国家标准检测蛋白质含量测定方法

5种方法测定蛋白质含量

一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法

样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

二、双缩脲法（biuret法）

1、实验原理

双缩脲是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

2、试剂与器材

（1）试剂：a、标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。

如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用0.9%nacl配制，酪蛋白用0.05n nach配制。

b、双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜和6.0克酒石酸钾钠，用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% naoh溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

（2）器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。

3、操作方法

（1）标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。

用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。

（2）样品的测定：取2～3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。

三、folin—酚试剂法（lowry法）

1、实验原理

这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。

在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。 folin—酚试剂法最早由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。

对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。

浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。

含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。

进行测定时，加folin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性ph条件下稳定，但上述还原反应只在ph=10的情况下发生，故当folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。

此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。

2、试剂与器材

（1）试剂

a、试剂甲： （a）10克碳酸钠，2克 naoh和0.25克酒石酸钾钠 。溶解于500毫升蒸馏水中。 （b）0.5克硫酸铜溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（a）与1份（b）混合，即为试剂甲。

b、试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠，25克钼酸钠及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂，50毫升蒸馏水及数滴液体溴，

开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准nach滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1n左右。

c、标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%nacl溶液。

（2）器材

a、可见光分光光度计

b、旋涡混合器

c、秒表

d、试管16支

3、操作方法

（1）标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，

然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（folin—酚试剂），同样立即混匀。

这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。

注意：因lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。

全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。

每分钟测一个样品。 进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。

folin—酚试剂法实验表 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白质 0.2 0.4 0.6 （约250mg/ml）

蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4 试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 每管中蛋白质的量（mg） 吸光度值（a700）

（2）样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。

通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。

根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。

注意:由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。

四、改良的简易folin—酚试剂法

1、试剂

（1）试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5n 氯化钠、10%碳酸钠、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。

（2）试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。

（3）标准蛋白质溶液：同基本法。

2、操作步骤 测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。

用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。 改良的快速简易法，可获得与 folin—酚试剂法（即lowry基本法）相接近的结果。

五、考马斯亮兰法（bradford法）

1、实验原理 双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。

1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。

这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值a595，与蛋白质浓度成正比。

2、试剂与器材

（1）试剂：

a、标准蛋白质溶液，用球蛋白或牛血清清蛋白，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。

b、考马斯亮兰g—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰g—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。

（2）器材：

a、可见光分光光度计

b、旋涡混合器

c、试管16支

3、操作方法

（1）标准方法

a、取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。

最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。

b、加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值a595，空白对照为第1号试管，即0.1ml水加5.0mg—250试剂。

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

考马斯亮兰法实验表管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml) 未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 (约1.0mg/ml)

蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝 g－250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋 白质量（mg） 光吸收值 （a595）

c、用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值a595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的a595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.50。

（2）微量法 当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml水，考马斯亮蓝g－250试剂仍加5.0ml，同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.29。

三氯乙酸沉淀蛋白质不可逆。

三氯乙酸在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐，作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团，使之聚集沉淀。

三氯乙酸用作化学试剂、蛋白质沉淀及色谱分析试剂；三磷酸腺苷、细胞色素丙和胎盘脂多糖提取剂和农药除草剂；是杀虫剂毒死蜱的中间体，也是医药中间体；是医药上的除疣剂和收敛剂。

三氯乙酸沉淀蛋白方法：

加1/4体积的 TCA+DOC于蛋白质组分（置1.5-ml聚丙烯微量离心管中），至TCA的终浓度为20%（w/v），震荡混合，冰上解育20~30 min。

微型离心机，室温离心15 min。沉淀物如可见，为粘稠的带黄褐色的胶状物。用一精细的巴氏吸管吸出上清。努力除去尽可能多的上清。如取100ul样品进行沉淀，沉淀物将是可见的。

