PCR,PEP,PEG分别有什么作用

根癌农杆菌介导的遗传转化法（Agrobacterium Tumefaciens-Mediated Transformation，ATMT）已被广泛地应用于丝状真菌的插入突变。以具有植物病害生物防治功能的T.harzianum LTR-2的分生孢子为实验材料，研究建立了T.harzianum的高效ATMT插入技术（李国田等，2006）。该技术无须制备原生质体，具有操作简单、转化效率高和突变体遗传稳定等特点，转化效率约为200～300个/107分生孢子。通过继代培养和PCR检测，证明T-DNA中的潮霉素抗性基因插入木霉基因组中并可以随着有丝分裂稳定遗传。South-ern 杂交分析表明，T-DNA在木霉染色体上的插入位点是随机的，并且大约有90%突变体的T-DNA 插入是单拷贝。利用上述 ATMT 突变技术，建立了T.harzianum菌株LTR-2的插入突变体库。共得到具有潮霉素抗性的突变体400余个，主要考察了以下性状的变异情况：①形态变化：大部分菌落形态变化不大，具有明显变化的约占总数的2%，分生孢子颜色也基本没有变化，仍然为绿色，T1-25 突变体产生的分生孢子为黄褐色，但后期仍然显出绿色，产孢量减少；②拮抗能力变化：突变体与立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）进行平板对峙实验，抑菌能力降低的约占28%，增强的约占56%，无变化的约占16%；③重寄生能力变化：36.2%的突变体重寄生能力减弱，其中T4-59和T4-31几乎丧失重寄生能力，51%的突变体增强。说明ATMT插入突变技术能够造成原始菌株的随机突变，是研究功能相关基因信息的有力工具，而该突变体库的构建，为研究木霉的植病生防功能基因提供了丰富的种质资源。选择重寄生能力较强、减弱和基本丧失的突变体 T2-58，T2-60，T1-25，T4-31，T4-59，以野生型LTR-2 为对照，以病原菌谷禾丝核菌（Rhizoctonia cerealis）为靶标，盆栽条件下测定了这些突变体对小麦纹枯病的生物防治活性，发现重寄生能力显著减弱的突变体 T4-59和T4-31 对小麦纹枯病的防治效果明显降低，约降低7%～13%，而重寄生能力明显增强的菌株T2-58和T2-60则对病害的防治效果明显增强，约增强10%～12%，说明木霉的重寄生能力与其生防活性密切相关。进一步的研究应利用这些突变体，探索与重寄生能力相关的基因信息。

5，6-二氢-6-戊基-2H-吡喃-2-酮（5，6-dihydro-6-penty-l2 H-pyran-2-one）是木霉菌产生的一种抗生素，具有椰子香味，生物活性高，对小麦纹枯病和棉花立枯病等多种植物病害都有显著的防治效果，因此具有很大的潜在应用价值。通过土壤杆菌介导的T-DNA转化方法，利用土壤杆菌菌株携带的Ti质粒，对绿色木霉LTR-2进行插入突变，获得木霉LTR-2突变体共400株。以串珠镰孢菌为指示菌，采用抑菌圈方法，从中筛选吡喃酮高产突变体6株，PCR和探针杂交证实，T-DNA序列已经插入木霉LTR-2基因组。经GC-MS分析发现，其中一株突变体T-54在PDA培养基上产生的吡喃酮含量较高，在分生孢子中的含量达到了2.62mg/g，比野生菌株提高9倍（扈进冬等，2010）。

利用T-DNA整合的方式，产生木霉菌突变体并进一步筛选的方式十分普遍。黄亚丽等（2010）通过对T.harzianum转化效率的因素具体研究，建立了转化效率高的体系，建立了含有8千多个转化子的突变体库。黄亚丽等（2010）还研究了整合过程中的机制，他们根据T.harzianum的基因组特点，采用12条随机的AD引物，并分别与3条右边界嵌套特异引物的组合对T.harzianum突变子的T-DNA侧翼未知序列进行扩增，选出扩增效率最高的引物AD5，对T.harzianum的52个突变子进行Tail-PCR扩增，分析扩增序列后发现，获得的42条侧翼序列中，有7条只含有质粒序列，33条为单一的侧翼序列，其余2条的序列相同。其中34条T-DNA侧翼边界序列中1/3的序列保存着完整的右边界，其余则出现了不同程度的缺失，研究说明，在农杆菌介导转化T.harzianum的过程中，会对T-DNA右边界产生一定的剪切作用。

