铜催化剂，用对硝基苯甲醛和苯酚反应,碳酸铯作为强碱,DMF为溶剂,高温生成对苯氧基苯甲醛是什么反应

（一）：对甲基苯酚，苯甲酮和氯苯三者中只有对甲基苯酚显弱酸性，因此三者的混合物可放在分液漏斗中先用碳酸钠水溶液洗涤（以少量多次为原则），对甲基苯酚与碳酸钠反应变成钠盐溶于水而进入水相（水层）后与仍处于有机相（有机层）的苯甲酮和氯苯在分液漏斗中分开，水相用稀盐酸酸化后，再用乙醚萃取就得到了含纯的对甲基苯酚的乙醚溶液，旋转蒸发除去乙醚即获得纯的对甲基苯酚。

（二）：根据苯甲酮和氯苯的极性区别，用薄层色谱(TLC)估算极性大小差别，再用层析色谱柱进行分离，用大约30% - 50%乙酸乙酯/石油醚洗脱即可，用TLC进行跟踪。

我们老师也是这样耶，

个人看法：1、先加三氯化铁，绛紫色化合物则为苯酚或乙酰乙酸乙酯，接着加2,4-二硝基苯肼，褪色则为苯酚，不退色为三乙；

2、加入氢氧化铜，呈深蓝色则为甘油，否则为剩下的

3、加入碘-碘化钾，碘仿反应，呈黄色为乙醛，有黄色沉淀生成为丙酮，异丙醇为浑浊现象，既有晶体析出但比丙酮少（热水浴后现象更明显），这个现象是今天做实验时的，不一定和书上一样哦，参考着用吧。