加3倍体积原样品体积的丙酮（室温），样品在室温下静置约10min，使TCA+DOC溶于丙酮。

室温离心15min，其时，沉淀物的大小和物理特性类似于一点灰尘。约10ug或更多一点的蛋白质即可看见。有时，会得到白色的盐类（如KCl等）沉淀物。

用极精细的巴氏吸管移去上清。沉淀物置冰上干燥10 min(敞开1.5-ml离心管的盖)。干燥的沉淀物可长时间（>1 个月）地保存于-20℃。

一般来说人体必须的17种氨基酸，也较为重视

氨基酸的定性测定

一、氨基酸的一般显色反应

本节介绍三种显色反应：茚三酮法、吲哚醌法和邻苯二甲醛法。前二种是经典的常用显

色法，后一种是近年来发展起来的荧光显色法，具有灵敏度高的特点。

1. 茚三酮法

显色方法有下列数种：

①常用法：将点有样品的层析或电泳完毕的滤纸充分除尽溶剂，用 5g/L 茚三酮无水丙

酮溶液喷雾，充分吹干，置65℃烘箱中约30min（温度不宜过高，避免空气中氨，以免背

景泛红色），氨基酸斑点呈紫红色。

为了使各种氨基酸呈现不同颜色，可用下列方法：

②用 0.4g 茚三酮，10g 酚和90g 正丁醇的混合液显色。

③用 1g/L 茚三酮无水丙酮溶液显色完毕后，再用盐酸蒸汽熏1min。

④用 1g 茚三酮，600mL 无水乙醇，200mL 冰醋酸及80mL2,4,6-三甲基吡啶混合液80

℃染色5～10min。

为了使显色稳定，可用下列方法：

⑤配制含醋酸镉 2g 加蒸馏水200mL 及冰醋酸40mL 的贮存液。将上述贮存液加200mL

丙酮及2g 茚三酮，即为显色液。点有样品的滤纸上浸有此显色液后，放置于盛有一小杯浓

硫酸的密闭玻璃容器中，25℃，18h，或较高温度下适当缩短时间。背景色浅，氨基酸斑点

也比较稳定。

⑥用含 2g/LCoCl2(或CuSO4)的4g/L 茚三酮异丙酮溶液显色时，氨基酸斑点呈红色，也

可在茚三酮显色后喷以含钴、镉或铜等无机离子的异丙醇溶液，斑点自蓝紫色变成红色。

2．吲哚醌法

（1）原理

各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同颜色，因此可借此辩认氨基酸。氨对吲哚醌显色没

有妨碍，但其灵敏度较茚三酮法稍差，显色不稳定，颜色只有在绝对干燥的环境中才能保存。

（2）试剂

①显色剂：1g 吲哚醌溶于100mL 乙醇及10mL 冰醋酸中（若冰醋酸用量减少则灵敏度

稍差）。

②底色褪色剂：在 100mL 200g/L 碳酸钠溶液中加入60g 硅酸钠（Na2SiO3•9H2O）在水

浴（60～70℃）中加热搅拌直至完全溶解，待溶液比较清澈为止。在溶解过程中，有时硅酸

钠会结成凝胶，此时只需继续搅拌即可溶解。配制时若硅酸钠用量多则褪色较快，但背景容

易变黄，硅酸钠用得少（40g），虽裉色较慢，但背景较为洁白。

显色步骤

层析或电泳后滤纸烘干后，仔细喷上或涂上显色剂，用电吹风迅速吹干，待醋酸气味不

太刺鼻时移置100℃烘箱烘5～15min，直至显色为止（温度不要太高，以免引起减色）注

意观察所显出的颜色，然后均匀地涂上底色褪色剂，纸的背景即由黄色变为绛红而后逐渐变

浅，待黄色背景几乎褪尽时，迅速用电吹风吹干，并随时观察颜色的变化。例如苏氨酸在褪

色前为浅红带褐色，褪色后则呈橙黄色或黄色：脯氨酸在褪色前为蓝色，吹干时很快褪成无

色。室温较低时，底色褪色很慢，此时可将褪色剂加温到30～40℃。温度过高也不宜，因

氨基酸斑点的褪色速度也同时加快，应该避免。

其他显色步骤：显色剂为 1g 吲哚醌，1.3g 醋酸锌溶解于70～80mL 热异丙醇中，冷却

后加1mL 吡啶。或者1g 吲哚醌，1.5g 醋酸锌溶解于95mL 热异丙醇中，加3mL 水，冷却

后加1mL 冰醋酸。点有样品的滤纸仔细喷以显色剂后，80～85℃放置10min，背景可用水

迅速浸洗去而不使氨基酸斑点退去

由于吲哚醌试剂配制方法不同，对同一种氨基酸所显颜色往往也有差异。

3．邻苯二甲醛法

邻苯二甲醛法是目前纸上层析、硅胶薄层层析荧光显色氨基酸最灵敏的方法之一，也可

用于氨基酸溶液定量，并推广应用于乙内酰苯硫脲氨基酸、多肽和蛋白质的检出和定量。根

据文献报道，氨基酸纸上层析灵敏度达0.5μmoL，在硅胶薄层层析上为0.05～0.2μmoL。

这里介绍在纸上层析显现氨基酸方法。（荧光胺是另一种常用的荧光试剂，由于荧光胺来源

比较困难，这里未作介绍）

（1）原理

邻苯二甲醛在 2-巯基乙醇存在下，在碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适