紫外诱变和化学诱变的方法也常被用于T.harzianum 针对性性状筛选突变体系的构建。杨合同等（2004b）通过紫外线诱变处理，获得了可以在低温下（10e）生长的绿色木霉LTR-2的快速生长型突变株LR，以及对多菌灵具有抗性的突变株LRR。突变株对棉枯萎病菌、棉黄萎病菌、棉立枯病菌的平板拮抗能力一般低于野生型菌株。与野生型菌株相比，突变株在PDA平板上对棉花立枯病菌、枯萎病菌和黄萎病菌的抑菌圈都有变化，但是多数情况下抑菌圈变小而不是变大。LRR虽然对棉枯萎病菌和黄萎病菌的抑菌圈也较小，但是对两种病害的防治效果却略有提高。LR比LTR-2更能适合非根际土壤环境，而LRR在健康棉花根际的定殖能力上，比LTR-2有明显下降。LR对棉花立枯病基本没有防治效果，但对棉花黄萎病和枯萎病的防治效果则高于原始菌株；LRR对棉花上述3种病害的防治效果与原始菌株没有明显的差异。在PDA、玉米琼脂和NA平板上菌株LR生长速度最快，而LRR则与野生型菌株LTR-2没有明显差别。除了突变株LR在非根际土壤中的定殖能力有所提高以外，其他突变株的根际定殖能力没有明显改善，LRR定殖能力反而明显下降。该研究一方面表明紫外线诱变后目标性状变化的随机性，另一方面也说明定殖能力与抗药性间没有必然关系。紫外线诱变处理所获得的新性状容易消失，但也能够得到稳定的突变株。对木霉来说，紫外线诱变仍然是值得利用的菌株改良技术，在扩大突变体筛选基数的基础上，能够获得所需要的突变株。

Hassan等（2005）将 T.harzianum 暴露于伽马射线中，诱导两株耐盐突变菌——Th50M6h和Th50M11。在盐胁迫条件下，两株突变体的生长能力、孢子形成能力、拮抗病原菌能力均远超野生型。

安哲宇等（2010）通过紫外诱变和含药培养基诱导相结合的方法，获得了一株对三唑类杀菌剂有良好耐药性的T.harzianum的突变体，TUV-13。其抗药性为野生菌株的10倍，不同世代中的抗性比较稳定，且与原始菌株存在差异。该菌株可定殖于植物体内，植株生长产生正效应。杨春林等（2010）同样采用紫外线诱变与药剂培养驯化相结合的方法，构建了以T.harzianum Th-30为原始菌株的突变体。他们共得到4株可以比正常菌株耐受10倍福美双的变异菌株。其中，变异菌株UV-4不仅能抵抗高浓度福美双的胁迫作用，还具有几丁质酶活性。该菌株遗传性状稳定，具有福美双混用协同防治蔬菜真菌病害的功效。Zhang等（2013）的研究切入点侧重在突变体木霉对作物的促生效果上。研究通过紫外线诱变的方法从亲本SQR-T037菌株中得到124株突变体后代，并从中选择了拮抗植物病原菌能力较强的T-E5进行下一步的研究。他们比较了T.harzianum突变体菌株T-E5与野生型菌株SQR-T037，同时以施用有机肥料作为对照。研究中包括实验室和黄瓜温室试验，即对液体发酵液中植物激素的产出、对植物生长的促生能力和在植物根系根围的定制能力进行了分析评定。结果显示，T-E5相对SQR-T037，在植物生长素IAA的效率指标中提高了30.2%；相应的，T-E5处理显著提高了黄瓜无论在土壤栽培还是水培条件下的生物量。通过RT-PCR检测，在培养30d后，突变体T-E5在土壤样品中的定殖量几乎超过SQR-T037的10倍。两菌株在植物根茎内的定殖速率几乎是一致的；但每个取样时间中T-E5的定殖率均高于野生型的SQR-T037。

