细胞周期测定实验有哪些，怎么做

根据你所购买的试剂盒而定,一般是先用70%乙醇先固定,然后加RNA酶和PI,半个小时左右上机检测就可以了.需要注意的就是加酒精固定的时候要用四度预冷的酒精,缓慢的加,边加边晃动细胞,避免细胞黏连在一起.

（1）细胞培养

取对数生长期的细胞，按1X106个/mL以1mL体积接种于6孔板内。培养24h后，加入不同浓度样品。在37 ℃、5 % 的CO2恒温箱中培养24h后终止。

（2）细胞固定

胰酶消化并离心收集细胞（800rpm/min），弃上清，用预冷PBS洗细胞两次，加入预冷70％乙醇， -20℃固定保存。

（3） 细胞染色

离心收集细胞（800rpm/min），以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mL RNase A, 4℃避光孵育20分钟。

（4）检测

以标准程序用流式细胞仪检测，汞激发波长488nm，计数8千个细胞，结果用软件WinMDI Version 2.9分析。

一 般来说都是将细胞悬液离心并弃上清后加入固定液，我们加的是70％的冰乙醇，加的量根据你细胞的多少。你这个涉及的测蛋白，那么加多聚甲醛的量和时间可能 要控制得严一些才能保证最低限度不破坏a－SMA的结构。如果单测细胞凋亡和周期的话固定液多一点和固定时间长一点都影响不是太大。其实无论是做细胞周期 的乙醇固定，还是做蛋白染色的多聚甲醛固定，固定液加1mL就可以了，一般每个样品的细胞数都在106左右。固定液太少了不好，因为固定液的实际作用浓 度一定程度上受弃上清后管内残留液体量的影响，但太多了也没有意义。也正是这个原因，实际上多聚甲醛的浓度用4%的多一些，而且因其有挥发性，时间长浓度 会有所降低。至于固定时间，一般4度30min固定作用就已经比较完全了，但是也可以放置过夜，这样有时有利于时间安排。

从分类上来说，一般有两类：第一类是只染DNA。这类方法比较简单，用酒精固定细胞后，直接加含有RNA酶的荧光染料，比如PI等，然后就可以直接上机。

第二类另外加了一个步骤，在细胞培养液中加入核苷酸的模拟物，比如BrdU或者EdU。细胞新合成的DNA上就会有这些物质。在不同时间点收集细胞，用DNA染料染DNA的同时，还以用抗体或者化学发光法染核苷酸模拟物也发荧光。这个方法的有点就是不仅可以像第一类方法一样，看到处于细胞周期各个期的百分率，另外还可以看到有多少DNA是新合成的。是一个动态的过程。

