苏木精-伊红是染什么的啊

染色质(体)容易被碱性染料染成深色。生物学常见的碱性染料有：龙胆紫、醋酸洋红、苏木精、番红、甲基绿等等。

碱性染料，basic

dye(s)，亦称盐基性染料。在水溶液中能解离生成阳离子色素的染料，故划归为阳离子染料类。

酸、碱性染料的界定并非由染料溶液的pH值决定的，而是根据染料物质中助色基团电离后所带的电荷来决定。一般来说,助色基团带正电荷的染料为碱性染料，反之则为酸性染料。

碱性染料pH不一定大于7，酸性染料pH不一定小于7。使用龙胆紫溶液或醋酸洋红溶液等碱性染料，这些染料是以龙胆紫或洋红溶解于醋酸溶液中制——配制后的龙胆紫溶液pH值约小于7(呈酸性)。

拓展：

染色体（Chromosome

），是细胞内具有遗传性质的物体，易被碱性染料染成深色，所以叫染色体（染色质），其本质为双股螺旋之脱氧核糖核酸，是细胞核内由核蛋白组成、能用碱性染料染色、有结构的线状体，是遗传物质基因的载体，与生物基因有密切关系。染色体的主要化学成份是脱氧核糖核酸和5种称为组蛋白的蛋白质。

可用龙胆紫、醋酸洋红溶液等碱性染料染色。

1、染色体染色剂：

醋酸-洋红染液

醋酸-地衣红染液，龙胆紫染液，甲苯胺蓝染液配置方法。

配方一

醋酸-洋红染液

取45毫升冰醋酸，加蒸馏水55毫升，煮沸后徐徐加入洋红1克，搅拌均匀后加入1颗铁锈钉，煮沸10分钟，冷却后过滤，贮存在棕色瓶内。

配方二

醋酸-地衣红染液

取45毫升醋酸，跟55毫升蒸馏水相混，加热，徐徐加入地衣红粉末1～2克，搅拌溶解后，缓缓煮沸2小时。冷却后过滤，贮存在棕色瓶里。

配方三

龙胆紫染液

取1克龙胆紫，用少量蒸馏水溶解后，加蒸馏水，稀释到100毫升，保存在棕色瓶内。

配方四

甲苯胺蓝染液

取0.5克甲苯胺蓝，溶解在100毫升蒸馏水中，即成0.5%甲苯胺蓝水溶液。

2、观察染色体行为一定要保持细胞的活性，用碱性颜料可以在不影响的情况下观察到染色体。酸性(碱性)染色剂的界定并非由染料溶液的pH值决定的，而是根据染料物质中助色基团电离后所带的电荷来决定。一般来说，助色基团带正电荷的染色剂为碱性染色剂，反之则为酸性染色剂。

性 状： 带有金属光泽的绿色结晶。易溶于水，溶液呈蓝绿色；溶于甲醇、乙醇和戊醇。

孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，又名碱性绿、严基块绿、孔雀绿，其既是杀真菌剂，又是染料，易溶于水，溶液呈蓝绿色；溶于甲醇、乙醇和戊醇。长期以来，渔民都用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。科研结果表明，孔雀石绿在鱼内残留时间太长，且其具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用，鉴于此，许多国家均将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。

常用染料性能简介

（一）天然染料

1

、苏木精

苏木精是从南美的苏木（热带豆科植物）干枝中用乙醚浸制出来的一种色素，是最常用的染料

之一。苏木精不能直接染色，必须暴露在通气的地方，使他变成氧化苏木精（又叫苏木素）后才能使用，

这叫做“成熟”

