如何证明甲氧基聚乙二醇是聚乙二醇单甲醚

原则上说，“大三阳”者先进行保肝、抗病毒和抗肝纤维化治疗。保肝和抗肝纤维化治疗适合于所有“大一阳”病人，但所有“大三阳”病人是不是都要进行抗病毒治疗呢？答案是否定的。只有那些转氨酶高(高于2倍正常值)的病人才有可能取得良好的疗效。因此，对那些肝功能正常或基本正常的“大三阳”，特别是通过垂直传播获得感染者，并不主张进行抗病毒治疗。目前，对“大三阳”病人的抗病毒药物主要有干扰素、核苷类药物如拉米夫定等，中药如苦参素等，免疫调节剂α胸腺肽也常被用于抗病毒治疗。干扰素因为其有较为肯定的抗病毒疗效，而且可以抗肝纤维化和降低肝癌的发生率，因此对“大三阳”病人一般首选干扰素治疗。当然，干扰素也存在着一定的不足，如使用后会引起一些副作用如发热、白细胞减少等，而且单一用药疗效不尽如人意，普通干扰素的HBeAg的血清转换率(俗称”大三阳“转为”小三阳)不到40%。现在又上市了一种新的干扰素——聚乙二醇干扰(α-2a)，疗效优于普通干扰素，使用起来较普通干扰素方便，只要一周一次。抗病毒治疗的疗程一般最短要半年，可以根据治疗的结果在专业医生的指导下决定治疗方案和疗程。转氨酶高治疗时并不代表效果好还需要说明的是，不是所有转氨酶高的病人都能取得满意的抗病毒效果。这一方面是目前所有药物本身的抗病毒疗效不是令人满意，另一方面，临床上引导起转氨酶高的非肝炎因素很多，如劳累、休息不好、酒精、药物等。有其他肝胆疾病，如脂肪肝、胆囊炎、胆石症等，其他系统的疾病，如心血管疾病、肾脏疾病等，这些因素容易被误认为肝炎活动所引起，而导致抗病毒疗效差。因此，在抗病毒治疗前一定要注意鉴别。相关阅读推荐：

在我国，“大三阳”者不在少数。其中，很多人是在体检时被发现的，一点自觉沔状都没有；有一部分人则是因为感觉不适而去医院就诊时检查出来的。常见的

自觉症状有胃口不好甚至是厌油腻、没有力气等，相当多的病人表现为腹胀，先是当胃病看，因为效果不好才想起来是否有肝炎而被检查出来的。值得一提的是，肝

炎病情的轻得经常与自觉症状不一致。有些人毫无症状，在一次偶然的体检时发现患有肝炎甚至已经有肝硬化或肝癌了；也有一部人人是别人发现他眼睛黄或皮肤黄了才去看病的，这时病情已经非常严重。相反，有些病人自觉症状很差，经常会诉说没有力气，胃口不好、腹胀等，但去医院检查后发现肝功能是好的，也没有发肝硬化和肝癌。因此，过分相信自我感觉会耽误病情！提高自我保健意识，定期去医院检查身体是必要的。

“大三阳”治疗三部曲

“大三阳”代表体内有乙肝病毒复制，具有传染性。临床上有不少“大三阳”者无症状、肝功能正常，一般称之为慢性“HBsAg携带者”（但事实上，其中有相

当一部分人病理上有轻重不等的肝脏损害），而对那些有症状和肝功能异常者，称之为慢性乙型肝炎病人。那么，有了“大三阳”该怎么办呢？原则上说，“大三阳

”者庆进行保肝、抗病毒和抗肝纤维化治疗。保肝和抗肝纤维化治疗适合于所有“大一阳”病人，但所有“大三阳”病人是不是都要进行抗病毒治疗呢？答案是否定

的。只有那些转氨酶高（高于2倍正常值）的病人才有可能取得良好的疗效。因此，对那些肝功能正常或基本正常的“大三阳”，特别是通过垂直传播获得感染者，

我们并不主张进行抗病毒治疗。

“目前，对‘大三阳’病人的抗病毒药物主要有干扰素、核苷类药物如拉米夫定等，中药如苦参素等，免疫调节剂α胸腺肽也常被用于抗病毒治疗。干扰素因为

其有较为肯定的抗病毒疗效，而且可以抗肝纤维化和降低肝癌的发生率，因此对‘大三阳’病人一般首选干扰素治疗。“

当然，干扰素也存在着一定的不足，如使用后会引起一些副作用如发热、白细胞减少等，而且单一用药疗效不尽如人意，普通干扰素的HBeAg的血清转换率（俗

称“大三阳”转为“小三阳）不到40%。好在现在又上市了一种新的干扰素——聚乙二醇干扰（α-2a），疗效优于普通干扰素，使用起来较普通干扰素方便，只要一周一次。抗病毒治疗的疗程一般最短要半年，可以根据治疗的结果在专业医生的指导下决定治疗方案和疗程。