细胞周期(cellcycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。生命是从一代向下一代传递的连续过程，因此是一个不断更新、不断从头开始的过程。细胞的生命开始于产生它的母细胞的分裂，结束于它的子细胞的形成，或是细胞的自身死亡。通常将子细胞形成作为一次细胞分裂结束的标志，细胞周期是指从一次细胞分裂形成子细胞开始到下一次细胞分裂形成子细胞为止所经历的过程。在这一过程中，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。（一）间期间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。1.G1期（firstgap）从有丝分裂到DNA复制前的一段时期，又称合成前期，此期主要合成RNA和核糖体。该期特点是物质代谢活跃，迅速合成RNA和蛋白质，细胞体积显著增大。这一期的主要意义在于为下阶段S期的DNA复制作好物质和能量的准备。细胞进入G1期后，并不是毫无例外地都进入下一期继续增殖，在此时可能会出现三种不同前景的细胞：①增殖细胞：这种细胞能及时从G1期进入S期，并保持旺盛的分裂能力。例如消化道上皮细胞及骨髓细胞等；②暂不增殖细胞或休止细胞：这类细胞进入G1期后不立即转入S期，在需要时，如损伤、手术等，才进入S期继续增殖。例如肝细胞及肾小管上皮细胞等；③不增殖细胞：此种细胞进入G1期后，失去分裂能力，终身处于G1期，最后通过分化、衰老直至死亡。例如高度分化的神经细胞、肌细胞及成熟的红细胞等。2.S期（synthesis）即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白。DNA复制所需要的酶都在这一时期合成。3.G2期（secondgap）期为DNA合成后期，是有丝分裂的准备期。在这一时期，DNA合成终止，大量合成RNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等。（二）分裂期M期：细胞分裂期。细胞分裂期：前期，中期，后期，末期。细胞的有丝分裂（mitosis）需经前、中、后，末期，是一个连续变化过程，由一个母细胞分裂成为两个子细胞。一般需1～2小时。1.前期（prophase）染色质丝高度螺旋化，逐渐形成染色体（chromosome）。染色体短而粗，强嗜碱性。两个中心体向相反方向移动，在细胞中形成两极；而后以中心粒随体为起始点开始合成微管，形成纺锤体。随着核仁相随染色质的螺旋化，核仁逐渐消失。核被膜开始瓦解为离散的囊泡状内质网。2.中期（metaphase）细胞变为球形，核仁与核被膜已完全消失。染色体均移到细胞的赤道平面，从纺锤体两极发出的微管附着于每一个染色体的着丝点上。从中期细胞可分离得到完整的染色体群，共46个，其中44个为常染色体，2个为性染色体。男性的染色体组型为44+XY，女性为44+XX。分离的染色体呈短粗棒状或发夹状，均由两个染色单体借狭窄的着丝点连接构成。3．后期（anaphase）由于纺锤体微管的活动，着丝点纵裂，每一染色体的两个染色单体分开，并向相反方向移动，接近各自的中心体，染色单体遂分为两组。与此同时，细胞波拉长，并由于赤道部细胞膜下方环行微丝束的活动，该部缩窄，细胞遂呈哑铃形。4．末期（telophase）染色单体逐渐解螺旋，重新出现染色质丝与核仁；内质网囊泡组合为核被膜；细胞赤道部缩窄加深，最后完全分裂为两个2倍体的子细胞。G0期：暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，去执行一定生物学功能的细胞所处的时期。在体内根据细胞的分裂能力可把它们[1]分为三类：①周期性细胞，如造血干细胞，表皮与胃肠粘膜上皮的干细胞。这类细胞始终保持活跃的分裂能力，连续进入细胞周期循环；②终端分化细胞，如成熟的红细胞、神经细胞等高度分化的细胞，它们丧失了分裂能力，又称终末细胞（endcell）；③暂不增殖细胞群（G0期细胞），如肝细胞、肾小管上皮细胞、心肌细胞、甲状腺滤泡上皮细胞。它们是分化的，并执行特定功能的细胞，在通常情况下处于G0期，故又称G0期细胞。在某种刺激下，这些细胞重新进入细胞周期。如肝部分切除术后，剩余的肝细胞迅速分裂。周期作用折叠编辑本段目前，科学家已发现有几类调控因子在细胞周期中起着重要作用。一类是对细胞分裂增殖有调控作用的细胞生长因子。如第二类细胞周期调控因子，又称内源性调节因子，是细胞内自己合成的蛋白质。细胞周期调控机制的序幕已经拉开，科学家们正在从不同的角度研究细胞周期与癌基因、抑癌基因、生长因子以及细胞增殖分化的关系，相信通过努力，我们最终能找到控制细胞周期的神奇“开关”。在肿瘤治疗中我们也可利用细胞周期的原理对症下药。如G0细胞对化疗不敏感，往往成为日后癌症复发的根源。因而可以设法诱导G0期癌细胞进入增殖周期再行杀灭。这是一个尚在探索中具有理论意义和实践意义的问题。