。苏木精的“成熟”过程需时较长，配置后时间愈久，染色力愈强。被染材料必须经金属盐

作媒剂作用后才有着色力。所以在配制苏木精染剂时都要用媒染剂。常用的媒染剂有硫酸铝按、钾明矾和

铁明矾等。

苏木精是淡黄色到锈紫色的结晶体，易溶于酒精，微溶于水和甘油，是染细胞核的优良材料，他能把细胞

中不同的结构分化出各种不同的颜色。分化时组织所染的颜色因处理的情况而异，用酸性溶液（如盐酸—

酒精）分化后呈红色，水洗后仍恢复青蓝色，用碱性溶液（如氨水）分化后呈蓝色，水洗后呈蓝黑色。

2

、洋红

洋红又叫胭脂红或卡红。一种热带产的雌性胭脂虫干燥后，磨成粉末，提取出虫红，再用明矾处

理，除去其中杂质，就制成洋红。单纯的洋红不能染色，要经酸性或碱性溶液溶解后才能染色。常用的酸

性溶液有冰醋酸或苦味酸，碱性溶液有氨水、硼砂等。

洋红使细胞核的优良染料，染色的标本不易褪色。用作切片或组织块染都适宜，尤其适宜于小型材料的整

体染色。用洋红配成的溶液染色后能保持几年。洋红溶液出现浑浊时要过滤后再用。

（二）人工染料

人工染料，即苯胺染料或煤焦油染料，种类很多，应用极广。它的缺点是经日光照射容易褪色，苯胺蓝、

亮绿、甲基绿等更易褪色。在制片中注意掌握酸碱度，并避免日光直射，也能经几年不褪色。

1

、酸性品红

酸性品红是酸性染料，呈红色粉末状，能容于水，略溶于酒精（

0.3%

）

。他是良好的细胞制染

色剂，在动物制片上应用很广，在植物制片上用来染皮层、髓部等薄壁细胞和纤维素壁。他跟甲基绿同染，

能显示线粒体。

组织切片在染色前先浸在带酸性的水中，可增强它的染色力。酸性品红容易跟碱起作用，所以染色过度，

易在自来水中褪色。

2

、刚果红

刚果红是酸性染料，呈枣红色粉末状，能溶于水喝酒精，遇酸呈蓝色。他能作染料，也用作指

示剂。他在植物制片中常作为苏木精或其他细胞染料的衬垫剂。他用来染细胞质时，能把胶制或纤维素染

成红色。在动物组织制片中用来染神经轴、弹性纤维、胚胎材料等。刚果红可以跟苏木静作二重染色，也

可用作类淀粉染色，由于他能溶于水和酒精，所以洗涤和脱水处理要迅速。

3

、甲基蓝

甲基蓝是弱酸性染料，能溶于水和酒精。甲基蓝在动植物的制片技术方面应用极广。他跟伊红

合用能染神经细胞，也是细菌制片中不可缺少的染料。它的水溶液是原生动物的活体染色剂。甲基蓝极易

氧化，因此用他染色后不能长久保存。

4

、固绿

固绿是酸性染料，能溶于水（溶解度为

4%

）和酒精（溶解度为

9%

）

。固绿是一种染含有浆质的

纤维素细胞组织的染色剂，在染细胞和植物组织上应用极广。他和苏木精、番红并列为植物组织学上三中

最常用的染料。

5

、苏丹Ⅲ

苏丹Ⅲ是弱酸性染料，呈红色粉末状，易溶于脂肪和酒精（溶解度为

0.15%

）

。苏丹Ⅲ是脂肪染

色剂。

6

、

伊红

这类染料种类很多。

常用的伊红

Y

，

是酸性染料，

呈红色带蓝的小结晶或棕色粉末状，

溶于水

（

15

摄氏度是溶解度达

44%

）和酒精（溶于无水酒精的溶解度为

2%

）

。伊红在动物制片中广泛应用，是很好的

细胞质染料，常用作苏木精的衬染剂。

7

、碱性品（复）红

碱性品红是碱性染料，呈暗红色粉末或结晶状，能溶于水（溶解度

1%

）和酒精（溶解

度

8%

）

。碱性品红在生物学制片中用途很广，可用来染色胶原纤维、弹性纤维、嗜复红性颗粒和中枢神经

组织的核质。在生物学制片中用来染维管束植物的木质化壁，又作为原球藻、轮藻的整体染色。在细菌学

制片中，长用来鉴别结核杆菌。在

尔根氏反应中用作组织化学试剂，已核查脱氧核糖核酸。

8

、结晶紫

结晶紫是碱性染料，能溶于水（溶解度

9%

）和酒精（溶解度

8.75%

）

。结晶紫在细胞学、组织

学和细菌学等方面应用极广，是一种优良的染色剂。他是细胞核染色常用的，用来显示染色体的中心体，

并可染淀粉、纤维蛋白、神经胶质等。凡是用番红和苏木精或其他染料染细胞核不能成功时，用它能得到

良好的结果。用番红和结晶紫作染色体的二重染色，染色体染成红色，纺锤丝染成紫色，所以也是一种显

示细胞分裂的优良染色剂。用结晶紫染纤毛，效果也很好。用结晶紫染色的切片，缺点是不易长久保存。

9

、龙胆紫

龙胆紫是混合的碱性染料，主要是结晶紫和甲基紫的混合物。在必要是，龙胆紫能跟结晶紫互

相替用。医药上用的紫药水，主要成分是甲基紫，需要时能代替龙胆紫和结晶紫。

10

、中性红

中性红是弱碱性染料，呈红色粉末状，能溶于水（溶解度

4%

）和酒精（溶解度

1.8%

）

。它的

碱性溶液中呈现黄色，在强碱性溶液中呈蓝色，而在弱酸性溶液中呈红色，所以能用作指示剂。中性红无

毒，

常做活体染色的染料，

用来染原生动物和显示动植物组织中活细胞的内含物等。

陈久的中性红水溶液，

用作显示尼尔体的常用染料。

11

、番红

番红是碱性染料，能溶于水和酒精。番红是细胞学和动植物组织学生常用的染料，能染细胞核、

染色体和植物蛋白质，示维管束植物木质化、木栓化和角质化的组织，还能染孢子囊。

12

、亚甲蓝或美蓝

亚甲蓝或美蓝是碱性染料，呈蓝色粉末状，能溶于水（溶解度

9.5%

）和酒精（溶解度

6%

）

。亚甲蓝是动物学和细胞学染色上十分重要的细胞核染料，其优点是染色不会过深。

13

、甲基绿

甲基绿是碱性染料。它是绿色粉末状，能溶于水（溶解度

8%

）和酒精（溶解度

3%

）

。甲基绿

是最有价值的细胞和染色剂，细胞学上常用来染染色质，跟酸性品红一起可作植物木质部的染色。

4

、检查脂肪的试剂

苏丹Ⅲ（Ⅳ）酒精饱和溶液

取

0.2

克苏丹Ⅲ（或苏丹Ⅳ）

，放入纯酒精中，加热，使它充分溶解，成为饱和酒精溶液，过滤后密闭在试

剂瓶内保存备用。

5

、酸碱指示剂

配方一

酚酞试剂和试纸

酚酞试剂

取

1

克酚酞，溶解在

100

毫升

60%

的酒精溶液里，装在试剂瓶内密闭保存。

酚态试纸

取

1

克酚酞，溶解在

100

毫升

95%

酒精溶液里，加入

00

毫升蒸馏水。把绿纸条放入酚酞溶液中

浸湿后，取出，放在无氨气影响处晾干。

酚泰试剂（试纸）

pH

值变色范围

8.2

～

10

，在酸性和中性溶液中都无色，再碱性溶液中呈深红色。

配方二

红蓝石蕊试纸

取市售石蕊

1

克，放在

80

毫升

10%

酒精溶液中搅拌，使它溶解，然后过滤。把滤液分成两份。

1

份滴入稀

磷酸或稀硫酸，到出现红色为止。另

1

份滴入稀氢氧化钠溶液，到出现蓝色为止。在上述制备的溶液中分

别浸湿滤纸条，随后取出滤纸条，放在蔽光处、无酸碱性气体影响的地方晾干，即的红、蓝两种石蕊试纸。

红石蕊试纸在碱性溶液中变蓝，蓝石蕊试纸在酸性溶液中变红。

6

、检查二氧化碳的试剂

检查二氧化碳的试剂，可用溴代麝香草酚蓝溶液和石灰水。

配方一

溴代麝香草酚蓝溶液

取

0.1

克溴代麝香草酚蓝，溶解在

100

毫升蒸馏水里，滴入少量

0.1%

氢氧化钾溶液，使它成为弱碱性溶液

而呈蓝色。

溴代麝香草酚蓝溶液

pH

值变色范围是

6.0

（黄）～

7.6

（蓝）

。待测物中如果有二氧化碳，会形成碳酸而使

溶液变成黄色。

配方二

石灰水

在蒸馏水中加入生石灰（氧化钙）

，变加边搅拌，直到加入的生石灰不再溶解，呈饱和状态时为止。在石灰

水澄清后，倾出上层清液，用滤纸过滤，放在密闭瓶内保存。

如果测定的物质中有二氧化碳，会生成碳酸钙，使石灰水变浑浊。

7

、检查细胞生活力的试剂

检查细胞有无生活力，

可用中性红甲基蓝试剂。

配制的方法是先分别配制

1%

中性红溶液和

1%

甲基蓝溶液，

这两种溶液各取

1

份混合，用来鉴定细胞的死活。该试剂使活细胞的液泡染上红色，而使死细胞全部染成

蓝色。

（二）分离液

1

、肌细胞分离液

配方一

马克凯郎（

Maccallum

）液

取

1

份浓硝酸、

2

份甘油、

3

份水，混合后就得到马克凯郎液。

把新鲜的肌肉组织小块（横纹肌、心肌和平滑肌）投入这种溶液里浸渍，分离时间需

1

～

3

日。这种溶液尤

其适于分离横纹肌核心肌细胞。

配方二

氢氧化钾溶液

取

35

克氢氧化钾，放在

100

毫升蒸馏水中，加热，使它完全溶解后，在室温下冷却。

把新鲜的肌肉组织块投入氢氧化钾溶液中，浸泡

15

～

30

分钟后，肌细胞便可分离。

2

、上皮细胞分离液

配方一

福尔马林—氯化钾溶液

称取

58.44

克氯化钠，用蒸馏水溶解，再稀释到

1000

毫升，加入

2

毫升福尔马林。

这种溶液是很好的上皮细胞分离液，分离很迅速，而且能保护纤细的上皮细胞纤毛。小肠和气管的上皮组

织小块，放在此溶液里

2

小时即可分离，口腔和皮肤上皮组织小块的细胞分离一般需

3

日左右。

配方二

水和氯醛溶液

称取

5

克水和氯醛，用蒸馏水溶解，再稀释到

100

毫升，就得到

5%

水合氯醛溶液。

从洗净的动物胃、肠和口腔内壁上取下上皮组织一小块，投入以上溶液中，浸泡

24

～

48

小时。

3

、神经细胞分离液

配方一

可以用上皮细胞分离液配方一福尔马林—氯化钠溶液来分离神经细胞（见

2

）

。

配方二

硼酸生理盐水溶液

在生理盐水溶液内加入一些硼酸，搅拌到不再溶解时为止，使成为饱和溶液。

把脊椎灰质和脑皮质部位的神经组织一小块投入这种溶液中分离。

4

、植物茎细胞分离液

杰弗里氏（

Jeffrey

’