中药产业现代化发展的瓶颈是质量不可控、安全不可靠。安全不可靠是指中药重金属、农药、微生物、化学物质的污染。中药质量控制虽有《中国药典的质量标准模式和指标》规定，但与国外的植物药药典一样，均是模仿化学药品的质量控制模式，选定l～2个有效成分、活性成分或指标成分进行鉴别和含量测定，对整体而言，中药的质量仍不可控。然而这种以单一化学成分分析的观点，导致人们力求把中药(天然药物)这一综合而复杂的“整体”分解成便于观察和研究的简单“单元”或“分子”，以便于清楚明确地研究。沿着这条思路，分析工作者力求运用各种分析检测手段测定某种有效成分或单一活性成分含量的多少，以此来判断某种药材的质量，对复方制剂也以同样的观点和方法制定其质量标准。 中药指纹图谱是指某种(或某产地)中药材或中成药中所共有的、具有特征性的和某类或几类成分的色谱或光谱组成的图谱。其特点是：(1)通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别样品的真伪；(2)通过制订指纹图谱特征峰的面积和比例，能有效控制样品质量，保证样品质量的相对稳定。目前指纹图谱已成为国际公认的控制中药或天然药材质量的最有效手段。 1 各种中药指纹图谱 1．1 薄层色谱(TLC)指纹图谱 TLC具有检测快速、经济、结果可靠、操作简单、适用范围广、重现性好等优点，很快为国内外学者接受。胡惠平等采用高效薄层扫描法测定香砂养胃不同剂型中厚朴酚与和厚朴酚的总含量，不同生产厂家的香砂养胃丸剂、胶囊剂和冲剂中厚朴酚与和厚朴酚总量的测定结果差异较大，说明市场上的香砂养胃制剂质量不一，其总含量可以作为该药品的质量控制指标之一。颜玉贞用经过优化的溶剂系统在双槽展开箱中用硅胶薄层板作两次展开，对黄连所含原小檗碱型生物碱进行薄层色谱分离，在控制条件下得到的黄连样品(商品)TLC中可检出包括微量生物碱在内的9～11个斑点，其荧光及紫外扫描图可作为黄连药材的指纹图谱，以此确定不同黄连样品中主要生物碱的分布。 1．2 高效液相色谱(HPLC)指纹图谱 HPLC具有分离效能高、分析速度快等优点，近来已普及用于中药的定量分析。张亮等采用RP-HPLC法对六味地黄丸缺味药模拟方的浸出物进行指纹分析，选取9个色谱峰的峰面积与内标峰面积之比值作为样本特征变量，通过贝叶斯(Bayers)法和 PRIMA(Pattern Recognition by Indeperdent Multicategory Analysis)法对六味地黄丸3种缺味药进行了准确识别。陶巧凤等通过分析各国药典现行庆大霉素C组分的HPLC方法，考察了流动相醇水比例、离子对试剂浓度、待测溶液的稳定性等因素，对庆大霉素C组分保留行为的影响建立的梯度洗脱HPLC法，30 min内即可使庆大霉素c组分与相邻各峰获得良好分离，适于常规分析，并为庆大霉素产品的质量控制及其质量标准的改进，提供了新的有效手段。 1．3 气相色谱(GC)指纹图谱 GC具有高效、高选择性、高灵敏度、用量少和分析速度快等优点。岑路等用GC分析法测定乌蛇止痒丸中蛇床子素的含量，共测定了5个不同批号产品。对于中药复方制剂，冯毅凡等对华佗再造丸及其主要药味的石油醚提取液进行了GC分析，获取了其指纹特征，以此作为该制剂及其原料药真伪鉴别的依据，并进一步采用特征指标均值偏移度法对其质量进行了评价。 1．4 高效毛细管电泳(HPCE)指纹图谱 HPCE技术在药材鉴定中的应用是近年发展起来的方法。20世纪90年代以来，日本和我国台湾、香港学者较早应用HPCE开展中药化学成分分析研究，均认为HPCE有高效、快捷、微量、可自动化等特点，对于成分复杂的中药尤为适用，宜应用于大量药材的品质评价。 1．5 紫外光谱(UV)指纹图谱 由于不同中药所含成分的不饱和程度有差异，因而导致其紫外吸收曲线的形态峰位、峰强度亦有差异，以此可达鉴别的目的。孙世康等用紫外分光光度法对3个厂家9批沙棘颗粒进行了总黄酮含量测定，结果显示产品含量波动较大，证实沙棘黄酮含量在投料前处于失控状态，提出了含量下限质量控制标准。李月雄等利用UV对参芪注射液进行含量测定，实验表明，鞣质是注射液的无效成分，参芪注射液不含鞣质，且性质稳定；从光谱分析得知丹参有效成分丹参素、黄芪为多种氨基酸；丹参提取液、参芪注射液在(280±1)nm处均有最大吸收，用丹参素为标准品制定标准曲线，并以黄芪注射液为空白，可消除黄芪成分的干扰，方法简便可行。 1．6 红外光谱(IR)指纹图谱 IR是对整个化合物分子的鉴别，比单纯的功能团的化学定性鉴别专一性更强。中药材的IR是混合物中各组分IR的叠加，只要各组分在质和量方面相对稳定，并且样品处理方法按统一要求进行，则其IR也应相对稳定。彭国平等用IR测出23一乙酰泽泻醇 B为泽泻的主要有效成分，成分专属性好，检测方法可靠，且在药材中基本稳定；23一乙酰泽泻醇B的含量能体现药材的优劣并区别于混淆品。田进国等认为同一产地不同采集时问的全叶延胡索的IR轮廓特征是比较稳定的，光谱局部因某些峰相对峰强度的不同而有所变化。 1．7 核磁共振(NMR)指纹图谱 NMR指纹法鉴定植物类中药是根据对鉴定方法的要求、NMR图谱的特点和两个假设建立起来的。NMR图谱具有单一性、全面性、定量性、易辨性的特点，假设是以一定的程序可获取植物类中药的特征性化学成分(或化学成分组)的总提取物，同时这些特征性化学成分的含量是相对固定的。因此在规范的提取分离程序下，植物类中药的NMR图谱与植物品种间存在严格的对应关系，没有混淆的可能。 1．8 质谱(MS)指纹图谱 将中药提取液置于质谱仪中进行电子轰击电离，可获得提取液中化学成分的El-MS图。不同中药提取液所含成分不同，所得质谱图显示的分子、离子峰及进一步的裂解碎片峰亦不一样，故可资鉴别。由于老龙皮的质量可以从外观判断，但为便于人药后亦能控制其质量，了解其主要成分，可用GC-MS进行测定：老龙皮脂溶性部分共分离出34个组分，鉴定出19个化合物，已鉴定出的化合物中含量较大的有2，6-二(1，l-二甲基乙基)，4-甲基苯酚等。这为老龙皮药材及其成分制剂的质量控制建立了初步的鉴定方法。 1．9 X-射线衍射指纹图谱 x射线衍射是研究物质的物象的晶体结构的主要方法，如果该物质是一种混合物，则衍射分析法快具有速简便、图谱稳定、可靠、指纹性强并能立即得知样品组分的特点。 1．1 0 DNA指纹图谱 现代分子生物学研究发现，中药材(不含矿物药)所依赖的生物资源—物种的多样性可在分子水平上检测，它比形态、组织和化学水平上检测更能代表其变异的遗传标记。近年来，国内外学者共同致力于运用分子生物学的方法对中药进行研究，其中基因分析技术在中药分类、鉴别、资源利用等方面的应用是目前最令人鼓舞的进展之一。通过基因工程的分析手段来获得中药的DNA指纹图谱，将中药的分子标识准确地鉴别出来，建立生物质量标准，同时为今后分离有重要价值的药用植物目的基因，进而为构建药物基因库提供资料，具有广阔前景。 2 指纹图谱应用于中药质量控制的局限性 2．1 中药化学成分的不确定性 与西药不同，大部分中药的化学成分不完全明确，其中已知的化学成分往往不能显示中药的全部疗效，因此采用化学分析的方法问接地控制中药质量存在着许多困难。就此而言，中药指纹图谱质量控制方法与传统中药质量控制方法面临着同样的问题。虽然中药指纹图谱在实现物质群体整体性控制方面具有某些优点，但其应用于中药质量控制还存在着局限性。 2．2 指纹图谱与药理作用的相关性 建立中药标准与药理作用之间的相关性一直是中药研究工作努力的目标。中药指纹图谱质量控制方法采用被认定合格的产品 (最终产品、中间产品或原料)的指纹图谱质量控制方法被认为完整地控制了中药的物质群体。然而，指纹图谱与药理作用之间的相关性仍是模糊的，人们无法从指纹图谱中解析某一峰或某一段峰所代表的药理作用。 2．3 指纹图谱与化学成分的相关性 中药指纹图谱质量控制方法的局限性还表现在指纹图谱与化学成分之间缺乏相关性，这主要是由于指纹图谱中色谱峰纯度不高所致。单味药材的化学成分十分复杂，而复方中成药化学成分之间的交叉和相互影响更增加了分析结果的不确定性。 2．4 指纹图谱与实验条件的一致性 中药指纹图谱质量控制方法采用标准指纹图谱作为比对标准，可以因此省去对照品和对照试验的麻烦，这是该方法的一个优点。但是，缺少对照品和对照试验又无法保证获得标准指纹图谱实验条件与测定样品的实验条件的一致性，两者之间的差异可能使实验方法的重现性受到影响。 3 结语 中药走向世界，质量保证是一个极其重要的方面。由于中药来源复杂，涉及不同种类和掺伪品，即便是同种正品也会因生长地域、采集时间、加工甚至贮存条件不同引起成分组成和含量的变化，同时仪器分析的规范性、重现性也至关重要，方法的代表性、普遍性问题也需要认真考虑。结合不同的分析手段，与计算机技术联用，建立不同品种中药材的标准图谱库和数据库，是一项大量而细致的工作，这将对中药品种鉴定和质量控制起到积极的作用。