相关检测折叠编辑本段Ⅰ、样品准备准备以下一种或几种样品A、组织单细胞悬浮液（如淋巴腺、脾、骨髓、胎盘细胞）B、组织培养细胞C、Ficoll-hypaque分离的单核细胞Ⅱ、反应体系－DNA低渗缓冲液柠檬酸三钠0.25gTriton-X1000.75mlPropidiumiodide0.025g核糖核酸酶0.005g蒸馏水250ml我们将该DNA低渗溶液于密闭瓶子中存放数月后并无发现有任何染色活性的丢失Ⅲ、染色1、每一个管子中放入1×106个细胞；2、样品离心后尽可能完全地移去上清液，并且不要打碎沉淀块；3、入1ml的DNA低渗染色（可用甲基绿进行染色）缓冲液至沉淀中，并混匀；4、样品于4℃下避光30分钟或最长不超过1个小时以备流式细胞仪分析。注意：延长在低渗缓冲液的曝光时间会引起样品碎片的增加。细胞周期检测可以作为生物相容性评价指标，示例如下：应用体外细胞培养法，观察不同质量分数羟基磷灰石浸提液对L-929细胞的细胞学形态的影响，同时采用MTT比色法评价羟基磷灰石对L-929生长和增殖的影响，流式细胞仪检测羟基磷灰石浸提液对L-929细胞生长周期及凋亡的影响。结果表明，羟基磷灰石浸提液对体外培养的细胞形态无明显影响，对细胞生长和增殖无明显抑制作用；不同质量分数材料浸提液的细胞毒性为0~1级，随羟基磷灰石浸提液质量分数的升高，细胞凋亡率逐渐上升；50%、75%、100%羟基磷灰石浸提液组能明显降低G0/G1期细胞比例，增加S,G2/M期细胞比例，能增加L-929细胞DNA的合成，促进细胞生长和组织修复。细胞周期检测是生物材料生物相容性评价的一种可靠方法和指标。其他资料折叠编辑本段细胞周期（细胞有丝分裂）口诀折叠以植物细胞有丝分裂为例：有丝分裂分五段间前中后末相连间期首先作准备间期染体复制在其间前期两消两现一散乱中期着丝点聚赤道板后期丝牵染体两极走末期两消两现壁重建注：动物细胞末期不生成细胞壁。周期详解折叠以有丝分裂方式增殖的细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束所经历的过程。这一过程周而复始。细胞周期是50年代细胞学上重大发现之一。在这之前认为有丝分裂期是细胞增殖周期中的主要阶段，而把处于分裂间期的细胞视为细胞的静止阶段。1951年霍华德等用P-磷酸盐标记了蚕豆根尖细胞，通过放射自显影研究根尖细胞DNA合成的时间间隔，观察到P之掺入不是在有丝分裂期，而是在有丝分裂前的间期中的一段时间内。发现间期内有一个DNA合成期（S期），P只在这时才掺入到DNAS期和分裂期（M期）之间有一个间隙无P掺入，称为G2期，在M期和S期之间有另一个间隙称为G1期，G1期也不能合成DNA。于是他们提出了细胞周期的概念，并首先证明间期是细胞周期中极为重要的一个阶段，发生着许多与细胞分裂有关的特殊生化事件。这一发现被以后学者们用H-胸腺嘧啶核苷进行的类似研究所证实。细胞生命活动大部分时间是在间期度过的，如大鼠角膜上皮细胞的细胞周期内,间期占14000分钟。分裂期仅占70分钟。细胞周期各阶段都有复杂的生化变化。间期是细胞合成DNA、RNA、蛋白质和各种酶的时期，是为细胞分裂准备物质基础的主要阶段。在一个增殖的细胞群中，所有细胞并非是同步增殖的，它们在细胞周期运行中，可能有四种命运（图1）：①细胞经M期又开始第二次周期；②停止于G2期，称为G2期细胞（R2），它受某种刺激后可进入周期；③停止在G1期，称为休止细胞或名G0期细胞，这类细胞受某种刺激仍能进入周期，并开始DNA合成和有丝分裂；④丧失生命力近于死亡的细胞，称为丢失细胞，或称不再分裂的细胞。继续分裂的细胞沿着细胞周期从一个有丝分裂期到下一个分裂期。不再分裂的细胞离开了细胞周期不再分裂，最终死亡。G1期进行大量物质合成时期。细胞体积逐渐增大，制造RNA（包括tRNA，mRNA，rRNA以及核糖体等）。RNA的合成又导致结构蛋白和酶蛋白的形成，这些酶又控制着形成新细胞成分的代谢活动。G1又分为G1早期和G1晚期两个阶段；细胞在G1早期中合成各种在G1期内所特有的RNA和蛋白质，而在G1晚期至S期则转为合成DNA复制所需要的若干前体物和酶分子，包括胸腺嘧啶激酶、胸腺嘧啶核苷酸激酶、脱氧胸腺嘧啶核苷酸合成酶等，特别是DNA聚合酶急剧增高。这些酶活性的增高对于充分利用核酸底物在S期合成DNA是不可少的条件。G1期持续时间变异很大，多数细胞的G1期较长，是与细胞需要增加质量有关。但在某些单细胞生物如大变形虫、四膜虫和多细胞生物的某些细胞（如海胆胚胎，小鼠胚胎细胞）则无G1期，中国仓鼠卵巢细胞的变异株无G1和G2期，以致M期和S期连接在一起。G1期的长短之所以变化很大，与G1期内存在一个校正点或阻止点（简称R点）有关。R点主要控制G1期时间的长短。通过了此点，细胞就能以正常速度不受外界条件的影响而完成细胞周期的其他时期。因此，有人认为细胞的生长是在G1期R点上停止的，例如当细胞内环腺苷酸（cAMP）水平增高，细胞密度增加时，可阻止细胞从G1期向S期过渡，用嘌呤霉素抑制蛋白质合成或用放射线菌素D抑制RNA合成，也能延缓细胞从G1期进入S期。有人发现G1期内能合成一种有触发作用的蛋白质；它是不稳定的，极易被分解，故称为v蛋白。v蛋白在G1细胞中达到一定水平时，细胞便可通过R点进入S期。G0期细胞周期的调节主要是通过G1期的阻留而实现的，G0期即指细胞处于阻留的状态。细胞通过M期一分为二，有的可继续分裂进行周期循环，有的转入G0期。G0期是脱离细胞周期暂时停止分裂的一个阶段。但在一定适宜刺激下，又可进入周期（图1），合成DNA与分裂。G0期的特点为：①在未受刺激的G0细胞，DNA合成与细胞分裂的潜力仍然存在②当G0细胞受到刺激而增殖时，又能合成DNA和进行细胞分裂。