s

）液

取等量的

10%

铬酸溶液和

10%

硝酸溶液混合，成铬酸—硝酸溶液。

这种溶液用来分离木本植物茎部的导管、管胞、筛管、伴胞和韧皮纤维等。把材料切成小块放在水里，加

热煮沸，冷却后再加热煮沸。这样重复几次，到材料全部沉于水底后，投入分离液内，分离时间是

24

～

48

小时。

5

、植物根尖细胞分离液

配方一

盐酸—酒精溶液

在

1

份

95%

酒精中慢慢的加入

1

份浓盐酸，即成盐酸—酒精溶液，装瓶密闭保存。

把植物根尖部位截下一小段，投入以上溶液中分离。

配方二

4%

盐酸溶液

配制

4%

盐酸溶液。

截下植物根尖部位，

投入盛有

4%

盐酸溶液的小烧杯内，

在

60

摄氏度温水中隔水温热

1

～

2

分钟，

使根尖软

而不酥，这时分离效果最好。

6

、植物纤维分离液

取

10

克氢氧化钠（或氢氧化钾）

，溶解在

90

毫升水里，制成

10%

氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，放在瓶里

密闭保存。

把植物茎纵切成细条，剪成小段后，投入分离液内。

7

、植物细胞质壁分离液

配方一

30%

蔗糖溶液

取

30

克蔗糖，溶解在

70

毫升蒸馏水里，装瓶备用。

取固绿

0.1

克，溶于

100

毫升

95%

酒精中，即成

0.1%

固绿—酒精溶液。

该液能染色纤维素细胞壁，还用于动植物中作浆质染色剂。

配方二

纤维素细胞壁染液（Ⅱ）

氯化锌

20

克

碘化钾

6.5

克

碘

1.5

克

蒸馏水加至

100

毫升

先把氯化锌溶于少量蒸馏水中，再加入

6.5

克碘化钾，在碘完全溶解后，用蒸馏水稀释到

100

毫升，即成

碘—氯化锌溶液。

该染液能把细胞壁染成紫色，胞质染成淡黄色，胞核染成棕色。

配方一

纤维素细胞壁染液（Ⅲ）

甲液

取

1

克碘和

1.5

克碘化钾，溶于

100

毫升蒸馏水中，即成

1%

碘液。

乙液

取

7

份硫酸和

3

份蒸馏水相混，即成

66.5%

硫酸溶液。

染色时，在材料上滴加甲液，再加一滴乙液，纤维素细胞壁就染成黄色。

配方四

木质化细胞壁染液（Ⅰ）

硫酸化苯胺（或盐酸话本安）

1

份

蒸馏水

70

份

95%

酒精

30

份

硫酸

30

份

将上述各组分相混，将细胞材料放入混合液里染色，可是木质化细胞壁呈鲜黄或姜黄色。

配方五

木质化细胞壁染液（Ⅱ）

取间苯三酚

4

～

5

克，溶于

100

毫升

95%

酒精中，即成间苯三酚—酒精液。

先在材料上滴上

1

滴浓盐酸，然后滴上间苯三酚—酒精液

1

滴，木质化的细胞壁就染上樱红或紫红色。

配方六

木质化细胞壁染液（Ⅲ）

取

1

克番红，溶于

99

毫升蒸馏水中，即成

1%

番红溶液。

4

、细胞质染色剂

配方一

伊红染液

伊红染液一般配用水溶液和酒精溶液两种。

（

1

）取

1

克伊红，溶于

99

毫升蒸馏水中，即成

1%

伊红水溶液（市售红墨水内含伊红成分，可以用红墨水

稀释液来代替本溶液）

。

（

2

）取

1

克伊红，溶于

99

毫升

70%

酒精中，即成

1%

伊红—酒精溶液。

配方二

甲基蓝染液

取

1

克甲基蓝，溶于

29

毫升

70%

酒精中，加入

70

毫升蒸馏水，即成

1%

甲基蓝染液。

配方三

亮绿染液

取

0.5

克亮绿，溶解在

100

毫升蒸馏水中，即成

0.5%

亮绿溶液。

5

、细胞核染色剂

配方一

甲基绿染液

取

1

克甲基绿，溶于

99

毫升蒸馏水中，加入

1

毫升冰醋酸。本染液能染细胞核，还用来染木质化细胞壁。

配方二

龙胆紫染液

取

1

克龙胆紫，溶于少量

2%

醋酸溶液中，加

2%

醋酸溶液，直到溶液不呈深紫色止。

配方三

美蓝（亚甲基蓝）染液

取

0.5

克美蓝，溶于

30

毫升

95%

酒精中，加

100

毫升

0.01%

氢氧化钾溶液，保存在棕色瓶内

。

此溶液能染细胞核，还用来染细菌、血和神经组织等。

配方四

硼砂—洋红染液

取

4

克硼砂，溶于

96

毫升蒸馏水中。再加入

2

克洋红，加热溶解后煮沸

30

分钟，静置

3

日，用

100

毫升

70%

酒精冲淡，放置

24

小时后过滤。

此染液能染细胞核，还用来染糊粉粒和一般动物、植物的整体染色，如水螅、血吸虫等整体标本。

配方五

德氏（

Delafield

’

s

）苏木精染液

甲液

取

1

苏木精，溶于

6

毫升无水酒精中，即成苏木精—酒精溶液。

乙液

取

10

克铵矾溶于

90

毫升蒸馏水中，即成

10%

铵矾水溶液。

取甲液逐滴加入到乙液中，用纸遮盖，放在阳光明亮处，使它充分氧化。

3

～

4

天后将溶液过滤，在滤液中

加入

25

毫升甘油和

25

毫升甲醇，保存在密闭玻璃瓶内。静置

1

～

2

个月，待该液颜色变深时过滤，可长久

保存。

本染液是染色体的优良染色剂，除能染细胞核外，还用来染纤维素、细胞壁和动植物组织。

配方六

席夫（

Schiff

’

s

）试剂

称取

0.5

克碱性品红，加到

100

毫升煮沸的蒸馏水中，再微微加热

5

分钟，不断搅拌，使它溶解。在溶液

冷却到

50

摄氏度时过滤，

滤液中加入

10

毫升

1N

盐酸。

再冷却到

25

摄氏度时加入

0.5

克偏重亚硫酸钠

（

）

或无水亚硫酸氢钠（

）

。把溶液装入棕色试剂瓶内，摇荡后，塞紧瓶塞，放在黑暗中

24

小时。在溶液颜色

退到淡黄色时，加入

0.5

克活性炭，用力摇荡

1

分钟，过滤后把滤液贮在棕色试剂瓶内，塞紧瓶塞，滤液

应该是无色的。

在使用时勿让溶液长时间暴露在空气中和见光

（瓶外用黑纸或暗盒遮光）

。

如溶液变成红色，

即失去染色能力。

碱性品红是较强的核染色剂，在孚尔根氏（

Feulgen

’

s

）反应中作为组织化学试剂，以检查

DNA

。

6

、染色体染色剂

配方一

醋酸—洋红染液

取

45

毫升冰醋酸，加蒸馏水

55

毫升，煮沸后徐徐加入洋红

1

克，搅拌均匀后加入

1

颗铁锈钉，煮沸

10

分

钟，冷却后过滤，贮存在棕色瓶内。

配方二

醋酸—地衣红染液

取

45

毫升醋酸，跟

55

毫升蒸馏水相混，加热，徐徐加入地衣红粉末

1

～

2

克，搅拌溶解后，缓缓煮沸

2

小

时。冷却后过滤，贮存在棕色瓶里。

配方三

龙胆紫染液

取

1

克龙胆紫，用少量蒸馏水溶解后，加蒸馏水，稀释到

100

毫升，保存在棕色瓶内。

配方四

甲苯胺蓝染液

取

0.5

克甲苯胺蓝，溶解在

100

毫升蒸馏水中，即成

0.5%

甲苯胺蓝水溶液。

50%

酒精

85

毫升

福尔马林

10

毫升

冰醋酸

5

毫升

这种固定液适用于固定一般植物茎、叶组织，昆虫和甲壳类动物。液组织在这溶液里固定

12

小时，木质化

组织要固定

1

周，材料也可在此液中长期保存。固定后的材料放在

50%

酒精中冲洗

1

～

2

次。

10

、克来宁堡氏（

Kleinenberg

’

s

）液

配方

在

20%

硫酸水溶液内加入苦味酸，直到饱和。

这种固定液适用于鸡胚的固定，也用于许多小型海洋生物的固定。

11

、包因氏（

Bouin

’

s

）液

配方

苦味酸饱和水溶液

75

毫升

冰醋酸

5

毫升

福尔马林

25

毫升

这是常用的良好固定剂，渗透迅速，固定均匀，组织收缩少，染色后能显示一般的微细结构。一般动物组

织、无脊椎动物的卵和幼虫以及一般组织学、胚胎学的材料，如植物组织的根尖和胚囊都可用它来固定。

一般组织固定

24

～

48

小时，小块组织固定

4

～

16

小时，动物材料能在这种固定液中长期保存。固定后，动

物材料用

70%

酒精冲洗净苦味酸，到无黄色为止（用酒精冲洗时，加几滴氨水，可加快除去黄色）

；植物材

料用

20%

酒精冲洗几次。

12

、绍丁氏（

Schaudinn

’