的激发光和发射光波长分别为340nm 和455nm。

各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小大致顺序如下：天门冬氨酸，

异亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸，缬氨酸，谷氨酸，苏氨酸，甘氨

酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸和半胱氨酸。

（2）试剂

邻苯二甲醛显色液：取0.1g 邻苯二甲醛，0.1mg 巯基乙醇，1mL 三乙胺，加丙酮+石油

醚（60℃～90℃）（1+1）的混合溶剂至100mL。放置0.5h 后使用。

显色步骤

将含有氨基酸样品的滤纸浸入邻苯二甲醛显色液中 1min，冷风吹干，在温度18℃以下，

湿度50%～90%之间显色0.5h，于紫外灯下观察荧光点。

说明

在滤纸上显现氨基酸时，邻苯二甲醛浓度以 0.1%为宜。显色时必须有一定的湿度，以

便氨基酸溶解，提高分子碰撞机率，并使极性基团解离，促进反应趋于完全。湿度太低，显

不出荧光。温度对显现的荧光延时有显著影响，温度高荧光延时短，温度低荧光延时长。

二、个别氨基酸的显色反应

利用个别氨基酸与某些试剂具有特殊的显色反应定性氨基酸。可应用于纸层析和纸电

泳显色，也可单独应用。方法很多，仅将常用的方法介绍如下：

1．精氨酸的显色——坂口（Sakaguchi）反应

(1)第一种方法

试剂：①5g 尿素溶解于100mL0.1g/Lα-萘酚乙醇中。使用前，每100mL 加约5g KOH。

②0.7mL 溴水溶解于100mL 5%NaOH 中。

显色步骤：在点有样品的滤纸上喷试剂①后，在空气中吹几分种，再喷试剂②。精氨

酸或含精氨酸的多肽显红色。此试剂对含精氨酸的蛋白质也适用。

(2)第二种方法：

试剂：①1g/L 8-羟基喹啉的丙酮溶液。②0.02mL 溴水溶解于100mL 0.5mol/LnaOH 溶

液中。

显色步骤：将点有样品的滤纸烘干后，喷上试剂①，吹干后，再喷试剂②。精氨酸或

其他胍类物质显桔红色。

2．胱氨酸和半胱氨酸的显色

试剂：①1.5g 亚硝基铁氰化钠（Na2Fe(CN)5NO2•5H2O）溶于5mL 2mol/L H2SO 4 溶液

中，加95mL 甲醇。此时会有沉淀产生，可保存一个月以上。使用时在每100mL 上述溶液

中加10mL 28%氨水，过滤除去沉淀，清液仅能保持一天左右。②2g 氰化钠溶于5mL 水中，

然后加95mL 甲醇。此时有沉淀产生，使用时只需摇匀即可。

显色步骤：半胱氨酸的显色：在滤纸上喷以试剂①的清液，5min 后半胱氨酸显红色。

胱氨酸的显色：先将滤纸浸入试剂②，迅速取出，稍等片刻再喷试剂甲的清液，5min 后胱

氨酸显红色。也可以把试剂②配制的浓度增加一倍，在显色前混和，再喷到滤纸上。

3．甘氨酸的显色

试剂；0.1g 邻苯二甲醛溶于100mL 77%乙醇中。

显色步骤：点有样品的滤纸喷上试剂，甘氨酸显墨绿色，在汞灯（365nm）下显巧克力

棕色。吲哚醌显色后，再用此试剂仍有效。以甘氨酸为N 端的小肽也能显色，但其N 端被

保护后，以及其他氨基酸均不显色。

4．脯氨酸的显色

试剂：1g 吲哚醌和1.5g 醋酸锌，1mL 醋酸，5mL 蒸馏水混和，再加入95mL 异丙醇。

新鲜配制。

显色步骤：层析滤纸除尽溶剂，喷上以上试剂，80℃～85℃烘箱内放置30min，脯氨酸

显蓝色，再以30℃温水漂洗除去多余的试剂后，背景为白色或浅黄色。

也可剪下脯氨酸斑点，在试管中加入5mL 水饱和酚，在黑暗中洗脱15min，间歇振摇，

于610nm 测定其吸光度。从已知标准曲线即可求得样品内脯氨酸含量，测定范围5～20μg。

5．丝氨酸和羟赖氨酸的显色

试剂：①0.035mol/L 过碘酸钠（748mgNaIO4 溶于数毫升甲醇中，加2 滴6mol/L 盐酸，

再用甲醇稀释至100mL）。②15g 醋酸铵加0.3mL 冰醋酸，加1mL 乙酰丙酮，用甲醇稀释到

100mL。

显色步骤：点有样品的滤纸吹干，先喷试剂①，近干后再喷试剂②，室温放置 2h，紫

外灯下照射0.5h，丝氨酸和羟赖氨酸呈黄色斑点，在紫外线下都有荧光。

6．羟脯氨酸的显色

试剂：①1g 吲哚醌溶于100mL 乙醇及10mL 冰醋酸。②1g 对二甲胺苯甲醛溶于100mL

的丙酮浓盐酸（9＋1）混合液中。（此试剂不稳定，隔数日后溶液颜色增深发黑，灵敏度降