S期在这一阶段完成DNA的合成以及合成与DNA组装构成染色质等有关的组蛋白。DNA含量在此时期增加一倍。S期终结时，每一染色体复制成两个染色单体（Hole,1979）。生成的两个子代DNA分子与原来DNA分子的结构完全相同。一个人体细胞核直径10～20微米，其中DNA含量为10克，如拉成一根DNA链，长度可达3米。哺乳类动物细胞S期一般为6～8小时。DNA的复制能在几小时内完成，主要是由于DNA链分成许多的复制单位（复制子）（可多达10000个左右），它们可在S期的不同时间分别复制。另外，在S期内还有组蛋白的合成──组蛋白基因在G1-S期之间活化，组蛋白mRNA的转录增大，并在整个S期内连续进行。已合成的组蛋白使新合成的DNA很快转为核组蛋白复合体。S期细胞含有一种因素能诱导DNA合成，用细胞融合实验证明，G1细胞在与S期细胞融合后能加速其核内DNA复制的起点启动。S期不同阶段复制的DNA碱基组成是不同的，早期复制的DNA富有G-C碱基，晚期复制的DNA富有A-T碱基，即常染色质比异染色质复制较早（图2）。G2期是DNA复制结束和开始有丝分裂之间的间隙，在这期间细胞合成某些蛋白质和RNA分子，为进入有丝分裂提供物质条件。用放射标记的RNA前体和蛋白质前体示踪，表明G2期进行着强烈的RNA和蛋白质的合成。假如破坏这些合成过程，细胞就不能过渡到M期。G2期合成的是染色体浓缩以及形成有丝分裂器所需的成分。有人认为G2期继续完成从S期就开始的微管蛋白的合成，为M期纺锤丝的组装提供原料。在G2晚期开始合成有丝分裂因子。在某些缺少G1期细胞中，G2期更为复杂，还要担负起其他细胞G1期中所要完成的事件。也有少数情况，S期结束后立即开始有丝分裂，而不存在G2期。M期有丝分裂时期，是细胞形态结构发生急速变化的时期，包括一系列核的变化、染色质的浓缩、纺锤体的出现，以及染色体精确均等地分配到两个子细胞中的过程，使分裂后的细胞保持遗传上的一致性。M期分为前期、中期、后期和末期（见有丝分裂）。M期虽是形态变化最为显著的时期，但其呼吸作用反而降低，蛋白质合成明显下降，RNA合成及其他代谢周转停止，这是由于有丝分裂期所需要的能量和其他基本物质均在间期内合成和贮备好了有关。细胞周期中，细胞形态也发生一系列变化，从光学显微镜下可看到G1期细胞最小，细胞扁平而光滑，随着向S→G2→M期的发展细胞逐渐增大，从扁平变成球形。扫描电镜下可明显看到各时期内细胞表面形态的变化，如微绒毛逐渐增加，这些变化和细胞内各种生化的和生理的周期性变化是有关的。调控细胞周期中的许多生化事件是按一定顺序，有条不紊地进行着，这和基因按一定顺序表达密切相关。有人认为，细胞周期内有两个阶段最为重要：G1到S和G2到M；这两个阶段正处在复杂活跃的分子水平变化的时期，容易受环境条件的影响，如果能够人为的进行调控，将对深入了解生物的生长发育和控制肿瘤生长等有重要意义。已发现很多体内因素可以激发或抑制细胞的增殖，例如多种激素、血清因子、多胺、蛋白水解酶、神经氨酶、cAMP、cGMP以及甘油二脂（DG）、三磷酸肌醇（1P3）和Ca信使系统等等。细胞内cAMP浓度增加对细胞增殖有抑制作用，凡能使细胞内cAMP增高的因素都能抑制细胞的增殖，降低细胞生长速度；反之，凡能使细胞内cAMP含量下降的因素都能促进DNA的合成与细胞的增殖。细胞周期的各期中的cAMP含量也不相同（见表）。在中国仓鼠卵巢细胞株中，M期cAMP含量最低，M期后cAMP的水平增高三倍，从G1早期至G1晚期，cAMP水平降低到中等水平，直至S期仍维持低的水平（图3）。还有许多实验指出cGMP也对细胞增殖起调控作用，如将cGMP或双丁酰cGMP加到休止在G1期的3T3细胞时，能诱导DNA含量的增加，促进细胞的分裂。如提高细胞cGMP水平，就可促进细胞的有丝分裂，反过来，促进有丝分裂的药物也能增加cGMP的浓度。cAMP能抑制细胞的分裂，促进细胞的分化，cGMP则能抑制细胞分化，促进细胞增殖，在正常生长的细胞中，cAMP和cGMP维持在适当的水平，调节控制细胞周期的运转。抑素是细胞产生的一种小分子蛋白质或多肽，有的还含有糖或RNA。它无种属特异性，但有细胞特异性，对同类细胞增殖有抑制作用并且可逆。当抑素含量达到一定浓度时可抑制同类细胞的增殖，抑素浓度下降则细胞增殖活跃。有人认为抑素作用的机制，在于它能激活细胞膜上的腺苷环化酶活性，提高细胞内cAMP的浓度，因而抑制细胞的增殖，也可能通过cAMP-依赖性蛋白激酶对蛋白质的磷酸化作用来影响调节基因的活动。细胞周期也受机体调节系统的影响，例如肝再生就是由调节系统的作用加速肝细胞增殖。但是肿瘤细胞，由于宿主失去对它的调控，因而恶性增殖。在肿瘤治疗中可应用细胞周期的原理，如G0期细胞对化疗不敏感，往往成为日后癌症复发的根源，因而可通过调控机理的研究，诱发G0期癌细胞进入细胞周期，再合理用抗癌药物加以杀灭，是防止癌转移和扩散的重要调控措施，也是细胞动力学中有理论意义和实践意义的研究问题。总之，目前所了解的细胞增殖调控的分子基础还少，尚待进一步探索。细菌DNA增值特点折叠细菌DNA复制、RNA转录和蛋白质合成同时进行，这是细菌对快速生长的适应。DNA复制不受细胞周期的限制，快速生长的细菌，在上一次细胞分裂结束时，细胞内的DNA经复制到一半进程，以保证迅速进行下一次分裂。