硫酸粘杆菌素最近EP标准(EP4.6)

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定义：

本品为特定的多粘芽孢菌变种粘杆菌素菌种制成或由其它方法获得的聚缩氨硫酸酸盐混合物。

含量：以干品计、Colistin E1,E2,E3各E1-I和E1-7MOA的总含量不低于77.0%。

以干品计，Colistin E1-I不高于10.0%。

以干品计，Colistin E1-7MOA不高于10.0%。

以干品计，Colistin E3不高于10.0%。

性状：

本品为白色或类白色粉末，有吸湿性，易溶于水，微溶于酒精，几乎不溶于丙酮和乙醚。

鉴别：

首要鉴别法：B、E

次要鉴别法：A、C、D、E

A 用薄层色谱法检查（2.2.27）

供试溶液：

将5mg待检物质溶于1ml盐酸和水（等量混合）的混合液中，置于封闭管中于135℃下加热5小时。水浴中蒸发到干燥，继续加热至湿润的蓝色石蕊试纸不再变红。将残渣溶于0.5ml的水中。

.参比溶液（a）：将20mg亮氨酸溶于水中，并用相同的溶剂稀释至10ml。

.参比溶液（b）：将20mg苏氨酸溶于水中，并用相同的溶剂稀释至10m。

.参比溶液（a）：将20mg苯丙氨酸溶于水中，并用相同的溶剂稀释至10m。

.参比溶液（d：）将20mg丝氨酸溶于水中，并用相同的溶剂稀释至10m。

板：TLC硅胶G板

流动相：水，苯酚（25：75V/V）

避光进行以下操作程序：

点样：5ul点样成10mm带状

将板置于色谱溶器中，使其不与流动相接触，注入蒸汽至少12小时。

展开：展开超过12cm长,

干燥：100~105℃烘干，

检测：用茚三酮溶液喷涂，于100℃下加热5分钟。

结果：供试溶液的色谱中显示出于参比溶液(a)和参比溶液(b)所得色谱相对应的区域，但没有显示出参比溶液(c)和(d)的区域，供试溶液中还显示了很低的RF值（2，4－二氨丁酸）。

B 检查所得色谱的含量

结果：在供试溶液的色谱中得到的ColistinE1和ColistinE2的峰的保留时间与在参比溶液（a）的色谱中对照的峰是相似的。

C 将5mg溶解于3ml的水中，加入3ml稀氢氧化钠溶液，加入0.5mL10g/1的硫酸铜溶液，有紫色产生。

D 将约50mg溶解于1mL1M的盐酸中，并加入0.5mL0.01M的碘，溶液颜色不变。

E 本品显硫酸盐的特征反应。

测试：

PH：4.0~6.0

溶解0.1g无二氧化碳的水中，并用相同的溶剂稀释至10ml。

比旋度：－63~－73（干品）

溶解1.25g于水中，并用相同的溶剂稀释至25ml。

有关物质：液相色谱法（2.2.29），使用归一法。

供试溶液：将25.0mg样品溶于40ml的水中，并用乙腈稀释至50.0mL。

参比溶液（a）：将25.0mg的硫酸粘杆菌素CRS溶于40ml的水中，产用乙腈稀释至50.0 mL。

参比溶液（b）：用水和乙腈的混合液（20：80）稀释至1.0ml的参比溶液（a）至1.00ml。

柱子：

――尺寸：L＝0.15m,φ=4.6mm

――固定相：色谱用顶盖十八硅烷硅胶。

――温度：30℃

流动相：22 溶积的乙腈和78溶积的以下述程序配制的溶液的混合液。

将4.46g无水硫酸钠溶于900ml的水中，加入2.5ml的磷酸，然后用水（PH2.3~2.5）稀释到100ml。

流速：1.0ml/min

检测：215nm下分光光度计检测。

运行时间：ColistinE1保留时间的1.5倍。

相对于ColistinE1（保留时间大约为16 min）的相对保留时间；

ColistinE2大约为0.45，ColistinE3大约为0.5，ColistinE1-I大约为0.8，ColistinE1-7MOA大约为1.1。

系统适应性：参比溶液（a）:

――分离度：在ColistinE3和ColistinE1之间的峰的分离不得低于8.0，在ColistinE2和ColistinE1-I之间的峰的分离不得低于6.0，在ColistinE1-I和ColistinE1之间的峰的分离不得低于2.5，在ColistinE1和ColistinE1-7MOA之间的峰的分离不得低于1.5。

――所得的色谱应该与硫酸粘杆菌素CRS的相对应。

限度：

――单杂：不高于4.0%。

――总杂：不高于23.0%。

忽略限度：参比溶液（b）色谱中ColistinE1相应峰的而积，忽略ColistinE2，E3，E1和E1-7MOA相应的峰。

硫酸盐：

以干品计，含16.0 %~18.0%的硫酸盐（SO4）。

将0.250g溶解于100ml的水中，用浓氨将溶液的PH值调至11，加10.0mL0.1M的氯化钡和约0.5mg的酚酞紫。用0.1M的依地酸钠滴定，当溶液的颜色开始变化时加入50ML的酒精，继续滴定直到蓝色消失。

1mL0。1M的氯化钡相当于9.606ml的硫酸盐（SO4）。

干燥失重：

减失重量不得过3.5%，取本品1g，与60℃下用五氧化二磷干燥3小时，并保持压力不超过670Pa。

硫酸盐灰粉：

取本品1.000g，灰粉不得过1.0%

含量：

液相色谱法（2.2.29），如有关物质项下所述进行，做以下修改：

注射：供试溶液和参比溶液（a）

用参比溶液（a）得到的色谱对照标准品（CRS）声明的含量来分别计算ColistinE2、E3、E1-I、E1和E1-7MOA百分含量的总和，E3的百分含量，E1-I的百分含量，E1-7MOA百分含量。