低，故用时新鲜少量配制。

显色步骤：将待鉴定的溶液点于小方块纸上，干后先点上试剂①，热风吹干。这时纯

羟脯氨酸呈墨绿色，纯脯氨酸呈深蓝色（极灵敏），对其他氨基酸呈程度不同的紫红色（不

太灵敏）；然后再点上试剂②吹干，如溶液中含有羟脯氨酸即转变为玫瑰红色，而其他氨基

酸与吲哚醌所生成的颜色则褪去。

7．色氨酸的显色

(1)第一种方法

试剂：1g 对二甲氨基苯甲醛加90mL 丙酮，10mL 浓盐酸。新鲜配制。

显色步骤：点有样品的滤纸干燥后，喷上以上试剂，在室温下放置几分钟后，色氨酸

显蓝色或紫红色。茚三酮显色后，仍可使用本法。

(2)第二种方法：

试剂：10mL 35%甲醛加10mL25%盐酸，20mL 无水乙醇。

显色步骤：点有样品的滤纸喷上以上试剂后，100℃烘5min，色氨酸在长波长紫外光下

呈现荧光（黄-橙-带绿色）。

8．酪氨酸的显色

试剂：①0.1%α-亚硝基β-萘酚的95%乙醇溶液。②10%硝酸水溶液。

显色步骤：点有样品的滤纸喷上试剂①后，吹干，再喷试剂②，然后在100℃烘3min，

酪氨酸或含酪氨酸的多肽在浅灰绿色的背景上显红色，0.5h 后转变为桔红色，其后渐退去。

灵敏度1～2μg 酪氨酸。茚三酮显色后，再用此试剂处理，仍能显色，茚三酮所显出的紫红

色斑点变成红色。

9．酪氨酸和组氨酸的显色——pauly 反应

试剂：①4.5g 对氨基苯磺酸与45mL 12mol/L 盐酸共热溶解，以蒸馏水稀释至500mL。

用时取出30mL，在0℃与等体积的5%亚硝酸钠水溶液相混合。（室温放置太长会失效）

②10%碳酸钠水溶液。

显色步骤：点有样品的滤纸上喷试剂①，片刻后再喷试剂②。组氨酸及含组氨酸的多

肽显桔红色；酪氨酸及含酪氨酸的多肽显浅红色。

第六节 氨基酸定量测定

一、氨基酸的一般定量测定

（一）甲醛滴定法

1．原理

氨基酸具有酸性的-COOH 基和碱性的-NH2 基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内

盐。当加入甲醛溶液时，-NH2 基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用标准强碱

溶液来滴定-COOH 基，并用间接的方法测定氨基酸总量。反应式（有三种不同的推论）如

下：

2．方法特点及应用

此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用此

法测定发酵液中氨基氮含量的变化，来了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此

作为控制发酵生产的指标之一。脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪

氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反

应，往往使结果偏高。

3．操作方法

吸取含氨基酸约 20mg 的样品溶液于100mL 容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20.0mL

置于200mL 烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定至

酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液mL 数，供计算总酸含量。

加入10.0mL 甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消

耗氢氧化钠标准溶液毫升数。

同时取 80mL 蒸馏水置于另一200mL 洁净烧瓶中，先用氢氧化钠标准溶液调至pH8．2，

（此时不计碱消耗量），再加入10.0mL 中性甲醛溶液，用0.05mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定

至pH9.2，作为试剂空白试验。

4．结果计算

氨基酸态氮质量分数（%）=

式中：V1——样品稀释液在加入甲醛后滴定至终点（pH9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液

的体积，mL；

V2——空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，mL；