1 测定细胞存活率 1.1取对数生长期的细胞,均以4×10 5 /mL 密度接种于6孔细胞培养板上；1.2培养过夜后，用相应药物处理细胞；1.3 消化收集细胞,包括培养液中悬浮的死细胞；1.4 300g离心5 min，去上清；1.5 加1mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心去上清1.6 最后重悬细胞于含5 g/mL碘化丙啶(propidium iodide, PI)的PBS缓冲液中(PI buffer：3.4 mM 柠檬酸钠(Trisodium Citrate), 9.65 mM NaCl, PI 20 mg/mL, 0.03% Nonidet P-40 , 配于H 2 O中)；1.7 避光冰上孵育10 min,上流式细胞仪测定细胞存活率。 2 测定细胞周期 2.1取对数生长期的细胞,均以4×10 5 /mL 密度接种于6孔细胞培养板上；2.2培养过夜后，用相应药物处理细胞；2.3 消化收集细胞，包括培养液中悬浮的死细胞；2.2 收集的细胞经PBS缓冲液洗一次后，去上清，将细胞逐滴加入70%预冷的乙醇中，4℃避光固定30 min； ……………… 详细资料请参考：on http://product.bio1000.com/101965/

细胞周期中每个时期分别所经历的时间长短，

每一时期的时间=细胞周期x每一时期的细胞数占计数细胞总数的比例

实验目标

1、初步掌握制作根尖细胞有丝分裂装片的技术。

2、观察植物细胞有丝分裂的过程，识别分裂的不同时期。

3、初步掌握绘制生物图的方法。

实验原理

细胞的有丝分裂是一个连续动态的变化过程，但可以通过它的形态变化，特别是细胞核中的染色体行为，人为地划分阶段，并进行比较研究。在自然状态下，一大群处于各个分裂期的细胞混杂在一起。必须仔细观察，寻找有丝分裂过程各期典型形态特征的细胞，从而建立起细胞周期的概念。植物的分生组织（如根尖分生区、茎尖生长点等）细胞，能够通过有丝分裂增加其数目。依据植物细胞分裂周期中各个时期细胞中染色质或染色体的形态、数目、位置变化，确定该细胞所处的时期。为了看清染色体或染色质，要用碱性染料将其染色。

实验材料

蚕豆、蒜和葱的根尖。

试剂仪器

洋葱鳞茎，镊子，刀片，培养皿，载玻片，盖玻片，滴管，纱布，吸水纸，酒精灯，显微镜；固定液，15%盐酸，醋酸洋红染液，95%乙醇。

方法步骤

1、洋葱根尖的培养

（1）培养洋葱生根时，避免用新采收的洋葱，因它尚在休眠不易生根。如果必须用当年刚采收的新洋葱培养生根，则应设法打破它的休眠。常用的方法是用低浓度的赤霉素溶液浸泡洋葱底盘，这样可以促使其生根。培养过程中，注意每天至少换水一次，以防烂根。

