀死芽胞，室内熏蒸消毒一般用20ml/m3加等量水，持续10小时，消除芽胞污染，则需80ml/m324小时，适用于皮毛、人造纤维、丝织品等不耐热物品。因其穿透力差，刺激性大，故消毒物品应摊开，房屋须密闭。

（2）戊二醛（glutaraldehyde）作用似甲醛。在酸性溶液中较稳定，但杀菌效果差，在碱性液中能保持2周，但强提高杀菌效果，故通常2%戊醛内加0.3%碳酸氢钠，校正pH值为化合物(杀菌效果增强，可保持稳定性18个月。无腐蚀性，有广谱、速效、高热、低毒等优点，可广泛用于杀细菌，芽胞和病毒消毒。不宜用作皮肤、粘膜消毒。

（3）环氧乙烷(epoxyethane) 低温时为无色液体，沸点10.8℃，故常温下为气体灭菌剂。其作用为通过烷基化，破坏微生物的蛋白质化谢。一般应用是在15℃时0.4～0.7kg/m2，持续12～48小时。温度升高10℃，杀菌力可增强1倍以上，相对湿度30%灭菌效果最佳。具有活性高，穿透力强，不损伤物品，不留残毒等优点，可用于纸张、书籍、布、皮毛、塑料，人造纤维、金属品消毒。因穿透力强，故需在密闭容器中进行消毒。须避开明火以防爆。消毒后通风防止吸入。