贮藏：密封，避光保存。

经过分级纯化的多糖在测定结构前须检查其纯度及测定分子量。

检查纯度最常用的判断方法：

（1）用gc、hpLc测定组成多糖的单糖的摩尔比是否恒定。

用不同的柱型测定结果更为可靠。

（2）电泳只出现一条带。

如可用聚丙烯酰胺凝胶电泳、乙酸纤维素薄膜电泳及玻璃纤维纸电泳。对于中性多糖可采用高压电泳，以硼酸盐为缓冲液，可增大其迁移速度。

（3）凝胶柱层析图呈现对称的单峰。若有“拖尾”现象，说明其均一性不够好。阴离子交换层析纯化

用DeAe一纤维素52(2.6x100cm)柱层析,0.lmol/Lnacl洗脱,流速6ml/h,按2ml一管分部收集,苯酚一硫酸法逐管检测,绘制收集体积与糖含量之间的关系曲线。看是否有单一对称峰。

按照Ye等报道,采用DeAe一52一纤维素交换柱层析法(2.6x30cm)对鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖进行初步分离。DeAe一纤维素凝胶预处理:称取DeAe一52一纤维素凝胶干粉,加入约10倍体积质量比(ml/g)的0.5mol/Lna0h溶液浸泡30分钟,倒出上清液,用大量去离子水反复浸洗至ph值近中性再用相同体积的0.5mol/LhcI溶液浸泡30分钟,倒出上清液,用大量去离子水反复浸洗至ph值近中性最后用相同体积的0.5mol/lnaoh溶液再浸泡30分钟,用大量去离子水反复浸洗至ph值中性。处理完毕后,进行湿法装柱,用去离子水0.5mol/Lnacl溶液,去离子水依次分别平衡(流速1.0ml/min)2一3个柱体积备用.

糖样100mg溶于5ml的去离子水中,离心除去不溶物,上样于DeAe一52一纤维素阴离子

-1层析柱(2.6x30cm,cl型),分别采用去离子水0.1和0.3mol/LnacI溶液进行分段梯度洗脱,

流速1.0ml/min,自动收集器分部收集(10ml/管),每梯度20管。用硫酸一苯酚法跟踪检测各管多糖含量(490nm处吸收值),以收集的管数为横坐标。吸光值(490nm)为纵坐标绘制DeAe一52一纤维素色谱柱洗脱曲线。依据洗脱峰型,合并相同组分,50℃旋转蒸发浓缩,对去离子水透析48h以去除nacI及小分子杂质,最后将透析内液冷冻干燥,得初步纯化产品。

初步纯化多糖得率计算公式:

多糖得率(%)=纯化多糖质量/粗多糖质量x100%

葡聚糖凝胶层析纯化

采用sephadexg-100凝胶层析法对DeAe-52一纤维素初步纯化的不同组分的多糖样品进一步纯化。葡聚糖凝胶(sephadexg一100)的预处理:称取sephadexg一100凝胶干粉,加入30倍体积质量比(ml/g)的去离子水,沸水浴5小时使其溶胀。冷却后用去离子水反复浸洗,减压脱气后进行湿法装柱,用0.1mna2so4溶液平衡(流速0.25ml/min)2一3个柱体积备用。

分别称取经DeAe一纤维素一52初步纯化的各多糖组分样品20mg,溶于2ml0.1mna2so4溶液中,上样于sephadexg一100层析柱(2.6x60cm)用0.1mna2so4溶液溶液洗脱,流速0.25ml/min,分步收集(5ml/管)。

用硫酸一苯酚法跟踪检测各管多糖含量(490nm处吸收值),以收集的管数为横坐标。吸光值(490nm)为纵坐标绘制sephadexg一100色谱柱洗脱曲线。依据洗脱峰型,合并相同组分,50℃旋转蒸发浓缩,对去离子水透析48h以去除na2so4及小分子杂质,最后将透析内液冷冻干燥,得不同纯化产品。

纯化多糖得率计算公式:

纯化多糖得率(%)=纯化多糖质量/粗多糖质量x100%

（鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖）

（4）纸层析法呈单一集中斑点。

取0.5%的多糖样品溶液50ul,点样于新华中速滤纸(3cmx20cm)距端点1cm处的中部,以正丁醇:浓氨水:水(4o:50:5)为展开剂,饱和2小时以上,在室温下展开6h,取出吹干,用0.5%甲苯胺蓝液染色,立即用95%乙醇漂洗至背景褪色,看是否只有一个清晰的斑点。

（5）琼脂糖(Agarose)凝胶电泳法

在琼脂糖板(厚度为0.2cm)上点样3一5ul采用浓度为0.075mol/L,ph8.6的巴比妥缓冲液,电泳1-1.5h,电压为64一80V,甲苯胺蓝(浓度为1%)染色,醋酸乙醇混合溶液(醋酸:乙醇:水=0.1:5:5)脱色。多糖纯品经电泳展开后,看是否呈现单一斑点,斑点是否清晰。

（6）紫外分光光度法

将多糖pwZ加0.9%nacI溶液溶解,配成浓度为1mg/ml的溶液,采用uV一16oA紫外可见光谱仪扫描(200nm一30onm)观察260nm、280nm处是否有吸收峰。

多糖的分子量测定：

过去用超速离心沉降法、光散射法、渗透压法、粘度法(:多糖质谱鉴定)等，这些方法操作复杂且误差较大，现已少用。现在较常用的方法有凝胶过滤法和高效凝胶液相色谱法，这两种方法须先用已知分子量的标准多糖对照测定样品的分子量。