（2）对于头年收下的洋葱，可以采用如下方法促使它生根：

①选择底盘大的洋葱作生根材料。

②剥去外层老皮，用刀削去老根（从底盘中央向四周削），注意不要削掉四周的“根芽”。

③用烧杯装满清水，放上洋葱，放置在光照处。水要保持清洁，注意每天换水l～2次。一般2～3d即可获得实验所需材料（根长5cm）。

（3）固定时间取材。洋葱根尖细胞有丝分裂的时间是有规律的。通常在每天上午10时至下午2时分裂活跃，尤其以下午2时最活跃，可在这时取材。可以把培养好的洋葱根用卡洛氏固定液固定起来备用。因为培养一次洋葱根不容易。

2、解离。用刀片切下长约2～3mm的根尖，放入盛有15%盐酸和体积分数为95%的酒精溶液的混合液（1︰1）的培养皿中，解离3～5min，使根尖组织的细胞相互分开，待根尖透明酥软即停止解离。如果要使解离加快，可以把培养皿放在酒精灯上微微加热（不可煮沸）3～5 min。待根酥软后，用镊子取出。解离充分是实验成功的必备条件；解离的目的是用药液溶解细胞间质，使组织细胞相互分离开。

3、漂洗。把取出的根尖放入清水漂洗约10min，也可以在培养皿口上蒙上—层纱布，用自来水细小的水流漂洗3～5min。漂洗的目的是洗去根中多余的解离液。如果不把多余的解离液洗去，一方面会影响染色效果，因为解离液中含有HCl溶液，而用来染色的染料呈碱性；另一方面还会腐蚀显微镜的镜头。

4、染色。把漂洗好的根尖置于载玻片上，用镊子头截下长约3mm的根尖，其余部分丢弃，在根尖上滴一滴醋酸洋红染液染色3～5min，如果要使染色加快，可把载玻片在酒精灯的火焰上快速过几下（不可煮沸）。

5、装片。在染好色的材料上盖上盖玻片，上面再覆一片载玻片，用拇指轻轻压一下，使根尖组织成为均匀薄层的细胞层。

6、镜检

（1）低倍镜观察

把制成的洋葱根尖装片先放在低倍镜下观察，慢慢移动装片，找到分生区细胞，其特点是：细胞呈正方形，排列紧密，有的细胞正在分裂。

（2）高倍镜观察

找到分生区细胞后，把低倍镜移走，换上高倍镜，用细准焦螺旋和反光镜把视野调整清晰，直到看清细胞物像为止。

（3）仔细观察

仔细观察的目的是区分细胞分裂中各个时期内染色体变化的特点。可先找出处于细胞分裂中期的细胞，然后再找出前期、后期、末期的细胞，处于间期的细胞数目最多，最容易找到。

（4）在一个视野里，往往不容易找全有丝分裂过程中各个时期的细胞。如果是这样，可以慢慢地移动装片，从邻近的分生区细胞中寻找。

7、绘图。在仔细观察清楚有丝分裂各个时期的细胞的以后，绘出洋葱根尖细胞有丝分裂的简图。

注意事项

1、培养产生洋葱根尖的材料是洋葱鳞茎。鳞茎底部接触水，不能离开水，也不能被水淹。其目的是同时满足其对水和空气的需要。同时要经常换水，因为水中由于微生物的活动和根细胞的活动，代谢产物增多；此外，还由于根细胞的呼吸不断产生CO2，使水中H2CO3增多，氧气缺少；微生物，如细菌的大量繁殖也使水质受到污染，这些都不利于根尖生长，所以要经常换水。—般一天至少一次，还要提供适宜的温度。

2、剪取洋葱根尖材料时，应该在洋葱一天之中分裂最活跃的时间，一般在上午11点左右。如果因气温影响或不在—上述时间做实验的话，可以在细胞有丝分裂最盛时取材，放人盛有固定液的培养皿中固定，即浸泡半天到一天。固定后用75%乙醇冲洗几次，再放入盛有70%乙醇的小广口瓶中保存。注意要等根尖长到l～5cm时才能切取，而切取的洋葱根尖长度是2～3mm。根据实验得知，根长到1～5cm时，根的长势最佳，此时细胞分裂最旺盛，容易找到不同时期的分裂图象。此时可取生长健壮的根进行观察，切取洋葱根尖2～3mm，这个长度要从根的顶端（根冠）开始算起，这个长度已将分生区包括了进来。若取材过长，在低倍镜下寻找分生区就会很困难。

