聚乙二醇融合法

聚乙二醇法（PEG）为我国学者高国楠首创，是最成功的原生质体融合技术。PEG作为一种高分子化合物，由于PEG分子中醚键的存在使其分子末端带有微弱负电荷，能与水、蛋白质、糖等极性物质的正极形成氢键。当PEG分子足够长时，可作为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Casuperscript2+superscript等阳离子，Casuperscript2+superscript可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。

在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这样将引起电荷的紊乱和再分布或使膜表面局部脱水，或改变构型使原生质类脂“液态”化而引起融合。PEG法已经广泛地用于原生质体融合，因为它能得到较高的异核体产率，对大多数细胞的毒性都很低，利于形成双核异核体。

PEG促融合是非特异的，因此对种间融合、基因间融合都是有用的。PEG法的缺点是对原生质体有一定毒害，而且融合率一般较低，不超过1%。

具体操作过程如下：取等量、密度相近的两种不同原生质体悬浮液，在玻璃容器内混合均匀，取150μL左右的原生质体悬浮液滴在盖玻片上，缓慢加入450μL左右的PEG溶液，放在2030摄氏度条件保温培养0.51h，然后用原生质体培养介质将原生质体漂洗几遍以除去PEG，再将原生质体样品重新悬浮在培养介质中。

二、细胞融合也称细胞杂交 , 是指细胞通过介导和培养, 在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合( 合并) 成一个核或多核的杂合细胞的过程。体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。

三、化学诱导融合1.盐类融合法。此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率 ,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。2高钙和高pH值融合法。高 Ca2+和高pH值可以诱发融合。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。3、聚乙二醇融合法(PEG法) 。1974年发现的聚乙二醇(PEG)使不同科属的植物原生质体之间都可以融合，融合率可达30%。聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。PEG可与水分子借氢键结合，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，从而引起细胞融合。为了发挥PEG促进细胞融合的效力，必须采用较高的浓度(40%～50%，分子量为6000)，但PEG在高浓度下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。影响原生质体融合的因素很多。特别是环境中的阳离子存在，融合时的pH 也对原生质体融合有较明显的影响。一般来讲钙、镁离子有助于融合。如有钙离子存在时，可得到较高的融合率。但在缺乏钙离子时，若pH 较低，融合频率也较高。这是因为钙离子和带负电荷的PEG与细胞膜表面分子相互作用，使原生质体带电，彼此易于附着发生凝集所致。PEG诱导细胞融合由于具有容易制备和控制、活性稳定、使用方便等特点，在细胞融合领域取得了可喜的成绩，大量的研究仍采用此法。虽然PEG作为融合剂有很多成功的报道，但存在着对细胞损伤大、残存有毒性、融合率较底及经验性大等缺陷。

四、 物理诱导融合1。细胞电融合技术细胞电融合是以脂质膜和脂质一蛋白质膜的电学性质为基础的，以双向电泳和电子击穿细胞质膜的联合作用为手段，和细胞电注射构成一对互补技术。在短时间强电场的作用下，细胞膜发生可逆性电击穿(Reverisb leb reakdown)，瞬时失去其高电阻和低通透特性，然后在数分钟后恢复原状。当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时，即可诱导他们的膜相互融合，从而导致细胞融合。细胞融合分为两步：第一步是建立细胞间接触(cell-to-cell contact) ； 第二步，接受区膜结构受扰动而紊乱，然后恢复并融合。根据其诱导细胞接触的性质，分为特异性和非特异性两大类。非特异性细胞电融合法是指在进行细胞电融合时，无法排除亲本细胞的自体融合而只进行双亲本间的细胞杂交融合。主要原因是细胞间的相互接触是无选择性的，是非特异性细胞聚集。非特异性电融合技术包括细胞物理聚集电融合法和细胞化学聚集电融合法。细胞融合所必需的两个步骤为：①细胞间接触；②接触区的膜结构受到瞬间扰动而导致融合。只要其中的任意一步有特异性，就能形成特异性的细胞融合。 2.激光诱导法。激光诱导细胞融合术是利用激光微束对相邻细胞接触区的细胞膜进行破坏(或扰动)，可将两个不同特性、不同大小的细胞在显微镜下实现融合。即利用光镊捕捉并拖动一个细胞使之靠近另一个细胞并紧密接触，然后对接触处进行脉冲激光束处理，使质膜发生光击穿，产生微米级的微孔。这样，由于质膜上微孔的可逆性，细胞开始变形融合，最终成为一个细胞。使用此技术时，使细胞接触的方法可用①光俘虏法；②用低浓度的融合剂PEG (5% )使细胞聚法。目前，最新颖的方法是利用激光光阱建立两细胞间接触，即光镊利用激光高斯光束光场的梯度力把细胞从光束边缘拉向光束中间，在光斑直径与光波波长尺度相比拟时，指向束腰的轴向梯度力要大于沿光束方向的散射力，该梯度力把细胞竖直地拉到激光束腰下方处，从而实现对细胞的操作。 

2、其次改善了凝胶稳定性，从而制得均匀透明的凝胶。

3、最后并在一定程度上减少了硬团聚。

同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。

仙台病毒法融合

①两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞

膜上。并使两细胞相互凝聚；

②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需

要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2；

②细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；

④融合成巨大细胞，仍需ATP。

聚乙二醇（PEG）法

聚乙二醇（PEG）结构为：HOH2C（CH20CH2)nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂。PEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。一般选用分子量为4,000，常用浓度为50%，pH8.0～pH8.2（用10%NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。

电融合法

在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。

优点：融合率高、重复性强、对细胞伤害小；

装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；

免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。

离心振动

物理方法之一，使用离心机等机器实现细胞之间的融合。