s

）液

配方

甲液

升汞饱和水溶液

66

毫升

95%

酒精

33

毫升

乙液

冰醋酸

1

毫升

甲、乙液要在临用前混合。

这种固定液适用于固定有鞭毛的原生动物、植物的精子和游动孢子等。

材料如制作涂布装片，

可在

40

摄氏

度下固定

10

～

20

分钟。

13

、眼球固定液

配方

丙酮

40

毫升

冰醋酸

1.5

毫升

升汞

2

克

甲醛

10

毫升

蒸馏水

40

毫升

这种固定液适用于眼球的固定，并可在固定液中长期保存。

14

、纳瓦兴氏（

Nawaschin

’

s

）液

配方

甲液

铬酸

1.5

克

冰醋酸

10

毫升

蒸馏水

90

毫升

乙液

福尔马林

40

毫升

蒸馏水

60

毫升

临用前将等量甲、乙液混合。

高等植物有丝分裂材料适宜在这种固定液里固定或长期保存。

15

、绿色标本保存液

配方一

硫酸铜

5

克

水

95

毫升

这种保存液适用于绿色植物和一切植物绿色部分的保存。植物放入硫酸铜液后，由绿变黄，再由黄变绿。

这时取出材料，用清水漂洗干净，浸在

5%

福尔马林液内长期保存。

配方二

硫酸铜

0.2

克

95%

酒精

50

毫升

福尔马林

10

毫升

冰醋酸

5

毫升

水

35

毫升

先把硫酸铜溶于水中，然后加入配方中的其他组分。绿色标本能长期的贮存在该液中。

配方三

醋酸铜

15

～

30

克

50%

醋酸

100

毫升

在

50%

醋酸中逐渐加入醋酸铜，直到饱和。适用时取原液

1

份，加水

4

份，即成稀释的硫酸铜溶液。

这种保存液适用于表面有蜡质、蛙质、质地较硬的绿色植物保色。加热稀释到醋酸铜溶液，放入植物，轻

轻翻动，到植物由绿转黄再转绿色时取出植物，用清水漂洗后，浸入

5%

福尔马林液内保存。

16

、红色标本保存液

配方一

甲液

硼酸

3

克

福尔马林

4

毫升

水

400

毫升

乙液

亚硫酸

2

毫升

硼酸

10

克

水

488

毫升

把红色的果实浸在甲液里

1

～

3

天，

等果实由红色转深棕色时取出，

移到乙液里保存，同时在果实内注入少

量乙液。

配方二

氯化锌

2

份

福尔马林

1

份

甘油

1

份

水

40

份

先把氯化锌溶解在水里，然后加入配方中其他组分。溶液如果浑浊而有沉淀，应过滤后使用。红色果实能

在此液中保存。

2

、阿拉伯树胶

用阿拉伯树胶作为封藏剂的优点是便于在这种封藏剂中整理标本形态。

阿拉伯树胶作为封藏剂有多种配方，

下述配方适于小型昆虫的整体状片。

配方

阿拉伯树胶

8

克

水合氯醛

20

～

40

克

甘油

5

毫升

冰醋酸

3

毫升（可略）

蒸馏水

10

毫升

配置方法

先把纯净的阿拉伯树胶放在蒸馏水里，加热，待胶溶化后，加入水合氯醛，边加边搅拌，使它充

分溶解后加入甘油和冰醋酸，搅拌均匀后，贮存在瓶里，密闭保存。贮存时要避免灰尘或湿气浸入。

3

、乳酸—石炭酸

这种封藏剂用于整体装片，尤其适用于封藏藻类、菌类、苔藓的原叶体或其他较小材料。

配方

石炭酸

1

份

乳酸

1

份

甘油

1

～

2

份

蒸馏水

1

份

（十一）消毒剂

1

、酒精

70%

的酒精杀菌力最强，它能使蛋白质脱水和变性，在

3

～

5

分钟内杀死细菌。因此，它用于消毒和防腐，

适用于皮肤和器械、塑料制品等的消毒。高浓度的酒精（

95

～

100%

）能引起菌体表层蛋白质凝固，形成保

护层，使酒精分子不易透入，因此杀菌能力反而弱。

2

、碘酒

碘酒是碘和碘化钾的酒精溶液，

2%

的碘酒在

10

分钟内能杀死细菌和芽

孢，可用于皮肤的消毒。药房出售的一般是

2%

的稀碘酒。实验室内也可自配碘酒，配方为：

碘化钾

25.

克

碘

3.5

克

95%

酒精

95%

酒精

蒸馏水

27

毫升

先取碘化钾溶在

2

毫升蒸馏水中，再加入碘，搅拌后加入酒精，到碘充分溶解后，补足蒸馏水，即成碘酒。

3

、高锰酸钾

高锰酸钾是强氧化剂，有很强的杀菌作用。

0.1%

水溶液用作皮肤消毒，

2

～

5%

水溶液能在

24

小时内杀死细

菌芽孢。这溶液在空气中溶液分解，失去氧化能力，要现用现配。

4

、苯酚（石炭酸）

石炭酸是有效的常用杀菌剂，

1%

水溶液能杀死大多数的菌体，

通常用

3

～

5%

水溶液作接种室喷雾消毒或器

皿的消毒，

5%

以上溶液对皮肤有刺激性。在生物制品中，加入

0.5%

石炭酸可作防腐剂。

5

、来苏尔

来苏尔即煤酚皂溶液。它的杀菌效力比石炭酸大

4

倍，通常以

1

～

2%

溶液用于手的消毒（浸泡

2

分钟）和

无菌室内喷雾消毒，

5%

溶液多用于各种器械和器皿的消毒。

6

、新洁尔灭

新洁尔灭是常用的消毒剂，主要用于皮肤、医疗器械、器皿、接种室空气等的消毒灭菌，对许多非芽孢型

病原菌、革兰氏阳性菌和阴性菌经几分钟接触即灭菌，尤其对格兰氏阳性菌杀菌力更大。本品原液的浓度

是

5%

，通常用

0.1

～

0.25%

水溶液。用新洁尔灭消毒金属器械时，要在

1

升溶液中加入

5

克亚硝酸钠，以

防生锈。

7

、福尔马林

福尔马林是常用的杀细菌、

真菌剂。

它的

2

～

5%

水溶液能在

24

小时内杀死细菌芽孢，

常用来消毒器皿和器

具。如果用作无菌室等房屋消毒，取

100

毫升福尔马林，放在盆内，用小火微热，促使蒸发，在

10

小时内

可消菌

3

立方米左右体积房屋的空气。

这些相互作用可以是相互促进的，也可以是彼此抑制的。因此，许多学者认为，研究重金属与营养元素之间的相互作用，不仅有利于解决农作物重金属污染的问题，而且对于正确理解重金属的毒性效应和合理、科学解决营养元素利用和重金属积累之间的矛盾都有重要意义。

1 营养元素与重金属之间的相互作用

重金属与营养元素之间的相互作用是近几年重金属污染生态研究领域的前沿科学问题。土壤中的重金属与阳离子营养元素间多为拮抗作用，而与阴离子营养元素间既可能是协同作用也可能是拮抗作用。

农作物体内重金属与营养元素间的相互作用较为复杂。氮、磷、钾等营养元素在农作物体内蛋白质、核酸等重要物质的合成和代谢过程中起着重要的作用，体内营养元素的缺乏将会导致农作物体内物质代谢的紊乱，从而影响农作物的生长和农产品的产量。

随着农田土壤重金属污染的日益严重，重金属胁迫干扰农作物营养元素的利用已成为农作物营养元素缺乏或生物有效性降低的主要原因。近30 年来，许多研究植物营养和植物生理的学者对植物体内营养元素与重金属之间的相互作用进行了较为广泛的研究，发现外部增加氮、磷、钾等营养元素的供应可改善农作物体内的酶系统和代谢过程，在一定程度上缓解受重金属胁迫的影响。

硒能促进农作物抗氧化物质的形成，增加其对重金属等有害物质的抗逆性，减少对重金属的吸收。SCHÜTZENDUBEL 等发现，硒和镉都可与某些蛋白质中半胱氨酸的巯基发生部分结合，外源硒的供应可使水稻体内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的底物谷胱甘肽含量增加，促进镉与巯基的结合。