木霉属内及与其他真菌之间的原生质体融合，可为T.harzianum获得更多的性状功能。杨合同等（2005）以产孢量大，对苯菌灵有抗性，对潮霉素B敏感的T.harzianum菌株T9和产孢量少，对潮霉素B有抗性，对苯菌灵敏感的康宁木霉Tk7a为亲本，通过原生质体融合，筛选获得抗最高浓度杀菌剂的融合子。融合子产孢量高于Tk7a，水解酶活性比双亲号，并且在根际的竞争能力比T9强。张彩霞等（2004）对不同属间原生质体融合进行了成功尝试，他们构建了T.harzianum与链霉菌菌株原生质体融合技术。具体过程为将T.harzianum T-23与链霉菌菌株A分别以庆大霉素和50-53 e热灭活120min作为遗传标记。常规的聚乙二醇（PEG）作为融合系统的促融剂，通过调整PEG的最佳分子量及浓度和处理时间，最终确定0.05mol/L Ca2+的35%PEG6000为最佳融合系统，处理时间为15min。经过融合系统处理产生的融合子再经选择再生培养基培养后，筛选形状稳定的融合子。Srinicasan等（2009）希望通过原生质体融合的方法同时提高木霉中纤维素酶和几丁质酶的含量。在他们的研究报告中，为了构建一株既含有上述双酶特性的独一无二的高效菌株，尝试整合高纤维素酶产出活性的一株里氏木霉和高几丁质酶产出活性的一株T.harzianum的原生质体。他们利用细胞溶解酶分别从16株T.harzianum和里氏木霉中分离得到了原生质体。原生质体融合系统采用的常规的PEG作为助融剂。融合反应共获得20个生长效率高的融合子，紧接着通过抗性培养筛选，选出了六株具有良好的生长活性和拮抗活性的菌株。这六株筛选菌株自身也显示了多层次的形态多样性，包括菌丝发育、菌落颜色、分生孢子形成模式和孢子染色等。除了差异外，六个融合菌株仍具有与原始菌株相同的某些形态特征。他们进一步通过PCR-PFLP验证了融合子具有原始菌株双亲的特征指纹条带。从生长特性上看，三世代后，融合子后代的生长速率超过亲本的60%～70%。更重要的是，融合子菌株比双亲菌株提高了40%～50%纤维素酶活性和10%～20%几丁质酶的活性，并且具有高于双亲7%～8%的生物拮抗活性。

Herrera等（2012）比较了T.harzianum突变菌株和野生型菌株对杀菌剂敏感性的不同。他们将野生型T.harzianum（Th11，Th12和Th650）和突变体T.harzianum（Th11 A80.1，Th12 A10.1和Th650-NG7）同时暴露在不同的商用杀菌剂中进行研究。研究结果显示，所有的野生和突变体菌株均能在含有浓度为1700mg/L戊菌隆的条件下出芽。野生型菌株Th12和Th650及对应的突变体菌株Th12 A10.1和Th650-NG7均对不同浓度梯度的扑海因和代森锰有药敏反应。这些研究成果为T.harzianum特定突变体菌株在实际作用时，可否与抗菌剂联合施用，可施用的范围、水平等做了有意义的评估工作。