一般来说，多糖结构分析包括以下几点：

（1）单糖组成分析：研究确定单糖的种类及摩尔比；

完全酸水解后用高效液相色谱方法(hpLc)或气相色谱方法测定。

（2）糖苷键类型：研究确定糖苷键及支链点连接位置；

甲基化分析方法

高碘酸氧化法与smith降解法

（3）糖环大小：研究确定糖苷键为呋喃糖或吡喃糖；

红外光谱

（4）异头碳构型：研究确定糖苷残基的a-或p-构型；

2DnmR.(TwodimensionalnuclearmagneticResonance)光谱分析方法测

（5）确定单糖残基和重复单元的序列

甲基化分析方法与磁共振光谱分析方法结合分析，一般会参考多糖的单糖组成及摩尔比信息以利于解析多糖结构。

高碘酸氧化法

薄层层析(TLc)——定性，

气相色谱法

（6）取代基团位点：研究0h-修饰基团的种类和取代位点，如0-磷酸化，乙丑基取代，0-

硫酷化等；

比色分析方法

（7）多糖分子量分布的研究。

紫外光谱

定性与定量方法

薄层层析：残基定性

气相色谱：残基定量

气质联用：残基定量

高效阴离子色谱法：残基定量

鉴定结构常用物理化学方法：

高效液相色谱:确定单糖组分和相对分子量

红外光谱分析:测定多糖的官能团，不仅可以检测酮糖、酵糖的耻喃糖环或呋喃糖环的构象和糖苷键的构型

核磁共振:α-构型与β-构型残基的比例；判断异头碳构型；推断主链和支链连接键型鉴定结构复合方法：

甲基化分析:推断出多糖样品中糖基的连接方式及各种连接键型的比例

高碘酸氧化法与smith降解法:判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度及支链多糖的分支数目

糖睛乙酸酷衍生物的气相色谱法:单糖组成和摩尔比

各种多糖化学结构鉴定方法的具体实施方案

1、酸水解

（1）完全酸水解

-1称取20mg样品,加入2mL2mol·L的h2so4于安培管中沸水浴水解8h,水解液用

baco3中和至ph=7,离心,取上清夜置冰箱冷藏备测。（阿魏侧耳子实体多糖分离纯化及其化学结构的初步研究）

（2）部分酸水解

称取糖样70mg，80℃条件下，0.05m三氟乙酸水解2h。降至室温后，离心（4000r/min，10min），将沉淀干燥，留做gc分析。上清用无水乙醇除酸至中性(ph为6～7)，蒸馏水透析48h：将袋外透析液浓缩，真空干燥，留做gc分析；袋内液浓缩至5ml左右，加10倍体积无水乙醇，醇沉过夜，离心(4000r/min，10min)，沉淀常规干燥，作gc分析；上清浓缩，真空干燥，留做gc分析。

2、高效液相色谱

确定样品的单糖组成

色谱条件为:

色谱柱为shodexKs804sugar(300mm×7.8mm)

柱温40度

流动相为水

-1流速0.8mL·min

检测用410RⅠ示差检测器，数据处理用810gpc软件进行。

同时用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖、岩藻糖8种单糖进

行对照,根据峰值确定样品的单糖组成。

分子量的测定以标准分子量的葡聚糖pulluan作分子量测定标准。让其通过高压液相色谱柱,条件同上,先以分子量对数与对应的保留时间作标准曲线,从标准葡聚糖pulluan的工作曲线上可以求得该成分分子量。

例如：（阿魏侧耳子实体多糖分离纯化及其化学结构的初步研究）

将水解后的多糖样品pw2进行hpLc分析,结果如表所示:阿魏侧耳子实体多糖pw2经过酸水解后,得到2种单糖:葡萄糖和半乳糖,摩尔比例1.77∶1。

例如：

4经hpLc测定后对照标准曲线得多糖pw2的分子量为3.18×10。（阿魏侧耳子实体多糖

分离纯化及其化学结构的初步研究）

4、甲基化分析

(1)基本原理

先将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化，然后将多糖中的糖苷键进行完全酸水解，水解后得到的化合物，其羟基所在的位置，即为原来单糖残基的连接点。同时根据不同甲基化单糖的比例，可以推测出此种连接键型在多糖重复结构中所占的比例。

用此种方法得到的羟基及nabh4还原醛基后产生的羟基，经乙酰化可得到甲基化的糖醇乙酸酯(此产物易挥发，可进行gc分析)，再经gc与gc-ms分析，通过气相色谱的出峰顺序和对质谱谱图的主要离子碎片的分析便可以较准确地确定糖的连接键型。

反应通式如下

:

（2)甲基化反应

取充分干燥的多糖样品10mg，溶解在2.0ml的二甲基亚矾（Dmso)中。在n2保护下快速加入干燥的naoh粉50mg，用n2排出空气，加盖密封，室温反应1.0h并间歇振荡。在n2保护下缓慢滴加碘甲烷1.0ml，用n2排出空气，加盖密封，室温继续反应1.0h并间歇振荡，反应完成后加0.5ml水终止反应。反应液先用自来水流水透析48h，再用蒸馏水透析24h，透析液冷冻干燥得第一次甲基化样品。第一次甲基化样品继续甲基化，反应步骤同上，得第二次甲基化样品。如此重复甲基化三次。甲基化后的样品用红外光谱检测，3700

cm-1—3100cm-1，附近无羟基的特征吸收峰，表明甲基化反应完全。

（3)甲基化样品的衍生化

上述完全甲基化多糖样品加入2mol/1的三氟乙酸(TFA)3.0ml,120℃密闭水解2.0h。冷却后50℃减压蒸发干，加2.0ml甲醇再蒸发干，重复三次，最后蒸发干得完全甲基化多糖的水解产物。加蒸馏水2.0ml使其溶解，再加硼氢化钠25mg，振荡后室温还原反应2.0h。反应完后滴加0.1mol/1醋酸分解过量的硼氢化钠并调ph值至5.5~7.0弱酸性。反应液50℃减压蒸发蒸干，加2.0ml甲醇再蒸干，重复三次，最后蒸发干。