还需要说明的是，不是所有转氨酶高的病人都能取得满意的抗病毒效果。这一方面是目前所有药物本身的抗病毒疗效不是令人满意，另一方面，临床上引导起

转氨酶高的非肝炎因素很多，如劳累、休息不好、酒精、药物等。有其他肝胆疾病如脂肪肝、胆囊炎、胆石症等。其他系统的疾病如心血管疾病、肾脏疾病等，这些因素容易被误认为肝炎活动所引起，而导致抗病毒疗效差。因此，在抗病毒治疗前一定要注意鉴别。

大三阳一定要接受治疗

我们平常所说的“大三阳”是指乙肝五项化验中，乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）、核心抗体（抗－HBC）呈阳性，这种情况下确诊患者为乙型肝炎大三阳，在潜伏期或慢性肝炎活动期，病人具有较强的传染性，多数伴有乏力、呕吐、恶心、食欲减退，转氨酶偏高等症状。

病毒复制活跃、传染性强、肝脏损坏严重、症状明显，是乙肝大三阳目前共同的特点。

e抗原（HBeAg）阳性，是大三阳的重要标志，e抗原的存在表示乙肝病毒在体内大量的复制，并具有较强的传染性，这表明乙肝大三阳患者不仅自身体内病毒复制强，而且这一时期病人极易对家人、朋友及外界形成传染，这一时期一定要对患者的食具进行消毒隔离，尽量避免他人接触到患者的血液、经血、汗液、乳汁等，对于乙肝大三阳患者来讲，这一时期要及时早治，清除体内大量的乙肝病毒，促进e抗原转阴或向小三阳转化，即可降低传染性。

大三阳除了传染性之外，对肝脏造成的损伤程度也很大，患者体内病毒的不断复制会造成肝细胞渐进性碎屑化坏死，肝小叶遭到结构性破坏，肝功能失调，值得注意的是，大三阳患者肝功能不正常后，绝大部分将会发展为肝硬化。

及早治疗、清除病毒，这是使大三阳逐渐转阴的唯一途径。

大三阳患者获得转阴的机率较小三阳要容易，由于HBeAg（e抗原）是大三阳的重要标志，因此，促使HBeAg转阴，便成为乙肝大三阳治疗的关键，大三阳患者一般可服用清除病毒的药物，逐步控制乙肝病毒的过度生长繁殖，即控制乙肝病毒的复制程度，促使e抗原转阴或向小三阳转化。以在2002年首批被列入“健康金桥”重点工程项目的肝药�速立特�为例，部分大三阳患者在服用6～8个月后就出现HBeAg直接转阴，表明患者感染后的病程缩短，乙肝病毒的复制活动已基本中止，进入恢复期，如检查HBV－DNA是阴性，再持续服药3～5个月即可基本治愈。部分患者在服药6～9个月后或更长时间，由大三阳转变成小三阳，表示患者体内的乙肝病毒复制得到控制，传染性由强转弱，病毒对患者肝脏造成的危害已相对大大降低。通过治疗后由大三阳转为小三阳的患者，仍需进一步治疗。因为此时患者体内仍有大量乙肝病毒存在，治疗中更要抓住药品起效的有利时期，使疾病得以彻底治疗。·

===============================================

乙肝大三阳治疗方法

肝大三阳可以出现于乙肝的不同发展阶段，治疗方法和措施却有所不同：

1、乙肝病毒携带者表现为大三阳，肝功能始终正常，大多可以稳定在这一阶段，预后良好，一般不须治疗，此时用药较难奏效，多主张调养和随访相结合，劳逸相结合，不主张过多用药治疗和一味要求三阳转阴，各种抗病毒药物可能都难以有所作为。严格地说，病毒携带者尚不属于病人范畴，所以药物治疗也可暂不考虑。最新研究表明，核甘类抗病毒药物拉米夫定或阿地福韦，可试用于治疗病毒携带者（16岁以上者），密切观察3个月，如果乙肝病毒复制指标（e抗原HNV－DNB）阴转，可持续用药1－2年，如果3个月内无效，可终止用药。