基因工程的概念

基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。

（一）基因工程的基本工具

1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）

（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。

（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。

（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。

2.“分子缝合针”——DNA连接酶

(1)两种DNA连接酶（E•coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：

①相同点：都缝合磷酸二酯键。

②区别：E•coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。

(2)与DNA聚合酶作用的异同:¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。

3.“分子运输车”——载体

（1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。

②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。

③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

（2）最常用的载体是¬¬质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。

（3）其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒

(二)基因工程的基本操作程序

第一步：目的基因的获取

1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。

2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。

3.PCR技术扩增目的基因

（1）原理：DNA双链复制

（2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。

第二步：基因表达载体的构建

1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。

2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因

（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。

（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。

（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。

第三步：将目的基因导入受体细胞_

1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2.常用的转化方法：

将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和 花粉管通道法等。

将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵。

将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ，最常用的原核细胞是 大肠杆菌 ，其转化方法是：先用 Ca2+ 处理细胞，使其成为 感受态细胞 ，再将 重组表达载体DNA分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。

第四步：目的基因的检测和表达

1.首先要检测 转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子杂交技术。

2.其次还要检测 目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用 用标记的目的基因作探针与 mRNA杂交。

3.最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取 蛋白质，用相应的 抗体进行抗原－抗体杂交。

4.有时还需进行 个体生物学水平的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。

（三）基因工程的应用

1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。

2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。

3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。

（四）蛋白质工程的概念

蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）

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专题2 细胞工程

（一）植物细胞工程

1.理论基础（原理）：细胞全能性

全能性表达的难易程度：受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；植物细胞＞动物细胞

2.植物组织培养技术

（1）过程：离体的植物器官、组织或细胞 ―→愈伤组织 ―→试管苗 ―→植物体

（2）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。

（3）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。

3.植物体细胞杂交技术

（1）过程：

（2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。

（3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。

（二）动物细胞工程

1. 动物细胞培养

（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。

（2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。

（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。

（4）动物细胞培养需要满足以下条件

①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。

②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。

③温度：适宜温度：哺乳动物多是36.5℃＋0.5℃；pH：7.2～7.4。

④气体环境：95%空气＋5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。

（5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。

2.动物体细胞核移植技术和克隆动物

（1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。

（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营养丰富。

（3）体细胞核移植的大致过程是：（右图）

核移植

胚胎移植

（4）体细胞核移植技术的应用：

①加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育； ②保护濒危物种，增大存活数量；

③生产珍贵的医用蛋白；④作为异种移植的供体；

⑤用于组织器官的移植等。

（5）体细胞核移植技术存在的问题：

克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。

3.动物细胞融合

（1）动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。

（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。

（3）动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。

（4）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：

比较项目 细胞融合的原理 细胞融合的方法 诱导手段 用法

植物体细胞杂交 细胞膜的流动性 去除细胞壁后诱导原生质体融合 离心、电刺激、振动，聚乙二醇等试剂诱导 克服了远缘杂交的不亲和性，获得杂种植株

动物细胞融合 细胞膜的流动性 使细胞分散后诱导细胞融合 除应用植物细胞杂交手段外，再加灭活的病毒诱导 制备单克隆抗体的技术之一

4.单克隆抗体

（1）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。

（2）单克隆抗体的制备过程

（3）杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。

（4）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。

（5）单克隆抗体的作用：

① 作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。

② 用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。

专题3 胚胎工程

（一）动物胚胎发育的基本过程

1、胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。

2、动物胚胎发育的基本过程

（1）受精场所是母体的输卵管上段。

（2）卵裂期：特点：细胞有丝分裂，细胞数量不断增加，但胚胎的总体体积并不增加，或略有减小。

（3）桑椹胚：特点：胚胎细胞数目达到32个左右时，胚胎形成致密的细胞团，形似桑椹。是全能细胞。

（4）囊 胚：特点：细胞开始出现分化（该时期细胞的全能性仍比较高）。聚集在胚胎一端个体较大的细胞称为内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织。中间的空腔称为囊胚腔。

（5）原肠胚：特点：有了三胚层的分化，具有囊胚腔和原肠腔。

（二）胚胎干细胞

1、哺乳动物的胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或从原始性腺中分离出来。

2、具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上，具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。

3、胚胎干细胞的主要用途是：

①可用于研究哺乳动物个体发生和发育规律；

②是在体外条件下研究细胞分化的理想材料，在培养液中加入分化诱导因子，如牛黄酸等化学物质时，就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化，这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段；