上述蒸发干样品加入1.0ml醋酸酐和1.0ml吡啶，封管后在沸水浴中反应1.0h。反应液50℃减压蒸发干，加2.0ml甲醇再蒸发干，重复三次，最后蒸发干。加入丙酮1.0ml，用0.45ul尼龙微孔滤膜过滤，取样进行gc/ms分析。

(4)衍生化样品的gc/ms分析

多糖样品经甲基化、水解、还原、乙酰化后得到甲基化糖醇乙酸酯，进行gc/ms联机分析，根据文献的相对保留时间和不同单糖的主要离子碎片(m/e），推断出多糖样品中糖基的连接方式及各种连接键型的比例。

本实验采用的条件为:gc(Variancp3800型)和ms（Variansatum2200型)气相一质谱联用仪，Db-5ms石英毛细管柱(30mx0.25mmx0.25um)程序升温，初温80℃，保持1min，以8℃/min升至210℃，保持1min，再以20℃/min升至260℃,保持1min氦气作载气，进样口温度250℃，分流比1:50，柱流速1.0ml/min电子电离源(eI源)70eV，倍增器电压350V，灯丝电流250uA，接口温度260℃,离子源温度180℃，质荷比(m/z)扫描范围30~450，扫描速率2.5scan/sec。（胞式层孔菌菌丝体多糖分离纯化、结构鉴定及其生物活性研究）

流程图如下：（mAep-2a-2b是安络小皮伞菌丝体多糖的某个过程中第某个样品）

篇二：1多糖含量检测

亿信检测推出单糖组成方案

简介：gc-ms（气相质谱联用技术测定单糖组成）

1多糖含量检测

方法：苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生

没有。对氯间二甲苯酚，性质比较温和，不会对被消毒物品产生腐蚀，用起来会比较安全没有害。氯间二甲苯酚是一种广谱的防霉抗菌剂，它可广泛应用于消毒或个人护理用品、防腐剂和防霉剂等工业领域。

。调配色谱原理是溶质分子在两种不同混溶的液相即固定相和流动相之间依照它们的绝对溶解度进行分配。吸附色谱其原理是应用混合物中各组分在固定相上的吸附能力和流动相的解吸才能不同，让混合物随流动相流过固定相，发生了重复屡次的吸附和解吸进程，从而使混合物分离成两种或多种单一的纯组分。柱层析中通常是吸附色谱。

在用柱色谱分离混合物时，将已溶解的样品加入到已装好的色谱柱顶端，吸附在固定相（吸附剂）上，然后用洗脱剂（流动相）进行淋洗，流动相带着混合物的组分下移。样品中各组分在吸附剂上的吸附能力不同，一般来说，极性大的吸附能力强，极性小的吸附能力相对弱一些。且各组分在洗脱剂中的溶解度也不一样，而被解吸的能力也就不同。非极性组分由于在固定相中吸附能力弱，首先被解吸出来，被解吸出来的非极性组分随着流动相向下移动与新的吸附剂接触再次被固定相吸附。随着洗脱剂向下流动，被吸附的非极性组分再次与新的洗脱剂接触，并再次被解吸出来随着流动相向下流动。而极性组分由于吸附能力强，因此不易被子解吸出来，随着流动相移动的速度比非极性组分要慢得多（或基本不移动）。这样经由反复的吸附和解吸后，各组分在色谱柱上构成了一段一段的层带，若是有色物质，可以看到不同的色带。跟着洗脱过程的进行从柱底端流出。每一色带代表一个组分，分离收集不同的色带，再将脱洗剂蒸发，就可以得到单一的纯物质。

1、 TLC

柱层析要害在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择适当。而淋洗剂的挑选是通过TLC断定。TLC的作用除了跟踪反应过程，检测试剂和原料纯度外，一个主要的用处就是为柱层析选择适当的淋洗剂。

目标产物的Rf值在0.2～0.3左右时，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一至两倍后的溶剂。因为层析柱和薄板不同，即便两者使用的硅胶都相同，然而在把TLC剖析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释，但又不能稀释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。

须要留神的是：某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不即是在别的展开剂中也只显示一个点。因而在寻找展开剂时，多尝试多少种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开，普通以目的产物的Rf值在0.3-0.5为最佳。点不能点得太浓，否则轻易重叠不易断定，由于如果两个点相近的话，一浓就变成一个点了。板上点的展开的清楚水平跟溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关，只有两者比拟适合才干有一个较好的分离效果。

取舍适当的展开剂是重要义务，一般常用溶剂按照极性从小到大的次序排列大略为：石油醚<环已烷<四氯化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<正丙醇<乙醇<甲醇<水，单纯的展开剂一般不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂。通常使用一个高极性和低极性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增添辨别度的作用，常用的溶剂组合有：石油醚/乙酸乙酯，石油醚/丙酮，石油醚/乙醚，石油醚/二氯甲烷，乙酸乙酯/甲醇，二氯甲烷/乙酸乙酯，二氯甲烷/甲醇，氯仿/乙酸乙酯。丙酮，甲醇等溶剂需注意含水量，如含水较多可用无水硫酸镁等干燥剂处置，氯仿需使用无水氯化钙除去1％的醇。

开展剂的比例要靠尝试。良多时候，展开剂的抉择要靠本人一直变换展开剂的组成来达到最佳效果。个别把两种溶剂混合时，采取高极性/低极性的体积比为1/2-3的混杂溶剂，假如有离开的迹象，再调剂比例，到达最佳后果，如果不分开的迹象，最好是换溶剂。有些时候展开剂中参加少量的酸碱物资（乙酸、三乙胺、氨水）会起到很好的分别效果。