菌种保藏主要是根据微生物生理生化特点， 人工

创造条件， 使微生物代谢处于不活泼、 生长繁殖受抑

制的休眠状态， 即采取低温、 干燥、 缺氧 3 个条件， 使

菌种暂时处于休眠状态。 一种好的保藏方法首先应能

长期保持菌种原有的优良性状不变， 同时还需考虑到

方法本身的简便和经济， 以便生产上能推广使用[ 妇 。

2 微生物菌种的保藏方法

2 ． 1 定期移植法

亦称传代培养保藏法， 包括斜面培养、 穿刺培养、

液体培养( 保藏厌氧细菌用) 等。 将菌种接种于适宜的

培养基中， 最适条件下培养， 待生长充分后， 于 4 ～

6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养。 保藏时

间依微生物的种类不同而不同。

此法操作简单， 但保存时间短， 需要经常移种， 易

于变异。只能作为菌种的短期保藏。

2 ． 2 液体石蜡保藏法

亦称矿物油保藏法。选用优质化学纯液体石蜡，

采用以下两种方式进行灭菌：①1 2 1℃湿热灭菌

3 0 m i n ， 置 4 0℃恒温箱中蒸发水分， 经无菌检查后

备用。②1 6 0℃干热灭菌 2 h ， 冷却后， 经无菌检查后

[ 收稿 日期] 2 0 0 9 — 0 3 — 1 3

【 作者简介】 董 昧 ( 1 9 7 8 - ) ， 女， 助工， 从事菌种选育工作。

备用圆。把液体石蜡注入已长好菌的斜面上并高出斜

面顶端 1 c m ， 使菌种与空气隔绝。将试管直立， 置低

温( 4 ～6℃)干燥处或室温下保存。 保藏期间应定期

检查， 如培养基露出液面， 应及时补充无菌的液体石

蜡。 。

此方法简便有效， 保藏时间2 - - ~ i 0年， 可用于丝

状真菌、 酵母、 细菌和放线菌的保藏。 特别对难于冷冻

干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的

担子菌等的保藏更为有效。缺点是必须直立存放， 占

空间大， 不便携带嘲 。某些以石蜡为碳源， 或对液体石

蜡保藏敏感的菌株都不能用此法保藏闯 。

2 ． 3 沙土管保藏法

取 6 0 ~ - - 8 0目河沙， 用吸铁石吸去铁质， 用 1 0 ％ 盐

酸浸泡 2 4 h 后弃盐酸， 用水洗至中性， 将沙子烘干备

用。 取地面下4 0 - - - , 6 0 c m非耕作层贫瘠且粘性较小的

土， 研碎后 1 0 0目过筛并用水洗至中性， 烘干备用。 将

处理后的沙、 土按质量比2： 1 混合。 混匀的沙土分装

入安瓿管或小试管中， 高度为 1 a m左右， 塞好棉塞，

1 2 1℃湿热灭菌 3 0 m i n ， 无菌检验合格后方可使用。

把制备好的菌悬液分装每支沙土管0 ． 5 m L ，放线菌

和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。 塞好棉塞放入

盛有干燥剂的容器中， 用真空泵抽去水分。抽检合格

后封口， 存放于低温( 4 - - ． , 6℃) 干燥处保藏， 每隔半年

验证 1 次。

本法方法简便， 设备简单， 适用于产孢子和有芽

孢的菌种保藏， 可保存两年， 但对营养细胞不适用。 由

于在真空干燥过程中，机械力容易造成孢子的死亡，

因此在保藏放线菌和部分真菌的孢子时最好用干法

接种闯 。

2 。 4 真空冷冻干燥保藏法 第 7期 董 昧： 微生物菌种保藏方法 ． 3 5 -

2 ． 4 ． 1 好氧茵冷冻干燥管的制备

安瓿管用 2 9 6 盐酸浸泡过夜，用 自来水冲洗并用

蒸馏水浸泡至p H中性， 烘干后加入脱脂棉塞， 灭菌备

用。 保护剂可选择血清、 脱脂牛奶和海藻糖等。 将培养

好的茵体或孢子加入保护剂制成菌悬液， 分装于安瓿

管中， 每支 0 ． 2 m L 。然后放入冰箱冷冻 2 h以上， 达

到一 2 0 ～3 5℃左右。再置于冷冻干燥箱内进行冷冻

干燥直至其中水分被抽干， 时间一般为 8 - - - 2 0 h 。将

安瓿管在真空条件下熔封， 低温或常温保藏。

2 ． 4 ． 2 厌氧茵冷冻干燥管的制备

主要程序与需氧茵操作相同， 注意保护剂的选择

和准备，保护剂使用前应在 1 0 0℃的沸水中煮沸

1 5 m i n左右， 脱气后放入冷水中急冷， 除掉保护剂中

的溶解氧。

此法为菌种保藏方法中应用最广泛的， 是国际菌

种保藏机构通常采用的方法之一， 几乎所有的微生物

均可采用此法保藏。适用于菌种长期保存， 一般可保

存数年至十余年翻。方便之处在于因冷冻干燥管无需

低温保藏， 所以运输方便， 但此法所需设备要求高， 操

作复杂， 费用昂贵。

2 ． 5 冷冻保藏法

2 ． 5 ． 1 普通冷冻保藏技术( _ 2 0℃)

将培养好的固体或液体菌种用橡胶塞封口， 置于

普通冰箱中保藏。 这一方法虽操作简单但不适宜长期

保藏。

2 ． 5 ． 2 超低温冷冻保藏技术( - 6 0 ～ - 8 0℃)

将生长至对数生长中后期的微生物细胞， 加入新

鲜培养基使其悬浮，然后加入等体积的2 0 ％ 甘油或

1 0 ％~ - -甲基亚砜作为冷冻保护剂，混匀后分装入冷冻

管或安瓿管中， 于 - 7 0℃超低温冰箱中保藏。若干细

菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏 5 年而活力不

受影响。

2 ． 5 ． 3 液氮超低温保藏法

主要程序与超低温冷冻保藏技术( 一 6 0 ～一 8 0℃)

相同。 需注意分装好的安瓿管在放入液氮前需用控速

冷冻机预冻，冷冻速率以 l℃／ m i n为宜，冷冻到

一

3 5℃。如果无控速冷冻机， 可将安瓿管置于- 7 0℃

冰箱中冷冻4 h ， 然后迅速移入液氮罐中保存。使用

时从液氮罐中取出， 立即放置在 3 8 " ' 4 0℃水浴中使

其溶化， 而后直接将其接种到适宜的培养基中即可。

此法存活率高， 稳定性强， 保藏时间长， 是长期保

藏菌种的最好方法。适用于各种菌种的保藏， 特别适

用于难以用真空干燥保藏等方法保藏的菌种翻。此法

需定期向液氮罐中补充液氮，以保证液氮罐中的温

度。

你要查清楚，你要配的培养基的成分有那些，然后把要用的东西找到。在配制之前你要把装培养基的容器准备好，是用试管、平皿还是三角瓶。之后看要配的是固体培养基还是液体培养基，觉得是否放琼脂或明胶。之后找来一个大烧杯，依次把要放的物质放入，要是配的是固体培养基要把加入琼脂或明胶的培养基放在电炉上加热，待琼脂或明胶完全溶解后趁热迅速分装。之后把分装好的培养基封口，之后选择是干灭还是湿灭，等灭菌之后，配制培养基的工作就完成了。

培养基的配制与灭菌

1目的

1.1了解并掌握培养基的配制、分装方法

1.2掌握各种实验室灭菌方法及技术。

2原理

培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。

琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。

任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。

3材料

3.1器皿及材料

天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱。

3.2药品试剂

蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、琼脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽计、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。

4流程

称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板。

5步骤

5.1培养基的制备

5.1.1称量药品

根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。

5.1.2溶解

用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。

5.1.3调节pH

根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等。

5.1.4溶化琼脂

固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热)。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。

