苯酚怎么裂解细胞

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS（十二烷基磺酸钠）将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA 的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。

DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。

离心后有机溶剂在试管底层（有机相），DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚–氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在NaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

获取一个基因CDS序列的方法如下：

打开NCBI（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov ），如下图，按照顺序，在1处选择Nucleotide，在2处输入“PDCD1”，点击3处的Search，等出来结果之后点击4处的“Homo Sapiens”进行进一步筛选（如果你要做鼠源的就选Mus musculus，其他种属选择相应的名称即可进一步筛选了）

然后第一条就是我们需要的序列信息，点击进去，往下拉，直到看到CDS（如下图）

点击CDS，就出现了下图中所示内容，其中加了底色的部分序列便是我们需要的序列了，可以看到这段序列开头是ATG起始密码子，最后三位是TGA终止密码子。选中这段序列复制即可。

由于需要PCR整个CDS区域，所以正反向引物并没有多少选择的余地，甚至可以参照上述原则简单粗暴的从正反向各选择22个碱基左右作为引物，例如：!

正向引物序列与CDS相同，反向引物序列与CDS互补。另外要注意的是写引物等序列都是要5’到3’的方向，一般不会从3’到5’，所以我们的CDS虽然没有注明方向，但是其实也是5’到3’。

虽然可以这么简单粗暴的设计引物，但是还是想借此教大家使用一下引物设计的经典软件Primer Premier 5。

Primer 5的使用

如下图，首先点击File->New->DNA Sequence，

然后点击空白处Ctrl+V粘贴我们的CDS序列，选择As is，即我们复制的是什么样的序列就粘贴的什么样的序列。

下面的依次是“反向序列粘贴”、“互补序列粘贴”“反向互补序列粘贴”。

点击左上角的Primer，如下图，S=Sense，A=Antisense

如果对现在的引物不满意，还可以点击Edit Primers编辑序列，如下图，我们删除掉末尾三个碱基，之后需要先点击Analyse，然后才能点击OK，我们可以看到正向引物已经从25个碱基变为22个碱基了。

最后点击Edit->Copy->Sense Primer，粘贴到Word中即可得到正向引物，反向引物Copy之后粘贴也会自动变为5’到3’的序列。所以非常方便。

这样我们PDCD1用于PCR的正反向引物就初步设计好了。如果你只是想P出PDCD1这个基因，现在的引物就可以送去合成了，但是如果你想将其构建到载体上，那么我们还要对其进行进一步的加工。

Primer 5的使用

根据不同的目的，可以选择不同的载体，如过表达（pcDNA 3.0）、敲减（pLKO.1-TRC）、原核纯化（pGEX-4T1、pET-28a）、病毒包装（pMSCV-puro）、敲除（lentiCRISPR v2）等。下面我们就以过表达载体pcDNA 3.0为例进行讲解。

从质粒图谱上可以看到多克隆位点有多个酶切位点可以选择，那是不是每个位点都可以用呢？当然不是！我们要 选择那些PDCD1（或其他目的基因）本身没有的酶切位点！

所以我们还需要用Primer 5来分析一下哪些是PDCD1所没有的。

还是打开Primer 5，然后粘贴CDS序列，点击Enzyme，2为所有的酶，我们比对质粒图谱选择多克隆位点的酶，双击即可到3的框中，选好之后点击OK，可以看到PDCD1中有ApaI和KpnI两个酶切位点，所以这两个不可以选，其他的都可以选。

不过一般选择常用好用的最好是实验室就有现成的那些酶了。比如我们选择EcoRI和XhoI，那么我们就可以在对引物加上相应的酶切位点了。

于是我们得到如下引物：

好了，我们现在就可以将这些引物送去相应公司合成了。

质粒构建

终于到正题了！

待引物合成之后，我们用ddH2O将其稀释到 100 μM 作为母液，取一些稀释到 10 μM 做下一步实验了。

首先我们P出目的基因，这一步建议用高保真PCR酶，我常用的是 Toyobo公司的KOD-PLUS-Neo酶 。反应体系及反应条件如下图：

模板的获取

PCR完成之后跑1%的胶回收目的片段，也可以直接用PCR Clean试剂盒回收。回收之后将其双酶切，同时需要酶切适量载体。如果你使用的是Fermentas (Thermo)的酶，还可以打开网址 http://t.cn/RVuwBVo 查询双酶切所用的最佳Buffer。