用TLC判定物质的纯度与含量时，往往要和其它分析手腕相联合，因为某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。产品点检测要更多地使用专用显色剂，如果仅用紫外灯，会丧失较多产品，紫外的敏锐度一般比显色剂低1-2个数目级。显色剂的使用与配制见附1。

2、装柱：

装柱一般分为湿法和干法两种，无论干法仍是湿法，固定相的上名义必定要平坦，并且固定相的高度一般为15?左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会因为扩散或拖尾导致分离效果不好。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。如果样品量在100mg以下，则能够考虑使用附2所述办法，应用薄层层析硅胶。

湿法装柱柱效比较高，合适分离少量的比较难分离的物质，一般使用200～300目的硅胶，颗粒比较粗的硅胶（200目以下）因为不易调成糊状，所以不适合湿法装柱。

在干净干燥的层析柱（无砂芯柱）下端放置少量脱脂棉，再铺约0.5?厚的石英砂或无水硫酸钠铺平，然落后行装柱。将吸附剂（氧化铝或硅胶）用洗脱剂中极性最低的洗脱剂调成糊状，在柱内先加入约3/4柱高的洗脱剂，再将调好的吸附剂边敲边倒入柱中，同时，翻开下旋活塞，在色谱柱下面放一个清洁并且干燥的锥形瓶或烧杯，接受洗脱剂。当装入的吸附剂有一度高度时，洗脱剂下贱速度变慢，待所用吸附剂全体装完后，用流下来的洗脱剂转移残留的吸附剂，并将柱内壁残留的吸附剂淋洗下来。在此过程中，应不断敲打色谱柱，以使色谱柱填充平匀并没有气泡。柱子填充完后，在吸附剂上端覆盖一层约0.5cm厚的石英砂或无水硫酸钠。笼罩石英砂或无水硫酸钠的目的是：a使样品匀称地流入吸附剂表面；b当加入洗脱剂时，它可以避免吸附剂表面被损坏。在整个装柱过程中，柱内洗脱剂的高度始终不能低于吸附剂最上端，否则柱内会出现裂缝和睦泡。

干法装柱是指将干的固定相直接倒入层析柱中，也可以先在层析柱中加入3/4的洗脱剂，而后倒入固定相。干法装柱快捷便捷，分离混合物时如无特别请求一般采用干法。

干法快速装柱一般如下操作。在清洁干燥的层析柱（无砂芯柱）下端放置少量脱脂棉，将液体出口覆盖，脱脂棉要压紧且上端平整，也可加入石英砂或无水硫酸钠使其平整。一次性加入层析需要的所有硅胶，然后再轻小扣打柱子，至硅胶界面平整且不再降落为止。然后用真空泵直接抽，可以间断的开启封闭活塞，使硅胶更密实。

干法装柱后要用洗脱剂均衡装好的层析柱，一般用低极性的洗脱剂淋洗至溶剂于硅胶之间吸附放热景象消散为止，这一点尤其在待分离物质极性比较小和对热敏感的时候无比重要。

3、上样：

上样也有干法和湿法之分。

干法就是把待分离的样品稀释后用少量溶解度较好的溶剂溶解后,骆鼎昌到军工单位，在加入恰好可以完全吸附溶剂量的硅胶，拌匀后再旋蒸去溶剂。如斯得到的粉末再警惕加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层平整。需要注意的是硅胶的用量，硅胶用量太大，样品质变多，不利于样品的分离；硅胶用量太少，如遇溶解度差的产品会梗塞全部层析柱,实行党委领导下的院长分工负责制，导致流速变慢甚至完整不流。硅胶用量一般规矩：①液体样品，称2-3倍于上样量的硅胶用于吸附样品，称10-25倍于上样量的硅胶用于填充固定相；②油状样品，称1.5-2倍于上样量的硅胶用于吸附样品，称10-25倍于上样量的硅胶用于填充固定相；③固体样品，称1-1.5倍于上样量的硅胶用于吸附样品，称10-25倍于上样量的硅胶用于填充固定相；如果极难分，也可以用50-100倍量的硅胶装柱。

湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁平均加入。然后用少量淋洗剂洗涤后，再加入。湿法较方便，少量样品一般采用此法。

4、淋洗：

淋洗剂是将分离物从吸附剂上洗脱下来所用的溶剂，所以也称为洗脱剂或简称溶剂。其极性大小和对被分离物各组分的溶解度大小对于分离效果十分重要。如要淋洗剂的极性弘远于被分离物的极性，则淋洗剂将受到吸附剂的强烈吸附，从而将本来被吸附的待分离物“顶替”下来，随过剩的淋洗剂冲下而起不到分离作用；如果淋洗剂的极性远小于各组分的极性，则各组分被吸附剂强烈吸附而留在固定相中，不能随流动相向下挪动，也不能达到分离的目的。如要淋洗剂对于被分离物各组分溶解度太大，被分离物将会过多、过快地溶解于其中并被迅速洗脱而不能很好地分离；如果溶解度太小，则会造成谱带疏散，甚至完全不能分开。常用溶剂的极性大小顺序也因所用吸附剂的品种不同而不尽相同，初步肯定后再上柱分离。如要所有色带都行进甚慢则应改用极性较大溶解机能也较大的溶剂，反之则改用极性和溶解性都较小的溶剂，直至取得满足的分离效果。

除了分离效果外还应该考虑：①在常温至沸点的温度规模内可与被分离物长期共存不产生任何化学反响，也不被吸附剂或被分离物催化而发生本身的化学反映；②沸点较低以利回收；③毒性较小，操作保险；④恰当考虑价钱是否合算，起源是否便利；⑤回收溶剂正常不应作为终极纯化产物的淋洗剂。