5.1.5过滤分装

先将过滤装置安装好（图3-1）。如果是液体培养基，玻璃漏斗中放一层滤纸，如果是固体或半固体培养基，则需在漏斗中放多层纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤。过滤后立即进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞， 引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。

5.1.6包扎标记

培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。

5.1.7灭菌

上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为121℃20min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面(图3-2)，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。

5.1.8倒平板

将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到45～50℃,立刻倒平板。

5.2灭菌方法

灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。

加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。

5.2.1.高压蒸汽灭菌法

高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经15～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌（图3-4）。

5.2.1.1操作方法和注意事项如下

加水

打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。立式消毒锅最好用已煮开过的水，以便减少水垢在锅内的积存。注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。

装料、加盖

灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。

排气

打开排气口(也叫放气阀)。用电炉加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min，使锅内冷空气完全排净。

升压、保压和降压

当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。当压力上升至所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃，20min）后，停止加热，待压力降至接近“0”时，打开放气阀。注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。

灭菌后的培养基空白培养

灭菌后的培养基放于37℃培养箱中培养，经24h培养无菌生长，可保存备用；斜面培养基取出后，立即摆成斜面后空白培养；半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后，空白培养。

5.2.2干热灭菌法

通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中烘烤，即加热至160～170℃维持1～2h。

干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用此法灭菌。

5.2.2.1灭菌前的准备

玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞，以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染。常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸，用棉绳以活结扎紧，以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；吸管以拉直的曲别针一端放在棉花的中心，轻轻捅入管口，松紧必须适中，管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去，灭菌时将吸管装入金属管筒内进行灭菌，也可用纸条斜着从吸管尖端包起，逐步向上卷，头端的纸卷捏扁并拧几下，再将包好的吸管集中灭菌。

5.2.2.2干燥箱灭菌

将包扎好的物品放入干燥烘箱内，注意不要摆放太密，以免妨碍空气流通；不得使器皿与烘箱的内层底板直接接触。将烘箱的温度升至160～170℃并恒温1～2h，注意勿使温度过高，超过170℃，器皿外包裹的纸张、棉花会被烤焦燃烧。如果是为了烤干玻璃器皿，温度为120℃持续30分钟即可。温度降至60～70℃时方可打开箱门，取出物品，否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂。

用此法灭菌时，绝不能用油、蜡纸包扎物品。

5.2.2.3火焰灭菌

直接用火焰灼烧灭菌，迅速彻底。对于接种环，接种针或其它金属用具，可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。此外，在接种过程中，试管或三角瓶口，也采用通过火焰而达到灭菌的目的。

6结果

6.1记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件（温度、压力等）。

6.2试述高压蒸汽灭菌的过程及注意事项。

7思考

7.1制备培养基的一般程序是什么？

7.2做过本次实验后，你认为在制备培养基时要注意些什么问题？

7.3灭菌在微生物学实验操作中有何重要意义？

4试述高压蒸汽灭菌的操作方法和原理。

5高压蒸汽灭菌时应注意哪些事项？

没有办法写方程式

2加紫色石蕊试液，变红的是稀盐酸，变蓝的是氢氧化钠，没有办法写方程式

3加氯化镁溶液，有白色沉淀的是氢氧化钠，没有变化的是盐酸

mgcl2+2naoh=mg(oh)2+2h2o

4加石灰石，有气泡的是稀盐酸，没有变化的是氢氧化钠

caco3+2hcl=cacl2+h2o+co2

培养基 （Medium）是供微生物、植物组织和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有水、氮源、无机盐（包括微量元素）、碳源、生长因子（维生素、氨基酸、碱基、抗菌素、色素、激素和血清等）等。

不同培养基可根据实际需要，添加一些自身无法合成的化合物，即生长因子。有些微生物，如自养型微生物，不需要碳源，所以上述物质只具有一般性。培养基由于配制的原料不同，使用要求不同，而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此一般 培养基 必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基（如组织培养基），较长时间的贮存，必须放在3-6℃的冰箱内。由于液体培养基不易长期保管，均改制成粉末。

培养基的配制

1.配料

配方换算→在容器中加入少量水（蒸馏水，自然水）→按照配方称取各种药品（依次加入）→加足所需水量（一药一勺，取药后立即盖上瓶盖）。

2.溶解

淀粉溶解：少量冷水调成糊状加热溶解，特别是加有琼脂的培养基，一定要煮沸，琼脂的熔解温度95-97℃ ，且需要边加热边搅拌以防止烧焦。

3.调PH

用1N的盐酸或1N的 NaOH把培养基调节到所要求的值。

4.过滤

滤纸或棉花进行过滤。（有时可以省去）

5.分装

一般 培养基 放在三角瓶或试管中灭菌使用。

(1)三角瓶

若作静置培养，则100ml培养基/250ml的三角瓶，最多不能超过150ml培养基/250ml的三角瓶，否则灭菌时培养基沸腾容易污染棉塞，造成染菌；若作摇瓶培养，则15-20ml培养基/250ml的三角瓶，保证通气良好。