硒与镉也可能形成CdSeO3，使镉的溶解性下降，吸收量降低。硒与其他重金属结合也能生成难溶化合物，抑制农作物对重金属的吸收，减少植株体内重金属的累积。硒也可能促使重金属从农作物代谢活跃的细胞点位上移除或通过改变细胞膜对重金属的通透性影响重金属在其体内的转运。

因此，施用硒肥可减少水稻等农作物镉污染的风险。SHANKER 等的盆栽试验发现，硒可以降低萝卜对汞的吸收，原因可能是硒和汞在土壤中形成难溶化合物。

硅能促进农作物生长、改善其抗逆性，显著降低镉和铅在水稻等农作物中的迁移。施入土壤的硅肥中所含的硅酸根离子可与镉发生化学反应，形成不易被植物吸收的硅酸盐而沉淀下来，降低农作物对镉等重金属的吸收。

硅作为水稻的营养元素，可以提高水稻叶片叶绿素含量、提高根系活力、降低细胞膜的透性，从而提高水稻对重金属的抵抗能力。叶面喷施纳米硅制剂可缓解重金属对水稻的毒害作用，且籽实中镉、铅、铜、锌的吸收量在喷施硅制剂后均显著降低。另有研究表明，由于硅与镉发生了沉淀，阻止镉向上迁移，可以显著降低土壤镉的迁移能力，从而可以减少农作物地上部分的镉积累，达到降低稻米中镉含量的目的。

叶面喷施氮、磷、钾等营养元素可降低或消除重金属对农作物的毒害作用，降低农作物体内重金属的吸收和积累。有研究表明，氮肥的施用可以减轻铅和锌等重金属对冬小麦幼苗叶和根的生长抑制作用，并随施氮量的提高而增强。

叶面喷施磷肥可以改善由铅毒害作用引起的农作物缺磷症状，土壤施磷可以降低铅的生物有效性，已在菠菜、胡萝卜、燕麦和黑麦草等农作物中得到了验证。丁凌云等研究表明，叶面喷施KH2PO4能提高水稻产量，降低铅、锌、镉在稻米中的积累。SINGH 等发现，施用钾肥可以明显降低小麦植株中锌的浓度。研究镉在小麦细胞中的迁移途径时发现，细胞壁表面的COO- 易与镉结合而使镉被大量截留在细胞壁上，不进入细胞膜内。

钙、镁、锌等可在农作物体内与重金属竞争吸收和运输位点。研究表明，高浓度的重金属有抑制农作物对钙、镁等营养元素的吸收和转运的能力，如经镉处理的小麦幼苗其茎和叶中富集的镉含量明显增加，而钙、镁等营养元素的含量明显下降；锌浓度的增加可降低农作物体内镁等元素的浓度。

因此，钙、镁等营养元素的充足供应有利于缓解重金属的毒害作用。这是因为农作物中的钙、镁有利于其根系细胞维持正常的渗透系统。

在镉胁迫下，比较添加钙与不添加钙的情况发现，添加钙可使玉米根、叶细胞器和细胞质中钙含量显著增加，而镉含量显著下降；在不添加钙的情况下，镉可导致叶绿体无基粒，或基粒片层排列紊乱，嗜饿颗粒数增加。这是因为钙对镉胁迫下玉米叶片正常结构和功能的保持具有非常重要的作用。

铁可影响农作物的叶绿体功能、协调生理功能、影响重金属吸收和运输，因此通过叶面喷施改善农作物的铁供应可在一定程度上降低镉等重金属在其体内的积累。一般情况下，农作物体内铁含量充足，则锰、铜、锌、镉等重金属含量就低；而铁缺乏则锰、铜、锌、镉等重金属含量就较高，这可能与铁转运子基因的表达有关。

COHEN 等研究了豌豆在铁缺乏和铁充足条件下的镉吸收动力学，结果表明，铁缺乏条件下豌豆对镉的最大初始吸收速率为铁充足条件下的近7 倍。镉在不同铁供应状况下的吸收差异可能与IRT1 基因的表达有关，IRT1 是从拟南芥中克隆的铁转运子基因，铁缺乏能够诱导其表达，促进铁的吸收和转运，同时也会促进镉等重金属的吸收和转运。铁缺乏条件下镉吸收速率的增大也可能与诱导细胞质膜中质子泵的激活有关。FeSO4 作为一种微量元素肥料在镉污染土壤上施用，既能使农作物增产，又可减少镉在农作物体内的积累。

研究表明，稀土元素对重金属胁迫有一定的缓解作用。叶面喷施钕或其配合物，能缓解铅对绿豆、小白菜、菠菜的伤害。在镉胁迫的菜豆、玉米幼苗叶片上喷施镧，可减轻镉对幼苗的伤害程度。叶面施用100 mg/L镧-甘氨酸配合物能减轻镉对小白菜造成的伤害，提高小白菜光合速率、希尔反应活力和硝酸还原酶活性，增加叶绿素及核酸含量，减少丙二醛与镉含量，降低细胞质膜透性。

此外，施用赤霉素、己酸二乙氨基乙醇酯、氨基乙酰丙酸、水杨酸、脯氨酸、甘氨酸、甜菜碱等生理调节物质亦可减轻重金属对农作物的毒害作用。施用细胞分裂素类物质6-苄氨基腺嘌呤可缓解汞对水花生的毒害作用。施用水杨酸、脱落酸能减轻大麦幼苗受镉的毒害作用。喷施萘乙酸可降低镉胁迫下大豆幼苗叶片中丙二醛和脯氨酸含量，可减轻膜脂过氧化作用及蛋白质水解，还可降低过氧化物酶(POD)活性，提高硝酸还原酶活性。

植物具有复杂的机制对元素的吸收、转运和外排进行精密调控以适应外界环境的变化，目前关于植物元素平衡途径及调控网络仍不是很清楚。以往人们的研究往往停留在两种或者少数几种元素，但实际上植物体内元素的平衡是一个十分复杂的过程。有人认为，近几年兴起的离子组学方法可为进一步揭示植物体内的营养元素与重金属之间的相互作用机制提供手段。

目前，虽然人们对农作物体内重金属与营养元素的关系已做了较为广泛的探讨，但总体上对相关机制研究还不深入。研究条件、研究方法及供试农作物的不同，获得的结论不尽相同，甚至相互矛盾。有关重金属与营养元素之间的交互作用更有待深入研究。

2 叶面生理阻控技术的发展现状

利用农作物叶面生理阻隔剂阻控农作物体内重金属积累是近年来中国农田重金属污染防治研究的一个新方向，主要通过在农作物细胞壁上沉淀或螯合重金属以及提高农作物对重金属抗逆性等手段来减少甚至完全阻断重金属向食物链转移。由于这一技术具有成本低、环境友好、操作方便等优势而倍受国内研究者的青睐。从国内现有的相关专利来看，现有的叶面生理阻隔剂大致有以下几类：

(1)硅基(包括有机硅和无机硅)成分的叶面生理阻隔剂，相关专利有103789114A(专利号，下同)、101907029A、103864531A、105075763A、101851133A、101830735A 等。

(2)硒或稀土元素成分的叶面生理阻隔剂，相关专利有103804091A、102356739A、104788156A、104322335A、101597191A、104003815A、103766182A、102964177A 等。

(3)氮、磷、钾及常规微量元素(钙、镁、铁、硼、锰、锌、钼、钛、硫)为主要成分的叶面生理阻隔剂，相关专利有103749223A、103314999A、103314693A、10501039A、101507400A、102653486A、104478556A、104082341A 等。

(4)农作物生理调节物质类叶面生理阻隔剂，相关专利有103392401A、104025921A、102356739A、102550313A、104823738A、101940112A、103980030A、103936495A、102653486A、102653485A、104221796A、104322336A、101940113A、103650817A 等。

目前，中国从事农作物叶面生理阻隔剂产品开发及试验效果研究的机构主要集中在东部和中南部地区，以高校、科研机构为主，也有部分基层农业部门。常用的试验农作物主要有水稻、蔬菜、瓜果等。涉及的重金属以镉为主，铅、砷、汞等也有涉及。