3、根尖培养好以后，装片制作是否成功，关键的步骤是解离。15%的盐酸溶液能溶解细胞壁之间的中层物质（胞间质），使组织中的细胞相互分开。否则，在显微镜下观察时，细胞将发生重叠现象，导致实验失败。解离不充分，细胞重叠；解离过度，细胞会腐烂，所以解离要适度。为达到这一目的，配制的盐酸浓度要适宜，切取的根尖应立即放入15%的盐酸中，在室温下解离10～15min。解离时间要视室内温度而定，温度低，时间稍长，温度高，时间短。也可手拿镊子，轻轻按正在解离的根尖，感觉酥软即可。

4、漂洗的目的是洗去根中多余的解离液。如果不把多余的解离液洗去，一方面会影响染色效果，因为解离液中含HCl，而用染色的染料呈碱性；另一方面还会腐蚀显微镜的镜头。

5、染色时，染色液的浓度和染色时间必须掌握好。特别是染色不能过深，否则镜下一片紫色，无法观察。也不能过浅，否则染色质和染色体的形态和数目不易辨清。

6、制片时，一方面要用镊子把洋葱根尖弄碎，另一方面要压片，这样可以使细胞分散开来。压片时，在盖玻片上再加一片载玻片的目的，一是避免压碎和移动盖玻片。二是使压力大小适中，从而使组织细胞均匀分散。同时用力必须恰当，过重时会将组织压烂，过轻则细胞未分散开，二者都将影响观察。

7、结果与讨论

在显微镜的一个视野中看到的细胞，多数处于细胞有丝分裂的间期，因为在一个细胞周期中，间期所占的时间占整个细胞周期的90%一95%，时间与细胞数目成正比。另外，在一个视野中，往往不容易找全有丝分裂过程中各个时期的细胞，可以慢慢地移动装片，从邻近的分生区细胞中寻找。

拓展：有丝分裂（mitosis），又称做间接分裂，由W. Fleming于1882年首次发现于动物及E. Strasburger（1880）年发现于植物。特点是有纺锤体染色体出现，子染色体被平均分配到子细胞，这种分裂方式普遍见于高等动植物（动物和高等植物）。是真核细胞分裂产生体细胞的过程。动物细胞（低等植物细胞）和高等植物细胞的有丝分裂是不同的。

分裂间期

有丝分裂间期分为G1（DNA合成前期）、S（DNA合成期）、G2（DNA合成后期） 三个阶段，其中G1期与G2期进行RNA（即核糖核酸）的复制与有关蛋白质的合成，S期进行DNA的复制；其中，G1期主要是染色体蛋白质和DNA解旋酶的合成，G2期主要是细胞分裂期有关酶与纺锤丝蛋白质的合成。在有丝分裂间期，染色质没有高度螺旋化形成染色体，而是以染色质的形式进行DNA（即脱氧核糖核酸）单链复制。有丝分裂间期是有丝分裂全部过程重要准备过程，是一个重要的基础工作。（现代医学，利用有关药物，制止了细胞中的纺锤丝的形成，从而抑制了细胞的有丝分裂，使细胞分裂停止于G0（G0阶段指因某些因素使细胞分裂停止，改变外因可使细胞重新进行分裂的时期）阶段，利用该技术的有关药物有效地遏制了癌细胞的恶性增殖和扩散。）

分裂期

前期 （prophase）

自分裂期开始到核膜解体为止的时期。间期细胞进入有丝分裂前期时，细胞核的体积增大，由染色质构成的细染色线螺旋缠绕并逐渐缩短变粗，形成染色体。因为染色质在间期中已经复制，所以每条染色体由两条染色单体组成，即两条并列的姐妹染色体，这两条染色单体有一个共同的着丝点连接。核仁在前期的后半期渐渐消失。在前期末核膜破裂，于是染色体散于细胞质中。动物细胞有丝分裂前期时靠近核膜有两个中心体。每个中心体有一对中心粒和围绕它们的亮域，称为中心质或中心球所组成。由中心体放射出星体丝（又叫纺锤丝），即放射状微管。带有星体丝（纺锤丝）的两个中心体逐渐分开，移向相对的两极（图1）。这种分开过程推测是由于两个中心体之间的星体丝（纺锤丝）微管相互作用，更快地增长，结果把两个中心体（两对中心粒）推向两极，而于核膜破裂后终于形成两极之间的纺锤体。

前中期

自核膜破裂起到染色体排列在赤道面上为止。核膜的断片残留于细胞质中，与内质网不易区别，在纺锤体的周围有时可以看到它们。前中期的主要过程是纺锤体的最终形成和染色体向赤道面的运动。纺锤体有两种类型：一为有星纺锤体，即两极各有一个以一对中心粒为核心的星体，见于绝大多数动物细胞和某些低等植物细胞。一为无星纺锤体。两极无星体，见于高等植物细胞。曾经认为有星纺锤体含有三种纺锤丝，即三种微管。一种是星体微管，由星体散射出的微管；二是极微管，是由两极分别向相对一级方向伸展的微管，在赤道区来自两极的极微管互相重叠。认为极微管可能是由星体微管伸长形成的。三是着丝点微管，与着丝点联结的微管，亦称着丝点丝或牵引丝。着丝点是在染色体的着丝粒的两侧发育出的结构。有报告说着丝点有使微管蛋白聚合成微管的功能。无星纺锤体只有极微管与着丝点微管。