③可以用于治疗人类的某些顽疾，如帕金森综合症、少年糖尿病等；

④利用可以被诱导分化形成新的组织细胞的特性，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能；

⑤随着组织工程技术的发展，通过ES细胞体外诱导分化，定向培育出人造组织器官，用于器官移植，解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。

（三）胚胎工程的应用

1.体外受精和胚胎的早期培养

(1)卵母细胞的采集和培养：

主要方法：用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后，从输卵管中冲取卵子，直接与获能的精子在体外受精。第二种方法：从刚屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞；第三种方法是借助超声波探测仪、腹腔镜等直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。采集的卵母细胞，都要在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精。

(2) 精子的采集和获能：在体外受精前，要对精子进行获能处理。

(3) 受精：获能的精子和培养成熟的卵细胞在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。

(4)胚胎的早期培养：精子与卵子在体外受精后，应将受精卵移入发育培养液中继续培养，以检查受精状况和受精卵的发育能力。培养液成分较复杂，除一些无机盐和有机盐外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等物质。当胚胎发育到适宜的阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存。不同动物胚胎移植的时间不同。(牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植，小鼠、家兔等实验动物可在更早的阶段移植，人的体外受精胚胎可在8~16个细胞阶段移植。)

2.胚胎移植

(1)胚胎移植是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其它方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其它雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体称为“供体”，接受胚胎的个体称为“受体”。（供体为优良品种，作为受体的雌性动物应为常见或存量大的品种。）

地位：如转基因、核移植，或体外受精等任何一项胚胎工程技术所生产的胚胎，都必须经过胚胎移植技术才能获得后代，是胚胎工程的最后一道“工序”。

(2) 胚胎移植的意义：大大缩短了供体本身的繁殖周期，充分发挥雌性优良个体的繁殖能力。

(3) 生理学基础：①动物发情排卵后，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。

②早期胚胎在一定时间内处于游离状态。这就为胚胎的收集提供了可能。

③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。这为胚胎在受体的存活提供了可能。

④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。

(4) 基本程序主要包括：

①对供、受体的选择和处理。选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体，供体和受体是同一物种。并用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理。

②配种或人工授精。

③对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后第7天，用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来(也叫冲卵)。对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段。直接向受体移植或放入－196℃的液氮中保存。

④对胚胎进行移植。

⑤移植后的检查。对受体母牛进行是否妊娠的检查。

3.胚胎分割

(1)概念：是指采用机械方法将早期胚胎切割2等份、4等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。

(2)意义：来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，属于无性繁殖。

(3)材料：发育良好，形态正常的桑椹胚或囊胚。（桑椹胚至囊胚的发育过程中，细胞开始分化，但其全能性仍很高，也可用于胚胎分割。）

(4)操作过程：对囊胚阶段的胚胎分割时，要将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。

专题4 生物技术的安全性和伦理问题

（一）转基因生物的安全性争论 ：

(1)基因生物与食物安全：

反方观点：反对“实质性等同”、出现滞后效应、出现新的过敏原、营养成分改变

正方观点：有安全性评价、科学家负责的态度、无实例无证据

(2)转基因生物与生物安全：对生物多样性的影响

反方观点：扩散到种植区之外变成野生种类、成为入侵外来物种、重组出有害的病原体、成为超级杂草、有可能造成“基因污染”

正方观点：生命力有限、存在生殖隔离、花粉传播距离有限、花粉存活时间有限

(3)转基因生物与环境安全：对生态系统稳定性的影响

反方观点：打破物种界限、二次污染、重组出有害的病原微生物、毒蛋白等可能通过食物链进入人体

正方观点：不改变生物原有的分类地位、减少农药使用、保护农田土壤环境

（二）生物技术的伦理问题

(1)克隆人：两种不同观点，多数人持否定态度。

否定的理由：克隆人严重违反了人类伦理道德，是克隆技术的滥用；克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统的伦理道德观念；克隆人是在人为的制造在心理上和社会地位上都不健全的人。