由于欧美国家耕地资源问题相对不是很突出，因此相关专利不多。在美国专利局、欧洲专利局、世界贸易组织的知识产权组织等网站仅检索到的3项相关专利，其中1 项还是中国学者申报的。

从一些初步的试验结果来看，使用叶面生理阻控技术的效果因产地、农作物类别不同而不尽相同。

李芳柏等的试验结果表明，叶面喷施硅肥，水稻增产29.6%，稻米砷下降28.2%(质量分数，下同)，镉下降40.2%。

王世华等的盆栽试验表明，喷施硅肥后，水稻谷物中镉下降17%～53%，铅、锌、铜分别下降26%～41%、29%～34%、45%～53%。

刘杰的试验表明，叶面喷施降镉灵叶面硅肥，水稻谷物增产5%，镉下降40%，抑制了重金属由叶面向籽粒迁移。

崔晓峰等发现，叶面喷施硅肥可促进生菜生长，提高POD 和超氧化物歧化酶(SOD)等活性，生菜地上部分镉和铅分别下降33.5%～40.1%、55.2%～63.3%。

刘传平等的研究表明，叶面喷硅肥后水东芥菜中镉、砷、铅分别下降24.5%、26.4%、22.5%；同时，喷施硅肥和铈肥，镉、砷、铅分别下降42.6%、40.0%、36.8%。

刘吉振等的研究表明，喷施硅后，盆栽辣椒中镉下降13.4%～26.1%。

叶面喷施硒肥对农作物中重金属的下降也有明显的效果。蒋斌研究表明，叶面喷施纳米硒肥和硒+壳聚糖复合肥，水培生菜中镉分别下降19.24%、21.13%。水稻叶面喷施硒肥后，稻米增产16.2%，镉下降8.6%～17.8%。蔬菜和瓜果叶面喷施硒肥后，西红柿和蒜苗中镉均下降24.46%；番茄和黄瓜中镉下降60.6%～75.8%；西瓜中镉下降6.61%～66.13%，铅下降4.55%～83.33%，同时其膜脂过氧化产物丙二醛含量也有所下降；草莓叶片和果实中镉分别下降10.20%～94.65%、18.33%，铅分别下降38.86%～76.80%、77.71% ；柿子中的镉、铅和汞含量显著降低。喷施硒、硅、钼复合肥，小白菜、辣椒中镉均下降1.9%～20.6%。硒和硅的联合喷施，水稻产量可增加43.8%，谷物中砷可下降46%。

叶面喷施稀土元素，能降低玉米、绿豆、小白菜等农作物的镉毒和铅毒症状；生菜地上部分镉和铅分别下降31.7%～45.3%、26.7%～71.4%；番茄中镉下降19.4%～37.0%，黄瓜中镉下降32.0%～49.8%；油菜茎叶中铜、锌、镉、铅和镍分别下降2.91%～7.82%、2.91%～6.99%、7.26%～20.92%、6.32%～15.79%、7.69%～21.31%；水东芥菜中镉、砷、铅分别下降22.9%、26.0%、32.5%。叶面喷施锌，生菜镉下降37.02% ；西红柿镉下降37.01%，对铅无明显的影响；糙米镉下降41.9%。叶面喷施铁，菜心镉、铅、铜分别下降4.3%～35.5%、6.17%～50.30%、8.34%～33.40%；蕃茄果实中镉下降2.8%～8.2%。

3 应用前景

重金属与许多生命必需的营养元素相互影响双方的功能发挥，补充营养元素可减轻农作物中重金属的毒害作用。硅、硒、氮、磷、钾、钙、镁以及一些微量元素是农作物的有益元素，采用叶面喷施作为生理阻隔剂不仅可在一定程度上阻控农作物中重金属的积累，还能促进农作物生长、产量增加、品质改善。由于成本低、操作方便，许多研究者认为，对于中轻度污染土壤，叶面喷施是一种方便有效、不误农事的生理阻隔方法，有着较为广阔的应用前景。

与国外相比，中国对叶面生理阻隔剂探讨的范围较广，生理阻隔剂产品研发与应用研究走在了世界的前列，特别在水稻中重金属控制的应用研究上。但有关叶面生理阻隔剂控制农作物中重金属含量的基础理论研究还不及国外。目前，中国利用农作物叶面生理阻隔剂调控农产品中重金属积累的技术还是不够成熟，大多数产品缺乏广泛的田间试验评估，施用效果不够稳定，施用方法有待提升。由于缺乏统一的、规范化的标准，当前中国叶面生理阻隔剂品种繁多，令使用者无所适从，急需建立规范化的叶面生理阻隔剂标准；同时，由于缺乏规范化的施用技术，使用者由于不规范操作导致达不到应有的施用效果。因此，应重点加强以下方面的研究：

(1) 农田重金属污染高效农作物叶面生理阻隔剂研发。在现有研究的基础上，深入探讨不同农作物叶面生理阻隔剂控制农产品中重金属的效果，从而筛选出高效的农作物叶面生理阻隔剂。

(2) 农作物叶面生理阻隔剂的适用范围研究。在不同地区、不同轮作制度及不同水肥管理情况下，研究叶面生理阻隔剂对农作物重金属的阻隔效果，从而确定其适用范围，探讨环境因素(温度、湿度、光照、土壤肥力)、喷施时间、喷施剂量及浓度、喷施次数等对叶面生理阻隔剂阻隔农作物吸收重金属的影响。

(3) 筛选能提高叶面生理阻隔剂效率的助剂，进行复合型叶面生理阻隔剂的研发。通过叶面生理阻隔剂与表面活性剂、络合剂、植物生长调节剂等配合施用，筛选出低毒且能高效阻隔重金属吸收的配方。在此基础上，进一步通过多种配方的搭配试验，研究复合型叶面生理阻隔剂。

(4) 加强叶面生理阻隔剂的田间示范及施用技术与规范研究。选择较成熟的叶面生理阻隔剂可在多地开展田间示范研究，在实际应用中不断矫正施用技术以提高其效率，最终形成相关技术规程。

概要介绍如下:

一,______ 核酸(DNA和RNA)

(一)__ 化学特性

1.分布: DNA (细胞核内)

RNA(核仁10% 细胞质-核糖体90%)

2. 分子结构:戊糖 + 磷酸 + 碱基

特点:① 大量的磷酸基团→酸性

(嗜碱性的基础)

② 戊糖—被盐酸水解→醛基

(成为Feulgen法显示核酸的基础)

② 戊糖—被盐酸水解→醛基 (成为Feulgen法显示核酸的基础)

③ 可以完全水解或部分水解

④ 可以用RNAase或DNAase消化

[ 对照实验(—)]

_

(一)__ 显示方法

1. 福尔根(Feulgen)反应显示DNA

[ 原理 ] 在60℃温度下,将DNA用1N盐酸水解,DNA双链打开成单链,先释出碱基,然后脱氧核糖释出醛基,该醛基与Schiff氏液形成紫红色沉淀.

[ Schiff试剂显色原理 ]

碱性品红 亚硫酸 → 白亚黄酸

(无色试剂,称为Schiff试剂)

[方法]

固定剂的选择可用一般的组织学固定液,常

用Carnoy固定液.

Carnoy固定液:

纯酒: 氯仿: 冰醋酸 = 6:3:1

(60ml) (30ml) (10ml)

恒冷箱切片机的具体染色步骤如下:

⑴ 切片固定在冰醋酸与纯乙醇(1:3 V/V)

中10分钟.

⑵ 由乙醇降至蒸馏水中.

⑶ 用1N盐酸浸泡.

⑷ 放入预热到60℃的1N盐酸中,留6分钟.

⑸ 放入室温的1N盐酸中.

⑹ 放入Schiff液试剂,保持在暗处,60分钟

⑺ 用新配制的SO2水浸洗3次(脱掉未反应

的Schiff液).

⑻ 蒸馏水浸洗净(必须用蒸馏水→洗净无色品红,

否则,残留试剂→有色品红).

⑼ 脱水透明,封固.

结果:核内DNA染为红紫色.

对照:仅改变第4步为1N盐酸,室温15分钟→(-).