(2)试管分装

液体培养基一般装4-5ml，约试管的1/4高度；固体斜面 培养基 一般装3-4ml，约试管的1/5高度。

6.包扎

分装好后，塞上棉塞，在用牛皮纸将棉塞包裹好，防止灭菌时水份进入把棉塞弄湿。

7.灭菌

按配方上要求的温度、压力进行高压蒸汽灭菌。如果灭菌的温度太高，营养成分会被破坏，培养基中的糖、氨基酸会使 培养基 的颜色变深。

8.摆斜面

灭菌后需要摆斜面的试管要趁热斜着摆放，使其凝固成为一个斜面，约占试管长度的1/2。

9.贮存

培养基 在30℃下放置一天，无污染的即可使用。一般用牛皮纸包裹好存放于2-8℃冰箱中备用。

培养基的灭菌

灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。

加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内 蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。

湿热灭菌有煮沸消毒法和高压蒸汽灭菌法两种，煮沸消毒法是注射器和解剖器械等均可采用此法。先将注射器等用纱布包好，然后放进煮沸消毒器内加水煮沸。对于细菌的营养体煮沸约15～30min，对于芽孢则需煮沸约1～2h。

高压蒸汽灭菌法是高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经15～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。

培养基注意事项

1、确认工作细胞库是否被污染，确认毒种工作种子批是否被污染，确认所用培养基及其添加成分(如小牛血清、NaHCO3等)是否被污染，均可用细菌、真菌及支原体无菌试验来确认并排除。同时要对无菌试验 培养基 的灵敏度进行验证。实际生产中，可以从配制好的培养液中取少量加入营养琼脂于恒温培养箱内培养，48小时即可观察有无污染。

2、其它：高压灭菌设备、过滤除菌设备均应进行验证，确保灭菌和除菌效果前者应在投产前及其后的每6个月进行验证，后者应在每次除菌前、后进行验证工作(至少应在除菌后进行一次)。

3、另外，应将有毒区与无毒区严格分开，并有各自独立的空气净化系统及孵室，有毒区对无毒区应保持相对负压，防止病毒对培养细胞(尤其是细胞库)的污染。

(1)用茎尖作外植体时,可在室内或无菌条件下对 枝条先进行预培养。 枝条水洗净插入无糖的营养液或自来水 抽枝以这种新抽的嫩枝条作为外植体 接种。这样便可大大减少材料的污染。 或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养,待 抽出徒长的黄化枝条时采枝,经灭菌后接种也可明 显减少污染。

(2)选择合适的时间去田间采取外植体 避免阴雨天去田间采取外植体。 在晴天采取外植体时,下午采取的外植体要比早晨采的污染少,因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。

但目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。在菌类长入组织内部时,不但要除去鳞片,甚至要除去韧皮组织,只接种内部的分生组织,以收到一定的防污染效果。

2.外植体的灭菌 (1)多次灭菌法:如咖啡成熟叶片的灭菌即用这种方法。首先除去主脉(因主脉与支脉交界处常有真菌休眠孢子存在),同时去掉叶的顶端、基部和边缘部分,这样可大大减少污染其次,将切好的外植体放入1.3%的次氯酸盐溶液中(商品漂白粉25%的溶液),灭菌30min第3,在无菌蒸馏水中冲洗3次第4,将材料封闭在无菌的培养皿中过夜,保持一定温度第5,次日将叶片用2.6%次氯酸钠灭菌30min,然后,用蒸馏水洗3次。对层积过的种子也可用多次灭菌法,在种子吸胀前后都要灭菌,在层积贮藏的第一周还应增加1次灭菌处理。

(2)多种药液交替浸泡法

对容易污染而难灭菌的材料: 首先取茎尖、芽或器官外植体,用自来水及肥皂充分洗净,表面不可附着污垢、灰尘,用剪刀修剪掉外植体上无用的部分,剥去芽上鳞片第2将材料放入70%—75%医用洒精中灭菌数秒钟第3在1:al B(一种商品灭菌剂名)稀释液中浸5min 第4放入5%—10%次氯酸钠溶液中并滴入“吐温80”数滴,灭菌15—30min,或浸入0.1%—0.2%升汞溶液中并加入“吐温80”数滴,灭菌5—10min第5,用无菌水冲洗5次。也可以在从次氯酸钠溶液中取出后,再放入无菌的0.1mol盐酸(HCl)中浸片刻,再用无菌水冲洗数次。

3.玻璃器皿的灭菌 湿热灭菌法——即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌,灭菌时间可延长达25min—30min。 干热灭菌法——即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。 煮沸灭菌——即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。