肯定的理由：技术性问题可以通过胚胎分级、基因诊断和染色体检查等方法解决。不成熟的技术也只有通过实践才能使之成熟。

中国政府的态度：禁止生殖性克隆，不反对治疗性克隆。四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人的实验。

(2)试管婴儿：两种目的试管婴儿的区别两种。不同观点，多数人持认可态度。

否定的理由：把试管婴儿当作人体零配件工厂，是对生命的不尊重；早期生命也有活下去的权利，抛弃或杀死多余胚胎，无异于“谋杀”。

肯定的理由：解决了不育问题，提供骨髓中造血干细胞救治患者最好、最快捷的方法，提供骨髓造血干细胞并不会对试管婴儿造成损伤。

(3)基因身份证：

否定的理由：个人基因资讯的泄漏造成基因歧视，势必造成遗传学失业大军、造成个人婚姻困难、人际关系疏远等严重后果。

肯定的理由：通过基因检测可以及早采取预防措施，适时进行治疗，达到挽救患者生命的目的。

（三）生物武器

(1)种类：致病菌、病毒、生化毒剂，以及经过基因重组的致病菌。

(2)散布方式：吸入、误食、接触带菌物品、被带菌昆虫叮咬等。

(3)特点：致病力强、多数具传染性、传染途径多、污染面广、有潜伏期、不易被发现、危害时间长等。

(4)禁止生物武器公约及中国政府的态度。

医药股有上海医药集团股份有限公司 ，北京四环生物制药有限公司，中国医药集团总公司，江苏联环药业股份有限公司，沃华医药。

1、上海医药集团股份有限公司（以下简称公司）（港交所股票代号：02607；上交所股票代号：601607）是一家总部位于上海的全国性国有控股医药产业集团。公司主营业务覆盖医药研发与制造、分销与零售全产业链。

根据2013年中国企业联合会评定的中国企业500强排名，公司综合排名位居全国医药行业第二，是中国为数不多的在医药产品和分销市场方面均居领先地位的医药上市公司，入选上证180指数、沪深300指数样本股，H股入选恒生指数成分股、摩根斯坦利中国指数（MSCI）。

2、北京四环生物制药有限公司始建于1988年，股票代码为000518，简称“四环生物”，是我国最早从事基因工程药品和诊断试剂的研究、中试、生产和销售，集科、工、贸为一体的高新技术企业，也是我国最早的基因工程药物产业化基地之一。

3、中国医药集团有限公司是由国务院国资委直接管理的中国规模最大、产业链最全、综合实力最强的医药健康产业集团。以预防治疗和诊断护理等健康相关产品的分销、零售、研发及生产为主业。

旗下拥有11家全资或控股子公司和国药控股、国药股份、天坛生物、现代制药、一致药业5家上市公司。2003-2011年，集团营业收入年平均增幅33%，利润总额年平均增幅44%，总资产年平均增幅35%。2012年实现营业收入超过1600亿元，是中国唯一一家超千亿医药健康产业集团。

4、江苏联环药业股份有限公司是一家制造和销售化学原料药、化学药制剂及有机中间体的股份制医药企业，2003年3月4日，经中国证券监督管理委员会批准，在上海证券交易所公开发行A股股票2000万股，并于3月19日成功上市，股票简称：联环药业，股票代码：600513。

5、沃华医药于1959年1月在万和堂药庄中药加工部与山东省昌潍中心药材公司饮片加工组的基础上，组建了山东省潍坊中药厂。

2002年2月改制为潍坊沃华医药科技有限公司。2007年1月24日公司股票正式在深圳证券交易所挂牌上市，成为潍坊市首家上市的医药企业，2008年8月8日，沃华医药股票成功定向增发。

参考资料来源：百度百科-上海医药集团股份有限公司

参考资料来源：百度百科-北京四环生物制药有限公司

参考资料来源：百度百科-中国医药集团总公司

参考资料来源：百度百科-江苏联环药业股份有限公司

参考资料来源：百度百科-沃华医药

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