[ 注意事项 ]

⑴ 不用醛类固定剂如Bouin,戊二醛,丙烯醛等.

常用Carnoy液,甲醇等.

⑵ 控制水解时间,不同的固定剂用不同的时间,

如:Carnoy 8分钟Genker 5分钟

Susa 18分钟 ★ 最适条件应自行试验.

⑶ 控制温度,一般1N盐酸60℃

如果5N盐酸18～25度.

⑷ 保证Schiff试剂的纯净度.

⑸ SO2要新配制,除去多余的 Schiff液宜用之.

⑹ 必须对照.

2._ 显示核酸的其它方法

⑴ Kurnick甲绿Methylgreen显示DNA法

⑵ 甲绿派若宁Methy green-Pyronin显示DNA和

RNA法

⑶ 菊花青铬明矾(GC)显示核酸法

⑷ 丫啶橙Acridine Orange显示DNA和RNA法

⑸ 核酸提取法

_一,______ 蛋白质(Protein)

_

(一)蛋白质的分子结构

蛋白质的基本单位是氨基酸,肽键将不同的氨基酸结合在一起,除氨基和羧基之外,还含有其它基团,如:—羟基,硫氢基,二硫基等.依其结构特点可分为:酸性氨基酸 和碱性氨基酸 芳香族氨基酸:苯丙氨基酸,酪氨基酸杂环类氨基酸:组氨基酸,色氨基酸,亚氨基酸,脯氨基酸,羟脯氨基酸.

_

(二)目前应用

1._ 用于蛋白质的一般定性

① 确定是否为蛋白质

② 确定蛋白质的酸碱性

③ 显示蛋白质的特殊基团

2._ 用于蛋白质功能定性和定位

_(三)染色方法

目前,研究蛋白质功能定性和定位时多用酶

组织化学法,配体—受体结合法,免疫组化法以

显示特殊的蛋白质.这里仅介绍一般的染色方法.

1.四氮化联邻茴香胺法

(Tetra-azotized-o-anisidine)

[ 应用 ] 广泛应用于显示酶的活性

[ 原理 ] 芳香伯胺与亚硝酸作用,在低温下(<

5℃)可生成重氮盐,此即重氮反应.重氮盐可

与酚类作用生成有色化合物——偶氮化合物.上

述反应必须在酸性条件下进行.

本实验,联邻茴香胺在酸性,低温条件

下与亚硝酸作用生成四氮盐.四氮盐有两个

重氮盐,其中一个重氮基在碱性条件下与所

要显示的组氨酸,色氨酸及酪氨酸的苯环结

合产生偶联反应,另一个重氮基与酚类或奈

类发生偶联反应以增色.因此,可以用生成

的偶氮染料来代表组织细胞的蛋白质含量.

[ 方法 ]

1._ 四氮盐配制

⑴ 天平称取联邻茴香胺0.25g(有毒,通

风橱内进行).

⑵ 在冰浴下,加入已预冷8%盐酸10ml,

玻璃搅拌,促其溶解,混合后为悬浊液.

⑶ 称NaNO2 0.15g溶于1ml蒸馏水中(冰浴

下).

⑷在冰浴下,将配好的NaNO2溶液分三次倒入邻联茴香胺悬浊液内,每次倒入都须玻棒搅动,因产生NO2可有黄烟冒出,至黄烟停止再倒下一次液体.放入冰箱(4℃)内,约20分钟,待溶液变为黄色.

⑸倾出上清液,勿将沉渣泛起,弃去沉渣.

⑹用NaHCO3细粉(约0.5～0.6g)逐渐加

入上清液内,边加边搅拌(冰浴下).

⑺以刚果红试纸测中和点,待试纸不变蓝即达到中和.收集于标本瓶(或广口瓶)内,置冰箱备用.此液不稳定,置冰箱内可保存两周,若变为橘红色则失效.

_

2._ 偶氮反应

—Carnoy固定的大鼠肝,肠等石蜡切片.

⑴ 切片脱蜡至水.

⑵ 将切片放入下列溶液中(在冰浴中至2～3℃),

浸染10分钟.

用前配制:

四氮化联邻茴香胺溶液 4ml

0.1巴比妥缓冲液 (pH9.2) 20ml

24ml

⑶ 入1N盐酸(冰浴中2～3℃)浸洗10秒,多余盐

酸以滤纸吸干.

⑷ 入H酸饱和液,浸染30分钟(冰浴或冰

箱内).

H酸饱和液配制:H酸 0.4g

0.1M巴比妥缓冲液 20ml

(pH9.2) 过滤后使用!

⑸ 蒸馏水冲洗,脱水,透明,封固(树胶)

[ 结果 ]

酪氨酸,组氨酸,色氨酸染成红棕色(+)

※ 0.1M巴比妥钠50ml配制

① 分析天平称巴比妥钠(MW=206.18)

1.0309g

② 于量瓶内+蒸馏水50ml至刻度即可.

0.1M巴比妥缓冲液,pH9.2(20ml)配

制: 0.1M巴比妥钠 19.1ml

0.1N盐酸 0.9 ml

20 ml

2.其它的显示蛋白质的方法

⑴ 米朗反应(Millon Reastion)→显示酪氨

酸的方法

酪氨酸→羟苯基 亚硝酸 →亚硝基苯+Hg→有色物

注:胶原蛋白不显色,其它蛋白质都显色(+)

⑵二硝基氟苯Dinitro—fluoro—benzene (DNFB)法

DNFB与—NH2,SH和酪氨酸产生弱有色反应,

可被偶氮染料加强.

⑶ 酪氨酸重氮化偶联反应

⑷ 蛋白质硫氢基DDD法(固定时避免

氧化剂)

⑸ 铁—铁氰化钾反应显示SH基

⑹ 高甲酸阿尔辛蓝显示SS基法

⑺ 免疫荧光法显示蛋白质

三,碳水化合物

中性多糖——糖原

碳水化合物 酸性多糖——硫酸软骨素 A,B,

C,肝素,硫酸角

(组织中—多糖类) 质素,透明质酸等

蛋白多糖——粘蛋白,唾酸粘蛋白

糖 脂——脑苷脂类

※ 组织中糖的种类较多,因此,要特异性地显示各种

糖类必须用抑制和酶水解来对照实验.

本章仅以高碘酸雪夫法(PAS法)说明之,其它的

方法还有Alcian blue法,甲苯胺蓝异染性染色法等.

高碘酸雪夫法 Periodic—Schiff(PAS)method

[ 原理 ] 高碘酸为强氧化剂,它可以氧化多糖

分子内1,2—乙二醇(顺式和反式)而

产生醛基,此醛基再与Schiff试剂结合即

产生红 紫色.

[ 方法 ] 改良的McManus(1946),高碘酸雪夫法

标本:

① Carnoy固定的大白鼠肝,肾,肠石蜡切片

② 大白鼠肝横冷箱切片(未固定)

[ 步骤 ]

(1) 切片脱蜡入水(横冷箱切片免)

(2) 入0.5%高碘酸水溶液,室温,2～5分钟

(3) 蒸馏水涮洗

(4) 入Schiff试剂,洗3次,每次2分钟

(5) 入SO2水中,洗3次,每次2分钟

(6) 自来水洗5～10分钟

(7) 蒸馏水稍洗

(8)入Mayer氏苏木精副复染核1分钟

(9) 自来水5分钟,换蒸馏水

(10)脱水,透明,封固

[ 结果 ]

PAS(+)→红紫色或红色核→蓝色

Carnoy固定,糖原原位定位不佳,有

移位现象.

[ 对照 ]

① 用唾液酸淀粉于37℃消化20～30分钟.

② 苯甲酰或乙酰化法作对照(抑制法)

[ 注意事项 ]

①必须按照规定配方配制试剂,按规定的时间 反应.以避免非特异反应.例如:入高碘酸水溶液时间不宜过长,否则非特异着色.

②多糖大多都易溶于水,固定时应避免扩散或移位.

冰冻切片+苦味酸福尔马林→固定→避免扩散或移位.

③注意溶液的pH值:高碘酸液的pH不应超过5.