酶切回收之后的片段进行连接，我使用的是 Thermo公司的T4连接酶 ，体系如下：

现在的T4连接酶基本都是快酶，比如Thermo的这款声称10 min就可以连接完成，不过我保险起见，一般连接30 min， 切勿连接过夜！

连接完成之后便是转化，挑菌（单克隆），摇菌抽提质粒，送去测序就OK了！

TRIzol法抽提RNA

提取RNA比较成熟的方法便是TRIzol法抽提，Invitrogen的TRIzol是比较稳定且广泛应用的，当然现在一些国产的TRIzol类产品也能满足大部分情况下的RNA抽提。

ABOUT TRIzol

注意事项及原理

注意事项：

1、RNA酶（RNase）非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后又会迅速复性。用常规的高温高压蒸汽灭菌法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。RNase的又一污染源是取液器，一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部。提取RNA时使用专门的RNase-free的枪头和离心管。

2、TRIzol试剂具有较强毒性，如沾到皮肤立刻用大量的清洁剂和水冲洗！

溶液配方及原理：

1、TRIzol试剂：TRIzol能在破碎细胞、溶解细胞内含物的同时保持RNA的完整。其主要成分是苯酚和异硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。异硫氰酸胍，是一种强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。

2、氯仿：氯仿可增强TRIzol中的8-羟基喹啉对RNase的抑制作用。另外氯仿作为有机溶剂，加入氯仿后离心可使溶液分层，上层为水相，下层为有机相。苯酚为弱酸性，酸性条件下（一般为Ph5.0）DNA和蛋白质进入有机相，而RNA留在水相；反之亦然，弱碱性（Ph8.0）时DNA留在水相。

3、异丙醇、无水乙醇、70%乙醇：异丙醇和乙醇能与水任意比例互溶，因此加入异丙醇能够夺取RNA周围的水分，使其脱水沉淀。

4、DEPC水：DEPC是RNase的化学修饰剂，它与RNase的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制其活性。DEPC有毒性，操作时应小心。谁说是最优秀的；谁是最自由的，谁也就是最优秀的，在他们身上，才会有最大的美。

操作步骤

1、细胞破碎

A、组织：按1 mL/50~100 mg组织样品的比例向打散的组织块中加入TRIzol试剂，样品的体积不能超过TRIzol体积的10%。

B、贴壁细胞：按1 mL/10 cm2的比例直接加入TRIzol试剂，并用移液枪反复吹吸数次。TRIzol试剂过少会导致DNA污染。

C、悬浮细胞：悬浮细胞离心收集后，直接按1 mL/5~10×106个细胞（动物、植物或酵母）的比例加入TRIzol试剂。加入TRIzol前不要洗细胞，否则易造成mRNA的降解。

如果样品中含有较多的蛋白、脂肪、多糖或其他细胞外物质，如肌肉、脂肪组织或植物的块根等，可在2℃~8℃，12000×g离心10 min去除这些物质。

关于TRIzol的用量，Invitrogen官方说明书中有建议用量：

一般情况下，根据细胞量的多少我的用量是：2~3 mL/10 cm Dish、500μL~1 mL/6 cm Dish、200~500 μL/3.5 cm Dish（仅供参考）

2、氯仿抽提分层

加入TRIzol后，室温（15℃~30℃）孵育5 min保证核蛋白复合体充分解离。按0.2 mL/1 ml TRIzol的比例加入氯仿。盖紧管盖后剧烈摇晃15s，室温静置2 3分钟。12000×g，2℃ 8℃离心10 min，转速不可过高否则会导致RNA断裂。离心后液体分为三层，下层为红色的有机相（酚-氯仿），中间为白色的沉淀，上层为无色的水相。RNA在上层水相中，水相的体积约为加入的TRIzol体积的60%。