核膜破裂后染色体分散于细胞质中。每条染色体的两条染色单体其着丝点分别通过着丝点与两极相连。由于极微管和着丝微管之间的相互作用，染色体向赤道面运动。最后各种力达到平衡，染色体乃排列到赤道面上。

中期 （metaphase）

从染色体排列到赤道板上，到它们的染色单体开始分向两极之前，这段时间称为中期。有时把前中期也包括在中期之内。中期染色体在赤道面形成所谓赤道板。从一端观察可见这些染色体在赤道板呈放射状排列，这时它们不是静止不动的，而是处于不断摆动的状态。中期染色体浓缩变粗，显示出该物种所特有的数目和形态。因此有丝分裂中期适于做染色体的形态、结构和数目的研究，适于核型分析。中期时间较长。

后期 （anaphase）

每条染色体的两条姊妹染色单体分开并移向两极的时期。分开的染色体称为子染色体。子染色体到达两极时后期结束。染色单体的分开常从着丝点处开始，然后两个染色单体的臂逐渐分开。当它们完全分开后就向相对的两极移动。这种移动的速度依 细胞种类而异，大体上在0.2～5微米/分。平均速度约为为 1微米/分。同一细胞内的各条染色体都差不多以同样速度同步地移向两极。子染色体向两极的移动是靠纺锤体的活动实现的。

末期 （telophase）

从子染色体到达两极开始至形成两个子细胞为止称为末期。此期的主要过程是子核的形成和细胞体的分裂。子核的形成大体上是经历一个与前期相反的过程。到达两极的子染色体首先解螺旋而轮廓消失，全部子染色体构成一个大染色质块，在其周围集合核膜成分，融合而形成子核的核膜，随着子细胞核的重新组成，核内出现核仁。核仁的形成与特定染色体上的核仁组织区的活动有关。 细胞体的分裂称胞质分裂。动物和某些低等植物细胞的胞质分裂是以缢束或起沟的方式完成的。缢束的动力一般推测是由于赤道板的细胞质周边的微丝收缩的结果。微丝的紧缩使细胞在此区域产生缢束，缢束逐渐加深使细胞体最后一分为二。高等植物细胞的胞质分裂是靠细胞板的形成。在末期，纺锤丝首先在靠近

两极处解体消失，但中间区的纺锤丝保留下来，并且微管增加数量，向周围扩展，形成桶状结构，称为成膜体。与形成成膜体的同时，来自内质网和高尔基器的一些小泡和颗粒成分被运输到赤道区，它们经过改组融合而参加细胞板的形成。细胞板逐渐扩展到原来的细胞壁乃把细胞质一分为二（右图）。细胞质中的有关细胞器，如线粒体，叶绿体等不是均等分配，而是随机进入两个子细胞中。细胞板由两层薄膜组成，两层薄膜之间积累果胶质，发育成胞间层，两侧的薄膜积累纤维素，各自发育成子细胞的初生壁。

动植物比较

不同

动物细胞有丝分裂的过程，与植物细胞的基本相同，不同的特点是：

1.动物细胞有中心体，在细胞分裂的间期，中心体的两个中心粒各自经过中心粒复制新的中心粒，因而细胞中有两组中心粒。在细胞分裂的过程中，两组中心粒分别移向细胞的两极。在这两组中心粒的周围，发出无数条星射线,两组中心粒之间的星射线形成了纺锤体。

2.动物细胞在有丝分裂间期中心体复制，植物细胞中心体则没有复制。（高等植物没有中心体）

3.植物细胞分裂末期，在赤道板部位出现细胞板，并由中央向周围扩展形成细胞壁。动物细胞分裂末期，赤道板处细胞膜向内凹陷，缢裂成两个细胞。

有丝分裂的重要意义，是将亲代细胞的染色体经过复制（实质为DNA的复制）以后，精确地平均分配到两个子细胞中去。由于染色体上有遗传物质DNA，因而在生物的亲代和子代之间保持了遗传性状的稳定性。可见，细胞的有丝分裂对于生物的遗传有重要意义。

相同

动物细胞有丝分裂的过程与植物细胞的分裂过程存在一个十分重要的相同点：

无论是动物细胞分裂过程还是植物细胞分裂过程都会有染色体的出现和纺锤体的形成。（植物：无星射线纺锤体；动物：星射线纺锤体）。染色体复制后平均分配。