c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；

m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g；

0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmoL。

5．说明

①本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定。②浑浊和色深样液可不经处

理而直接测定。

(二)茚三酮比色法

1．原理

氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），

可用吸光光度法测定。

该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为 570nm，故据此

可以测定样品中氨基酸含量。

2．操作方法

(1)标准曲线绘制

准确吸取 200μg /mL 的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（相当于

0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加

水补充至容积为4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH 为8.04）各

1mL，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置15min

后，在570nm 波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克

数为横坐标，吸光度A 为纵坐标，绘制标准曲线。

(2)样品测定

吸取澄清的样品溶液 1～4mL，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A 值，

用测得的A 值在标准曲线上可查得对应的氨基酸微克数。

3．结果计算

氨基酸含量（mg/100g）=

式中：c——从标准曲线上查得的氨基酸的质量数，μg；

m——测定的样品溶液相当于样品的质量，g。

4．说明及注意事项

①通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎样品 5～10g 或吸取样液样品5～10mL，

置于烧杯中，加入50mL 蒸馏水和5g 左右活性炭，加热煮沸，过滤，用30～40mL 热水洗

涤活性炭，收集滤液于100mL 容量瓶中，加水至标线，摇匀备测。

②茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行

纯化，具体操作可参阅黄伟坤等编著《食品检验与分析》。

(三)非水溶液滴定法

1．原理

氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的标准溶液滴定其含量。根据酸

碱的质子学说：一切能给出质子的物质为酸，能接受质子的物质为碱；弱碱在酸性溶剂中碱

性显得更强，而弱酸在碱性溶剂中酸性显得更强，因此本来在水溶液中不能滴定的弱碱或弱

酸，如果选择适当的溶剂使其强度增加，则可以顺利地滴定。氨基酸有氨基和羧基，在水中

呈现中性，而在冰醋酸中就能接受质子显示出碱性，因此可以用高氯酸等强酸进行滴定。

本法适合于氨基酸成品的含量测定。允许测定的范围是几十毫克的氨基酸

2．测定

(1)直接法（适用于能溶解于冰醋酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样品50mg 左右，溶解

于20mL 冰醋酸中，加2 滴甲基紫指示剂，用0.100mol/L 高氯酸标准液滴定（用10mL 体积

的微量滴定管），终点为紫色刚消失，呈现蓝色。空白管为不含氨基酸的冰醋酸液，滴定至

同样终点颜色。

(2)回滴法（适用于不易溶解于冰醋酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样

品30～40mg 左右，溶解于5mL0.1mol/L 高氯酸标准溶液中，加2 滴甲基紫指示剂，剩余的

酸以醋酸钠溶液滴定，颜色变化由黄，经过绿、蓝至初次出现不褪的紫色为终点。

3．说明

(1)能溶解于冰醋酸的氨基酸，可以用直接法测定的有：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、组

氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸。不易溶解于冰

醋酸，但能溶解于高氯酸可以回滴法测定的有：赖氨酸、丝氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。

(2)谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以将样品溶解于2mL 甲酸中，再

加20mL 冰醋酸，直接用标准的高氯酸溶液滴定。

(四)邻苯二甲醛法(OPT 法)

1．原理

邻苯二甲醛在 2-巯基乙醇存在下，于碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适

的激发光和发射光波长分别为340 和455nm。可能产物为：

各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小大致顺序如下：天门冬氨酸，

异亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸，缬氨酸，谷氨酸，苏氨酸，甘氨

酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸，和半胱氨酸。

本法可用于测定游离氨基酸的含量。灵敏度较茚三酮法约高 100 倍以上，可测到0.1～

1×10－4mol 氨基酸。如用于血清中α-氨基氮的测定，每次血清用量只需5～10μL。与另一

种荧光试剂（萤光胺）一样，空白无荧光，只有与氨基酸结合才产生荧光。缺点是与脯氨酸

不产生荧光，邻苯二甲醛与半胱氨酸荧光值太低。荧光胺已有用于氨基酸自动分析定量分析，

但由于试剂昂贵及个别氨基酸反应不满意，目前还未普遍应用。

(五)三硝基苯磺酸法

三硝基苯磺酸（TNBS）是定量测定氨基酸的重要试剂之一。TNBS 在偏碱性的条件下

与氨基酸反应，先形成中间络合物，如下式所示：

中间络合物在光谱上有二个吸收值相近的高峰，分别位于355nm 和420nm 附近。然

而溶液一旦酸化，中间络合物转化成三硝基苯-氨基酸（TNP-氨基酸），420nm 处的吸收值

显著下降，而350nm 附近的吸收峰则移至340nm 处。

利用 TNBS 与氨基酸反应的这一特性，可在420nm 处（偏碱性溶液中）或在340nm

（偏酸性溶液中）对氨基酸进行定量测定。下表列出各种氨基酸与TNBS 反应后在不同条

件下测定的吸光度。在340nm 处，各氨基酸的吸收度大致相近，而在420nm 处的吸光度

因氨基酸种类而异；在加入适量SO3

2－时，吸收值升高。

本法允许的测定范围是 0.05～0.4μmol 氨基酸。

表 10-3 各种氨基酸与TNBS 反应后在不同条件下测定的吸光度

氨基酸种类 碱性溶液① 酸性溶液加 SO3

①取不同含量氨基酸液1mL，加4%NaHCO3 1mL，0.1%TNBS 1mL，于40℃反应2h，用水补充至4mL，

在420nm 处测定。制作氨基酸浓度—吸光度坐标图，从曲线中求得各氨基酸于1μmol 时的吸光度。

②条件同上，但在与TNBS 反应时加0.01mol/L Na2SO3 1mL，最后总体积也是4mL，同样在420nm 处

测定。

③条件同①，但与 TNBS 反应后加1mol/L HCl 1mL 酸化，在340nm 处测定。

(六)乙酰丙酮和甲醛荧光法

1．原理

氨基酸与乙酰丙酮和甲醛反应，生成 N-取代基2,6-二甲基-3,5-二乙酰基1,4-二氢吡啶，

产生黄-绿色荧光，可用荧光分析法检测。主要反应如下：

乙酰丙酮 甲醛 氨基酸 荧光物质

2．试剂

混合试剂：取1mol/L 乙酸钠溶液10mL，加入乙酰丙酮溶液0.4mL 和30%甲醛溶液1mL，

用水稀释至30mL。

3．测定