3、用异丙醇使RNA沉淀

将上层水相转移到一个干净的1.5 mL管中，如需提取DNA或蛋白质就保存下层有机相。

加入与水相等体积的异丙醇，室温孵育10 min。12000×g，2℃~8℃离心10 min。RNA沉淀一般附着在远离离心机轴心的管底，为无色胶状。

4、用乙醇洗涤去除残留的蛋白质和无机盐

去除上清后，用1 mL 75%乙醇（用Rnase-free的水配制）洗涤RNA沉淀。震荡混匀RNA后，7500×g 2℃~8℃离心5 min。

5、用DEPC水溶解RNA

去除上清后，将管子敞口晾5~10 min，使RNA沉淀呈现半透明状。不要让RNA沉淀变成完全不透明，那时RNA完全干燥将会大大影响RNA的溶解。根据后续实验要求加入适量的DEPC水，用移液枪反复吹吸数次后。

逆转录法合成cDNA

一般逆转录（也可称作反转录）都有现成的试剂盒，只要大家按照试剂盒的说明书来操作，问题都不大，在这里我就以TAKARA的逆转录试剂盒为例稍加说明。

Random 6 mers 为随机的6核苷酸引物，引物序列为5'-(P)NNNNNN-3'，特点是产物量大，特异性差，适用于长的或具有Hairpin构造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在内的所有RNA的反转录反应都可使用本引物。

Oligo dT Primer 适用于具有Poly（A）Tail的RNA，因而特异性好，但因其只结合Poly A尾巴，对于较长的mRNA，经常不能延伸到5'端。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些种类真核生物的mRNA等不具有Poly（A）Tail）。

两种引物可据实际情况使用一种，也可同时使用。还有一种情况，当只扩增一种目的基因时，也可以使用Specific Primer（PCR时的下游引物）作为反转录引物。

操作步骤

步骤简述如下：按照下图中1配制溶液，然后65℃处理后加入3中所配制溶液继续后续反应即可。

连接产物的转化

常用的感受态细胞有DH5α、BL21（DE3）、Rossetta等，而抽提质粒一般用DH5α，可以自己制备也可以购买商业化的感受态。

ABOUT Transformation

注意事项

1. 感受态细胞要现用现融，刚刚融化的感受态转化效率最高；

2. 避免反复冻融感受态细胞；

3. 整个操作过程要轻柔，不要用移液器猛烈吹吸；

4. 感受态和连接产物（或质粒）用量要适中，并不是越多越好。

操作步骤

1. 取50 μL感受态细胞置于冰上融化；

2. 加入5 μL连接产物（质粒一般只需用白色枪头沾取一下即可），混匀，置于冰上静置30 min（此时应该打开水浴锅并调温至42℃）；

3. 42℃水浴中热激90 s，迅速置于冰上静置2 min；

4. 加入500 μL无菌的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃，200rpm的恒温摇床中培养1 h，使细胞复苏；

5. 连接产物：3000 rpm离心5 min，弃上清，留取少量LB（50 μL左右），重悬沉淀，全部均匀涂布于LB培养板（需含相应抗生素）上，37℃ 倒置培养 16 18h；质粒：直接取20 50 μL涂于LB培养板上培养即可。

质粒的小量提取

ABOUT 质粒抽提

实验原理：

较常用的质粒提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解法。前两种方法比较剧烈，适用于较小的质粒（<15kb）。去污剂裂解法则比较温和，一般用于分离大质粒（>15kb）。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒的方法，其原理为：当细菌暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。

由于质粒DNA分子比染色体DNA大得多，且前者为共价闭合环状分子，后者为线状分子。只要碱处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，质粒DNA双链就会再次形成。

在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会互相缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐（SDS）包盖。

当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去沉淀之后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

本方法采用Tiangen小提中量试剂盒进行提取，其纯化系统是硅基质吸附材料，其原理为在高盐环境下质粒DNA能够结合到硅基质上，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐缓冲液或水将质粒DNA从硅基质上洗脱下来。得到的质粒可以用于酶切、PCR、测序、细菌转化、转染等分子生物学实验。

实验试剂（试剂盒试剂配方不清楚，以下配方见《分子克隆实验指南》）

1、溶液P1：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-Cl（pH 8.0），10 mM EDTA，100μg/ml RNase A

原理：Tris-Cl用于提供一个合适的缓冲体系；50 mM葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；而EDTA 作为Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，起到了抑制DNase的作用；RNase作用为去除质粒中混有的RNA，其不受EDTA的影响。