④注意温度.反应宜在<25℃的室温下进行,否则可氧化醛基为羧酸.

⑤高碘酸溶液的浓度宜控制在0.5%～1%(0.02—0.1M)浓度过高则会发生非特

异反应.

⑥为充分显示多糖中的糖原,可在过碘酸

中加入5%醋酸或纯乙醇固定,但往往有

溶解和扩散.

⑦为阻止胶原纤维和网状纤维阳性反应,

可使用还原液,于使用Schiff液之前.

[ 分析结果 ] PAS反应阳性物质:糖原,中

性粘蛋白,中性唾液性粘蛋白.

四,脂类

[ 组织中的脂类 ]

单纯脂类 脂肪酸

醇的化合物(如:甘油三脂等)

复合脂类 磷脂(卵磷脂,脑磷脂)

脂类 鞘磷脂

糖脂(脑苷脂,神经苷脂)

衍生脂类 胆固醇

肾上腺素

性激素

[ 显示脂类的基本原理 ]

用易溶于脂类的染料,使之溶于所检

的脂质(如脂滴)中,使组织内的脂类着色.

[ 常用方法 ]

苏丹黑B法,油红O法,硫酸尼罗蓝法

[ 基本要求 ]

⑴ 不用石蜡切片.

⑵ 固定剂一般用Formalin保存磷脂较好.

⑶ 方法:

① 物理法:脂溶性染料,不溶于水,属偶

氮染料.常用苏丹Ⅲ,Ⅳ,苏

丹黑 ,油红O等.

② 化学方法:硫酸尼罗蓝显示脂肪酸.

③ 选择性提取法(对照)

实验举例:苏丹黑B法

[ 原理 ]

苏丹黑为偶氮染料,具有脂溶性,可

溶于无水酒精,但不溶于水(常用70%酒

精饱和液).当组织切片入染液时,苏丹

黑B便离开染液而溶于组织内的脂质(如脂

滴中)使组织内脂类着色.

标本:

兔肾上腺和睾丸横冷箱切片,10μm厚,不

固定(或用10%Formalin固定10分钟后水洗).

[ 方法 ]

① 入蒸馏水洗

② 于70%乙醇内涮洗

③ 入苏丹黑B 70%B饱和液,染5～10分钟

④ 于50%酒精内浸洗

⑤ 蒸馏水中洗

⑥ 入Mayer苏木精(复染细胞核)1分钟

⑦ 自来水冲洗5～10分钟

⑧ 入蒸馏水

⑨ 甘油明胶(或Apathy糖胶)封固

[ 结果 ] 细胞内脂滴均呈黑色

葡萄糖会先生成强氧化性的5磷酸核糖，后者经转换后可以参与糖酵解后者是核酸的生物合成。部分糖酵解和糖异生的酶会参与这一过程。反应场所是细胞溶质(Cytosol)。所有的中间产物均为磷酸酯。过程的调控是通过底物和产物浓度的变化实现的。

磷酸戊糖途径的任务

1 产生NADPH(注意：不是NADH！NADPH不参与呼吸链)

2 生成磷酸核糖，为核酸代谢做物质准备

3 分解戊糖

过程

磷酸戊糖途径可以分为氧化和非氧化两个部分。

氧化部分

第一步和糖酵解的第一步相同，在已糖激酶的催化下葡萄糖生成6磷酸葡萄糖。后来在6-磷酸葡萄糖脱氢酶(这也是磷酸戊糖途径的限速酶)(Glucose-6-phosphat-dehydrogenase)，6-磷酸葡糖酸内酯酶(6-Phosphogluconolactonase)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-Phosphogluconatdehydrogenase)的帮助下生成5-磷酸核酮糖。

非氧化部分

其实是一系列的基团转移反应。在5-磷酸核酮糖的基础上可以通过一系列基团转移反应，将核糖转变成6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛而进入糖酵解途径。这需要有酶的帮助，比如转羟乙醛酶可以转移两个碳单位。而转二羟丙酮基酶则可转三个。

调节

虽然6-磷酸葡萄糖脱氢酶是磷酸戊糖途径的限速酶，但是磷酸戊糖途径的调节主要是通过底物和产物浓度的变化实现的。它是一“旁路”。当机体需要NADPH和磷酸核糖的时候，葡萄糖就会流入这一途径。特别是在脂肪酸和固醇合成发生的地方。

磷酸戊糖途径：指机体某些组织以6-磷酸葡萄糖为起始物在6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化下形成6-磷酸葡萄糖进而代谢生成磷酸戊糖为中间代谢物的过程，又称为磷酸己糖旁路。

G6PD是一种存在於人体红血球内，协助葡萄糖进行新陈代谢之酵素，在这代谢过程中会产生一种叫NADPH的物质能以保护红血球免受氧化物质的威胁。 G6PD缺乏时，若身体接触到具氧化性的特定物质或服用了这类药物，红血球就容易被破坏而发生急性溶血反应。其临床表现包括：

(一)新生儿黄疸：近三分之一的新生黄疸症是肇因于G6PD缺乏。黄疸程度若不严重，照光治疗即可，若是出现严重的溶血性黄疸，必要时须给予换血治疗。一般若能及早发现且治疗得当多可在两三天内恢复健康。

(二)急性溶血性贫血：当病患接触到具氧化性物质时，即刻发生溶血反应。症状包括：脸色苍白、全身黄疸、精神不佳、食欲差及解深茶色尿。严重时会导致呼吸窘迫、心脏衰竭，甚至休克及意识昏迷而有生命危险，常需紧急输血以挽救性命。所以当患儿出现以上任一症状时，要尽速送医求诊，并主动告知医护人员患儿有G6PD缺乏症以帮助做更迅速而正确的诊断与治疗。

会造成溶血之氧化性物质，在药品方面包括(1)抗疟疾药物(2)抗感染药物中的磺胺剂(3)某些解热镇痛剂如著名的阿斯匹灵类�某些过去用於控制尿道感染之药物。另外，一些化学品如樟脑丸（臭丸）、龙胆紫（紫药水）及甲基蓝也会造成溶血。食物方面，患儿食用蚕豆及其制品后，常会出现急性溶血性贫血的现象，所以这病又俗称蚕豆症。

遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症是最常见的一种遗传性酶缺乏病。这个病与遗传有关，吃蚕豆不能引起。

G6PD缺乏症（蚕豆病）患者需注意以下方面：

1．禁食蚕豆或蚕豆生加工品，避免在蚕豆开花、结果或收获季节去蚕豆地。

2．禁止使用含萘的臭丸放入衣柜驱虫。

3．禁止使用的药物

乙酰苯胺、美蓝、硝咪唑、呋喃旦叮、呋喃唑酮、呋喃西林、苯肼、伯氨喹啉、扑疟母星、戊胺喹、磺胺、乙酰磺胺、磺胺吡啶、噻唑酮、甲苯胺蓝、 SMZ、TNT等

4．慎用的药物

扑热息痛、非拉西丁、阿斯匹林、氨基比林、安替比林、安坦、维生素 C、维生素K、氯霉素、链霉素、异烟肼、磺胺嘧啶、磺胺胍、磺胺异恶唑、氯喹、秋水仙碱、苯海拉明、左旋多巴、苯妥英钠、普鲁卡因酰胺、乙胺嘧啶、奎尼丁、奎宁、SM、TMP、优降糖等

5．感染性诱因

病毒性肝炎、流感、肺炎、伤寒、腮腺炎等

6．病历注明：本人是G6PD缺乏症患者，请医生针对我的病情合理用药。

7．凡感染后或接触/服用以上食物或药物数小时或数天内，出现发热、腹痛、呕吐、面黄或苍白、尿呈黄褐色或暗红色等症状，属急性溶血反应，应立即到医院急诊科就诊！！

G6PD缺乏症是一种遗传性代谢缺陷，为X伴性不完全显性遗传，男性发病多于女性。由于G6PD缺乏症变异型很多，临床表现差异极大，轻型得可无任何症状，重型者可表现为先天性非球形红细胞溶血性贫血，一般多表现为服用某些药物、蚕豆或在感染后诱发急性溶血，重得可危及生命。建议做好孕前检查，必要时到妇科遗传病科室就诊。