取氨基酸液 1mL，加入混合试剂1mL，用棉花塞满试管口，避光于100℃下加热10min，

冷却，加水2mL，然后测定荧光值。

表 10-4 各种氨基酸的发射波长和检测范围

化合物（激发波长405nm） 发射波长（nm） 检测范围（mg/L）

甘氨酸 485 2～10

苯丙氨酸 490 8～40

丝氨酸 485 5～25

半胱氨酸（盐酸盐） 500 20～100

谷氨酸 485 20～100

与标准相比较求出样品中的氨基酸含量。

二、个别氨基酸的定量测定

（一）赖氨酸的测定

1．原理

用铜离子阻碍游离氨基酸的α-氨基,使赖氨酸的ε-氨基可以自由地与1-氟-2,4 二硝基

苯(FDNB)反应,生成ε-DNP-赖氨酸。经酸化和用二乙基醚提取,在波长390nm 处有吸收峰,

从而求出样品中游离赖氨酸的含量.

2．试剂

(1)氯化铜液：称28.0g 无水氯化铜，用水稀释至1000mL。

(2)磷酸三钠溶液：称68.5g 无水磷酸钠,用水稀释至1000mL。

(3)硼酸盐缓冲液（pH9.1～9.2）：称54.64g 带有10 结晶水的四硼酸钠，用水稀释至

1000mL 。

(4)磷酸铜悬浮液：搅拌情况下，把氯化铜液200mL，缓慢倒入400 mL 的磷酸三钠溶液

中，把悬浮液以2000r/min 速度离心5min ，用硼酸盐缓冲液再悬浮沉淀物，洗涤离心3 次，

把最后的沉淀物悬浮在硼酸盐缓冲液中，并用缓冲液稀释至1L。

(5)1-氟-2，4 二硝基苯(FDNB)溶液：吸取FDNB10mL 用甲醇稀释至100mL。

(6)赖氨酸-HCl 标准溶液：称取一定量赖氨酸-HCl，用水配成200mg/L 的工作标准液。

(7)100g/L 丙氨酸溶液。

3．测定

(1)称取通过40 目筛的均匀试样1.00g，置于100mL 烧瓶中。另吸取赖氨酸-HCl 标准工

作液5mL（相当1mg 赖氨酸-HCl），连同试剂空白同时进行试验。

(2)向各烧瓶中加入25mL 磷酸铜悬浮液，然后再加10%丙氨酸1.0mL,振摇15min。吸

取10%FDNB 溶液0.5mL.置于各处理烧瓶中,将烧瓶置沸水中加热15min。

(3)取出烧瓶,立即加入1mol/LHCl 溶液25mL,并不断摇动使之酸化和分散均匀。

(4)烧瓶中的溶液冷却至室温,用水稀释至100mL.取约40mL 悬浮液进行离心。

(5)用25mL 二乙基醚提取上清液3 次，除去醚。并将溶液收集于有刻度试管中,于65℃

水浴中加热15min，以除去残留的醚。并记录溶液的毫升数。

(6)吸取上述各处理液10mL，分别与95%乙醇溶液10mL 混合，用滤纸过滤。

(7)用试剂空白液凋零，测定样液A390nm，与赖氨酸-HCl 标准液对照，求出样品中赖氨

酸-HCl 的含量。

本法在 0～40mg/L 赖氨酸溶液范围内呈良好线性关系。

4．说明

(1)添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸，增加总氨基酸的浓度，有助于赖氨酸-HCl 浓度

具有良好的线性关系。

(2)用醚提取酸性溶液，可将所有中性或酸性的DNP-氨基酸衍生物除去，并把FDWB

的产物破坏，否则这些产物在390nm 处存在干扰。

（二）色氨酸的测定

1.原理

样品中的蛋白质经碱水解后，游离的色氨酸与甲醛和含铁离子的三氯乙酸溶液作用，生

成哈尔满化合物（norharman），具有特征荧光值，可以进行定量测定。

2．试剂

(1)0.3mmol/L 三氯化铁-三氯乙酸溶液：称取三氯化铁(FeCl3•6H2O)41mg，加入10%三

氯乙酸溶液溶解并定溶至500mL。

(2)2%甲醛：量取甲醛溶液(36%～38%)5.5mL，加水至100mL。

(3)色氨酸标准溶液：称取10mg 色氨酸，用0.1mol/LNaOH 溶液溶解并定容至100mL,

置棕色瓶中备用,使用时用水稀释成1mg/L 的标准溶液.