2、溶液P2：0.2 N NaOH，1% SDS

原理：0.2 N NaOH的作用在于使细菌裂解，而SDS作用在于加入P3之后是被其包盖的细菌蛋白，染色体DNA一起作为沉淀析出。

3、溶液P3：3 M 醋酸钾，2 M 醋酸

原理：这一步的K+置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na+，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时染色体DNA也被PDS共沉淀。而醋酸用于中和碱，使溶液恢复中性，从而使质粒DNA复性。

操作步骤

1、将过夜培养的菌液（5-15ml）从摇床中取出，并拧紧盖子，9000 rpm离心10 min，用泵尽量吸除上清。若暂时不提取，可将沉淀保存于-20℃，也可直接将菌液保存于4℃（短时间）。

注意：如果菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。

2、柱平衡步骤：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL, 12000 rpm（-13400g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中（请使用当天处理过的柱子）。

注意：若柱子放置较久，需要进行这一步骤；否则，可省。

3、向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA，并置于冰上 ) ，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，并移至2ml离心管中。如果沉淀的菌体较多，则相应增加P1的用量（之后P2和P3的用量也应成比例增加），并分到几个管子中分别进行步骤4和5的操作（不然P1+P2+P3的总体积超过2ml离心管容积），步骤6过上清时可过同一个吸附柱。

注意：菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。另外，务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

4、向离心管中加入500μl溶液P2 ，温和地上下翻转6-8 次使菌体充分裂解。由于P2裂解不应超过5 min，以免质粒受到破坏。故加入P2前将计时器定时4 min，以免超过时间。但是时间也不可过短，以免裂解不彻底。每管操作时间尽量一致。

注意：温和地混合不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA 。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

5、向离心管中加入700μl溶液P3（记得冰上预冷），立即温和地上下翻转6-8 次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。放置冰上10min，之后12000rpm ( -13400g ）离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。如果上清量较大，需要多次过柱，可将上清转移至新的离心管中，以免沉淀飘起。

注意：P3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

6、将上一步收集的上清液分次加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中，其容量为750-800μl）,注意尽量不要吸出沉淀。 12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

7、可选步骤：向吸附柱中加入500ul去蛋白液PD，12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

注意：如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM101，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。

如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），这步省略。

8、向吸附柱中加入600μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（-13400g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5 min，有助于更好地去除杂质。

9、重复操作步骤8。

10、将吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm（-13400g ）离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11、将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300μl洗脱缓冲液EB（65℃预热），室温放置或65℃水浴2 min，12000rpm（-13400g ）离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中．重复步骤

11、洗脱液的pH 值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH 值在7.0-8.5 范围内（可以用NaOH 将水的pH 值调到此范围）, pH 值低于7.0 会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于100μl，体积过小影响回收效率，但也不应过大，以免所提质粒浓度过低，影响后面的使用。且DNA产物应保存在-20 ℃ ，以防DNA 降解。

结果判断

1、使用紫外分光光度计对质粒浓度及纯度进行测定

（1）检测波长为260nm和280nm，浓度看OD260，OD260值为1相当于大约50μg/ml；纯度看OD260/OD280，OD260/OD280比值应为1.7-1.9，偏低可能是蛋白质污染，偏高则可能是DNA降解或RNA污染，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。另外，测出来的OD260和OD280都应该在0.1-2.0之间，不然所得出的浓度和纯度不准确。

（2）应该注意的是作为空白对照的blank管稀释方法应该和所测样品管一样（如样品为2μl所提质粒+48μl ddH2O，则blank为2μl洗脱液+48μl ddH2O）。

2、酶切鉴定，并用琼脂糖凝胶电泳检测

（1）选用合适的内切酶对所提质粒进行酶切，并与未切质粒及转化用原质粒一起用琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶切结果及所提质粒与原质粒位置是否一致，可以判定所提质粒是否为目的质粒。

（2）所提质粒（未酶切）的电泳条带可能为一条带，也可能为二到三条带，这是因为质粒提取过程中操作过于剧烈可能使环状超螺旋结构的质粒DNA单链出现缺口（保持环状，失去超螺旋），或双链断裂（变成线状），三种构型的质粒分子在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速率是不一样的，因此会出现多条带，这也说明所得质粒不够理想。