淋洗剂的用量往往较大，故最好使用单一溶剂以利回收。只有在选不出合适的单一溶剂时才使用混合溶剂。混合溶剂一般由两种可以无穷混溶的溶剂组成，先以不同的配比在薄层板上实验，选出最佳配比，再按该比例配制好，像单一溶剂一样使用。如要必需在层析过程中转变淋洗剂的极性，不能把一种溶剂敏捷换成另一种溶剂，而应当将极性稍大的溶剂按一定的百分率逐步加到正在使用的溶剂中去，逐渐进步其比例，直至所需要的配比。一条教训法则称为“幂指数增加”，例如，原淋洗剂为环己烷，如欲加入二氯甲烷以增长其极性，则不应即时换为二氯甲烷，而应使用这两种溶剂的混合液，其中二氯甲烷的比例顺次为5%，15%，45%，最后再换为污浊的二氯甲烷。每次加大比例后，须待流出液量为吸附剂装载体积的3倍时再进一步加大比例。这只是一般方法，其目标在于防止后面的色带前进过快，追上前面的色带，造成穿插带。但如果两色带间有很广阔的空缺带，不会造成交叉，则亦可直接换成后一种溶剂，所以应依据详细情况机动应用。

5、收集：

柱层析实际上是在扩散和分离之间的衡量。太低的洗脱强度并不好，推举用梯度洗脱。一般情况下收集的情况如下：10mg上样量，1g硅胶，0.5ml收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶，20～50ml收一馏分。详细情形要对待分离的物质决议，附2文有一定参考价值。

附1：

显色剂实用范畴及其配制方式

显色剂 适用范围 配制方法 硫酸 大部门有机物 40%体积比乙醇溶液 碘 生物碱、氨基酸、肽、脂、皂甙、不饱和或者芳香族化合物 在广口瓶中，按1：3分量比加入碘和硅胶 茚三酮 氨基酸、氨类、伯胺 1.5g茚三酮，100ml正丁醇，3ml醋酸 溴甲酚绿 羧酸，pKa<=5.0 100ml乙醇， g溴甲酚绿，滴加0.1M的NaOH水溶液，刚好出现蓝色即至。 香草醛 胺类（黄色） 15g香草醛，250ml乙醇，2.5ml硫酸 氯化铁 苯酚类 1%氯化铁的乙醇水溶液（50%） 荧光黄 芬芳族、杂环 0.05%荧光黄的甲醇水溶液（50%） 高锰酸钾 含还原性基团,情趣用品，双键、羟基、氨基、醛 1.5gKMnO4,10gK2CO3,1.25ml10%NaOH，200ml水，使用期3个月 二硝基苯肼 醛和酮 1.2g硝基苯肼,20ml乙醇,6ml硫酸,8ml水 硫酸铈 生物碱 10%硫酸铈(IV)的硫酸水溶液(15%) 柱层析技术的数学分析

本文所指的柱层析技巧：

1、 Flash chromatograph加压倏地过柱，避免扩散的发生，分离效果大提高。

2、 用薄层层析硅胶装柱，柱层析硅胶干法上样，保障上样的平均性。上样高度不超过

2～3mm

3、 洗脱剂=展开剂。

4、 TLC上，二点没用重叠。

假设：柱层析也有一个Rf值。对上面的柱层析技术，该Rf值=薄层层板（TLC）的Rf值。根据作者经验，该假设成破。

问题：

设硅胶高度为h厘米，单位厘米的硅胶体积为s。TLC上有两个点，x、y，Rf分辨为Rf1和Rf2，其中Rf1>Rf2现在要把上述两个点分开。请问x什么时候出来，用什么样的吸收瓶能保证把两个点分开。

解答：

hx=x点涌现在柱下方的时候，洗脱剂总共流过的高度

hy=y点出当初柱下方的时候，洗脱剂总共流过的高度

设硅胶局部含溶剂体积为V，V确定小于h×s，当洗脱剂从上方流到柱下方的时候，x点到达h×Rf1处，y点到达h×Rf2处。要让x点到达柱下方，实在就是解下列方程：

h/hx=(h×Rf1)/h=Rf1

即：hx=h/Rf1

同理，y点达到柱下方，洗脱剂需流经hy高度，hy=h/Rf2，x，点相差离为hy-hx，斟酌到他们都有扩散，设其扩散半径雷同，都为R，对疾速柱，扩散效应都不厉害，设其值为，R=,性用品,即假设他们旁边夹着一个同样大小的中间点,则x，y点实际相差为hy-hx-2R=(hy-hx)/2,语文导读法的理论构想和基本课式（中）（转自中国著名。所以，当接受瓶总共接收到hx×s+V=h/Rf1+V体积的时候，hx开端呈现，V<h×s

如果接受瓶的体积小于(h/Rf2-h/Rf1)×s/2的时候，可足够保证分开x和y点。

我家里是用的消毒液拖地的，无色的消毒液有84、双氧水、酒精等，棕色的一般是对氯间二甲苯酚。84可以用于一般物品表面、白色织物等消毒，对氯间二甲苯酚（老管家、滴露等）可以用于家居、地板、衣物等消毒，双氧水一般给伤口消毒。以上就是比较常见的消毒液，可以试试

最基本和最简单的方法是用硅胶柱分离.因为甲氧基苯甲醇的极性大于对甲氧基苯甲醛

,当你用TLC板检测时,上方的点是对甲氧基苯甲醛

,下方的点是对甲氧基苯甲醇

.因此只要用己烷和乙酸乙酯（50:1,v/v)

做流动相,硅胶柱层析法,就可以得到这两个化合物而不带入新物质.

当然还有化学方法：

甲氧基苯甲醛与胺类反应,例如与苄基胺反应,生成亚胺.而甲氧基苯甲醇不反应.前者的沸点要高的多,将甲氧基苯甲醇先蒸馏出来,亚胺再酸性水解会到对甲氧基苯甲醛.