3．测定

称取样品粉末 100～200mg 于离心管中，加入4mL 乙醚,摇匀后过夜，以3000r/min 速

度离心。将乙醚提取液移入试管内,并用乙醚洗涤残渣3 次，收集乙醚液于试管中，于40℃

水浴除去醚。残留物中加入6.25mol/L N aOH 4mL，火焰封口，于110℃水解16～24h。水

解液用4mol/L HCl 溶液调节至pH6～8 后,用水定容至50mL,过滤备用。

吸取滤液 0.2mL，加入2%甲醛0.2mL 和0.3mmol/L 三氯化铁-三氯乙酸混合液2mL，

摇匀后于100℃水浴中加热1h，取出，冷却后用水定容至10mL。在激发波长为365nm，发

射波长449nm 条件下，测定样品的荧光强度，与色氨酸标样作对照，求出样品中色氨酸含

量。

本法在 0～10mg/L 色氨酸溶液范围内呈良好线性关系。

三氯乙酸是一种有机酸，使多糖提取液中的蛋白质与有机酸作用而变性沉淀。 该法是 在多糖水提液中滴加 5 %～10 %与多糖水提取液等体积的三氯乙酸，混匀静置过夜，离心除 去胶状沉淀，重复以上的操作直至溶液不再继续混浊为止，得无蛋白质的多糖。 三氯乙酸浓度越大，除蛋白质效果越好，但对多糖的影响也越大，可能是三氯乙酸对多糖结构具有破坏作用，使多糖降解，而且这种破坏作用随着三氯乙酸浓度增大而增强。 植物多糖常采用三氯乙酸法除蛋白质，也可先用蛋白水解酶，使样品中的蛋白质部分降解后再用 Sevag 法效果更好；微生物多糖去除蛋白常采用 Sevag 法、三氟三氯乙烷法；也可用盐析法、有机溶剂萃取等方法除蛋白。

三氯乙酸的作用楼上两位已经说得很明白了，我来具体说说它在本实验中作用吧。

土壤中产蛋白酶的微生物，在生长过程中会向细胞外分泌蛋白酶，加入三氯乙酸后，这些细胞外的蛋白酶变性沉淀出絮状物，据此判断该微生物可能是产蛋白酶的。

比如你在液体培养基里养了某菌，然后离心把菌沉淀出来，如果培养基里有足够浓度的细菌分泌出来的蛋白酶，加入10%左右的三氯乙酸后就可以看见絮状沉淀。不过这些沉淀也不一定是蛋白酶，可能只是一般的蛋白质。

呵呵，也许有别的作用，暂时想到这样子。

取四支试管，四种溶液各取少许，先加入碘试剂，变蓝着为淀粉；然后将变蓝的淀粉溶液滴入其他三支试管，蓝色消失的为淀粉酶溶液；取两只试管，取剩下的两种溶液，加三氯乙酸，沉淀的为蛋白质溶液，剩下的为水。

有以下两种方法配制：

1、直接称取10gTCA，溶解至100ml水中即可。

2、在装有500gTCA的试剂瓶中加入100ml水，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解，即成100％三氯乙酸（TCA），再稀释到溶液体积的十倍即可。

扩展资料：

三氯乙酸的主要用途

用于有机合成和制医药、化学试剂、杀虫剂。

三氯乙酸在羊毛活性染料染色中的作用：

三氯乙酸加入到羊毛活性染料染色体对其上染百分率有较大提高，上染百分率达到95%以上，活性红B-3BF、活性红KN-5B、活性红KE-3B、活性红K-2BP的染色温度在90℃以上的染色效果更好。

随着时间的延长，普通活性染料染色羊毛效果不断提高，但染色保温时间不宜超过60min。

三氯乙酸作为羊毛染色助剂的最佳工艺为：在90℃条件下，三氯乙酸质量浓度2

g/L，染料用量2%(owf)，保温60

min条件下染色，染色后未经皂洗的羊毛其耐皂洗牢度不佳，在后处理工艺方面需要更进一步的改进。

参考资料来源：百度百科-三氯乙酸