测序结果的分析

构建好质粒之后我们一般先酶切鉴定，鉴定正确的可以直接拿去转染然后做WB检测表达即可。

可以正常表达的质粒我们需要送到测序公司测序，也可以直接送菌液测序，有些测序公司还提供质粒返还服务（即送菌液返还他们抽提的质粒）。

测序的引物一般使用通用引物，如果没有通用引物需要自行设计。常用的通用引物如下：

在公众号内回复“ 通用测序引物 ”获取此Excel！

测序结果返回之后我们就可以分析测序结果了。

一般常用的序列比对软件有DNAMAN和Chromas，当然，还有很多类似软件，大家可以根据个人习惯选择，在这里就不一一介绍了。

DNAMAN

1. 首先打开软件，左侧数字为各个通道的编号，每个通道只能载入一个序列：

2. 然后点击File->New，将我们目的基因的CDS序列粘贴进去，Ctrl+A全选，右键选择Load Selected Sequence，将序列载入通道1。

3. 选择通道2（点击数字2即可），点击File->Open打开测序回来的序列信息（后缀为.seq），同样全选右键载入通道2，之后点击Sequence->Multiple Sequence Alignment；

4. 在弹出窗口中，点击Channel，选中需要比对序列的通道，点击OK即可：

5. 后面基本是一直点击下一步，在如下图窗口中选中Try both strands：

6. 然后一直下一步，出来如下结果，即可比对测序结果和原CDS序列，如果有突变我们需要看一下是否是同义突变，如果是即质粒序列正确。

Chromas

1. 用Chromas软件打开测序返还的序列信息，然后点击File->Blast Search:

TRIzol有毒性，trizol中含有苯酚，苯酚是刺激性气味。对呼吸道有伤害，闻久了会有晕的感觉。

1、TRIZOL的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。

2、苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。

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扩展资料：

使用TRIzol的注意事项：

1、在匀化后和加入氯仿之前，样品可以在_60—_70°C保存至少一个月。RNA沉淀（步骤4，RNA洗脱）溶于75%的乙醇在2—8°C至少可以保存一周，在_5—_20°C下至少可保存一年。

2、从少量的组织（1—10mg）或细胞（102—104）中分离RNA样品：往组织或细胞中加入800&micro；lTRIZOL。待样品裂解后，加入氯仿并进行步骤2中的抽提操作。

3、台式离心机最大能达到2,600×g的离心力，如果将离心时间延长到30-60分钟可以满足步骤2和步骤3中的操作。

参考资料来源：/baike.baidu.com/item/TRIZOL"target="_blank">百度百科-TRIZOL

参考资料来源：/baike.baidu.com/item/苯酚/317273?fr=aladdin"target="_blank">百度百科-苯酚

你说得太宽泛了。

核酸：基因组DNA有现成试剂盒出售，TAKARA公司的两百块钱左右一盒，照着说明书做就行了。原理是用碱裂解细胞后用特异性硅胶柱疏水结合富集DNA。测量用比色法就行

RNA有TRIZOL试剂卖（Invitrogen公司），1000多块钱一瓶，也是照着说明书做就行了。配方是商业秘密，似乎是用苯酚裂解细胞。然后酚氯仿除掉蛋白质。这是各种RNA的混合物，进一步分离用电泳或者PCR，测量用Q-RT-PCR，Northern Blot或者逆转录后做Southern Blot。

核酸：用1%的Triton-X100去污剂裂解细胞（或者SDS也行），有时候需要超声辅助。然后离心除去细胞碎片和DNA。这是蛋白质的混合物，进一步分离用层析或者电泳。测量用ELISA或者Western Blot

能

苯或甲苯的机理作为苯酚的机理

这个是不符合要求的，因为苯酚有的性质是苯和甲苯所没有的，至于相关文献，你可以去图书馆去下载，一般都是有相关文献的，文献上面都会有相关的机理的

裂解（英语：Pyrolysis），或称热解、热裂、热裂解、高温裂解，指无氧气存在下，有机物质的高温分解反应

而燃烧一般是在有氧条件下的剧烈放热反应

望采纳

质粒DNA的制备 【实验目的】

1.了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用；

2.掌握质粒DNA分离和纯化的原理；

3.学习碱裂解法和煮沸法分离质粒DNA的方法。

【实验原理】

质粒是细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞特定的表型。质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA 序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单个酶切位点；（3）能插入较大的外源DNA 片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb 至10kb 之间，如pBR322、pUC 系列、pGEM 系列和pBluescript（简称pBS）等。经过改造的基因工程质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介，这种基因的运载工具在基因工程中具有极广泛的用途，而质粒的分离与提取则是基因工程最常用、最基本的实验技术。

一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法和羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株的类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途选择不同的方法。本实验介绍最常用的碱裂解法和煮沸法提取质粒DNA。

1. 碱变性法

碱变性法提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离的目的。在pH值高达12.6的碱性环境中，染色体的线性DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而被变性；共价闭环质粒DNA的大部分氢键也断裂，但两条互补链不会完全分离，仍会紧密地结合在一起。用pH4.8的KAc或NaAc高盐缓冲液调节其pH值到中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此可以迅速复性；而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能复性，它们相互缠绕形成不溶性网状物，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，用酚-氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA，然后用乙醇或异丙醇将溶于上清液中的质粒DNA沉淀。

2.煮沸法

细胞用含有TritonX－100的缓冲液处理，溶解细胞膜。用溶菌酶酶解细菌细胞，然后在高温条件下，使细胞裂解，破坏细菌细胞壁，有助于解开DNA链的碱基对，并使蛋白质和染色体DNA变性。而闭环质粒DNA配对虽被破坏，但双链彼此不分开，当温度下降时恢复成超螺旋。变性蛋白带着染色体DNA一起沉淀下来，质粒DNA仍留在上清液中。离心后的上清液再用异丙醇或乙醇处理，沉淀出质粒DNA。

以上两种制备方法的实验过程中，由于细菌裂解后受到剪切力或核酸降解酶的作用，染色体DNA容易被切断成为各种大小不同的碎片而与质粒DNA共同存在，因此，采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有质粒DNA外，还可能有少部分染色体DNA和RNA，必要时可进一步纯化。

提取的质粒DNA中会含有RNA，但RNA一般并不干扰进一步实验，如限制性内切酶消化，亚克隆及连接反应等，因此不必除去。

苯酚、氯仿、异戊醇抽提DNA的原理是通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质,再加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.

使用苯酚抽提细胞 DNA 时,苯酚的作用是使蛋白质变性,同时抑制了 DNase 的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与 DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶.蛋白分子溶于酚相,而 DNA 溶于水相.

氯仿的作用是克服酚的缺点；加速有机相与液相分层.最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚.（酚易溶于氯仿中）

用酚-氯仿抽提细胞基因组 DNA 时,通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇,为什么?因为异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡.异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡 产生.另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含 DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定.

本方案(Chomczynski1993) 可以从部分组织或细胞中同时提取RNA 、DNA 和蛋白质。像它的前身(Chomczynski

and Sacchi 1987) 一样，此方法涉及用异硫氰酸胍和苯酚的单相溶液裂解细胞。加入氯仿产生第二（有机）相，从而DNA

和蛋白质被抽提，而RNA留在水相上清中。有机相中DNA 和蛋白质的分离，通过按顺序用乙醇、异丙醇进行沉淀。从有机相中回收的DNA 是20kb

大小、适合进行PCR 反应的模板。蛋白质由于暴露在胍中，而变性则主要用于免疫反应。用异丙醇从水相中沉淀出的RNA

可通过色谱法在寡核苷酸-纤维素柱进一步纯化和/或用于Northern 杂交、反转录或RT-PCR 。

总RNA 的产率因组织或细胞来源而异，但一般而言，组织的初始产量为4~7μg/mg ,细胞为5 ~ 10 mg/107个细胞，所提取的RNA 的A260/A280比值为1.8 ~ 2.0 。

材料

准备本方案中的所有试剂均需要用DEPC 处理的水。

试剂

细胞或组织

氯仿

DEPC 处理过的水

十五水拧檬酸二钠( 0.8mol/U） 不需调整pH 。

乙醇（75%)

异丙醇

液氮

单相裂解试剂

氯化钠( 1.2 mol/L)

磷酸盐缓冲盐水(PBS) ，冰冷（可选，见步骤1)仅适用于重悬和单层细胞生长所需的。

RNA 沉淀溶液

SDS (20%, m/V) （可选，见步骤7 )

设备

用于测量在260nm 处吸光度的比色皿

组织匀浆器

低中速离心机和转子

DEPC 处理水清洗过的研钵和杵，预冷

聚丙烯带封盖的管

65°C 水浴（可选，见步骤7)

方法

1.准备细胞或组织样品提取RNA 。

对于组织样品

处理含有丰富的蛋白质分解酵素的组织如胰腺或肠道时，最好将组织先切成小块( 100mg ) ，然后直接放入液氮中。快速冷冻的组织可以被转移到－70°C 保存或立即用于提取RNA  。组织可以存储于－70°C 数月而不影响RNA的产量或完整性。

冷冻和粉碎并不是必需的。不含有丰富的RNase 的组织可以被迅速剁碎成小块，并直接转入加有适量溶液D （步骤l.iii ) 的聚丙烯snap-cap 管中。

i 分离出所需组织，并立即将它们放置在液氮中。

ii 将约100mg 的冷冻组织转移到含有液氮的研钵中，并用杵粉碎。在粉碎过程中添加液氮以保持组织的冷冻状态。

iii . 转移粉状组织至还有lmL 冰冷单相裂解试剂的聚丙烯snap-cap 管中。

iv 在室温下用Polytron 匀浆器匀浆组织15~30s 。

对于悬浮培养的哺乳动物细胞

i 通过200 ~ 1900g 离心5 ~ 10min 收获细胞。

ii 弃培养基，用1 ~ 2mL 的无菌冰冷PBS 重悬细胞沉淀。

iii 通过离心收集细胞，弃去PBS, 按每106个细胞加lmL 单相裂解试剂比例加入单相裂解试剂。

iv 在室温下用Polytron 匀浆器匀浆组织15 ~ 30s 。

对于单层哺乳动物细胞

i 弃去培养基，并用5~10mL 无菌冰冷的PBS 漂洗细胞一次。

ii 弃去PBS, 按一个90mm 培养皿加入lmL 单相裂解试剂比例加入单相裂解试剂裂解细胞（每60mm 培养皿0.7mL) 。

iii. 细胞裂解液转移到聚丙烯snap-cap 管中。

iv . 在室温下用Polytron 匀浆器匀浆组织15 ~ 30s 。

2.在室温下孵育5min, 以完全分离核蛋白复合物。

3.每毫升单相裂解试剂添加0.2mL 氯仿。剧烈振动或涡旋以混合样品。

4°C 以12000r/min 离心15min, 分离成两相的混合物。将上层水相转移到新的管中。

DNA 和蛋白质提取到有机相中， RNA 留在水相中。DNA 和蛋白质可能通过顺序用乙醇、异丙醇沉淀，并从有机相中回收

   5 . 从水相中沉淀的RNA : 对于每个初始毫升的单相裂解试剂，加入0.25 倍体积的异丙醇和0 .2 5 倍体积沉淀RNA 溶液。彻底混合后，室温下放置10min 。

微型离心机4 °C 以最大的速度离心10min 收集沉淀出的RNA 。用75％乙醇洗涤沉淀两次，再离心。用一次性吸头清除残留的乙醇。敞开放置数分钟使乙醇挥发，不要让沉淀完全干燥。

6.加入50~100mL DEPC 处理过的水， -70℃ 储存RNA 溶液。

7.加入0.5 % SDS, 然后加热至65℃ 可协助溶解沉淀。

  8.估计RNA 的浓度。

提取dna的苯酚浓度是(μg/ml)=OD260×40μg/ml。高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，接着通过透析来获得DNA。DNA具有储存生命基因的重要作用，酚抽的提法是用蛋酶K和SDS来破碎细胞消化蛋白。玻璃棒缠绕法来提取DNA：将裂解物铺于乙醇上，接着用盐酸胍裂解细胞，用带钩玻璃棒在界面轻轻搅拌，使得DNA沉淀液绕于玻棒之上。可以采用甲酰胺解聚法破碎细胞，异丙醇沉淀法和酚抽的提法基本相似，区别在于仅用二倍容积异丙醇来替代乙醇，目的是去除小分子RNA，加热法是能够快速获得DNA。一般加热96度-100度，然后进行离心后取上清，就可以提取dna。