2、慢性迁延性乙肝病人表现为大三阳，肝功轻度异常，B超提示慢性轻度肝损害。治疗法则以抗病毒为主，主要治疗为拉米夫定，辅助药物为保肝降酶药。治疗目标是肝功长期介质正常，乙肝病毒复制指标阴转，疗程为1－2年

3、慢性活动性乙肝表现为大三阳，病情较重，血清胆红素、转氨酶升高明显，凝血酶原活动度降低显著。此时治疗法则以保肝防止肝坏死和抗病毒并举，保肝降酶药配合抗病毒药物，治疗目标是肝功逐渐趋于平衡，乙肝病毒复制指标逐渐阴转。肝功平衡后，可减少或停止药物，坚持抗病毒。

4、肝硬化病人表现为大三阳，代偿期或静止期的肝硬化病人（B超提示肝硬化，但肝功检查基本正常）。治疗法则以抗病毒和抗肝纤维化并举，合用药物为干扰素或拉米配合软肝片。治疗目标是病毒复制指标阴转，肝纤维化程度减轻。失代偿期或活动期的肝硬化病人表现为大三阳，主要治疗法则不是抗病毒，而是控制及防止并发症（腹水、胸水、出血、感染等等）、恢复肝功，待病情平衡后再考虑抗事宜。

5、肝癌病人表现为大三阳，首要原则介入及外科治疗，病情平衡后再考虑抗病毒治疗。以目前的医术当然可以完全治好啦,不人怕,治病最重要的是心理素质，不要把自己当成病人，要有坚强的意志。

什么是「大小三阳」？

所谓“大小三阳”是指进行“乙型肝炎抗原二对半检查”（简称为乙肝二对半）的二种不同结果。“二对半”中的第一对是指表面抗原（HBsAg）和表面抗体（抗-HBs），第二对是E抗原（HBeAg）和E抗体(抗-HBe)，另外第三对是核心抗体(抗-HBc) 和核心抗原(HBcAg)。由于在肝细胞中，核心抗原已被全部装配成乙肝病毒，血清中没有游离的核心抗原，故在周围血液中只能检测到第三对中的半对，即核心抗体，故称二对半。

“大三阳”是指表面抗原、E抗原和核心抗体检测均是阳性。一般认为，“大三阳”传染性相对较强，同时演变成慢性乙型肝炎的可能性也比较大。

“小三阳”是指表面抗原、E抗体和核心抗体检测均是阳性。“大三阳”和它的区别是前者E抗原阳性。它通常是由“大三阳”转变而来，是人体针对E抗原产生了一定程度的免疫力。一般认为“小三阳”的传染性较小。但对于一些E抗原和E抗体均为阴性的人，它所感染的乙肝病毒可能是已经产生突变的病毒株感染，它不能表达E抗原和E抗体，但是如果检查乙型肝炎病毒去氧核糖核酸（HBV-DMA）依然阳性，表示病毒血症存在，仍然具有传染性。

无论“大三阳”抑或是“小三阳”，只是反映人体内携带病毒的状况，均不能反映肝脏功能的正常与否，因而不能用来判断病情的轻重。要想了解肝功能的情况，最好是定期（3个月至6个月）到医院作一次肝功能和乙肝两对半检查。

“两对半”,“大三阳”与“小三阳”

什么是“大三阳”，“小三阳”，以及“两对半”，原来“大三阳”是指在乙肝检查中 HbsAg阳性， HBeAg阳性，抗HBc阳性。“小三阳” 是指在乙肝检查中HbsAg阳性，抗HBe阳性，抗HBc阳性。“两对半” 是指在乙肝检查中HbsAg、HbeAg， 抗HBs、抗Hbe，抗HBc。

从乙肝病毒感染者的血清中检测“两对半”，已为众所周知。近年又出现“大三阳“和“小三阳”的称法，并在谁重谁轻问题上存在误区。其实它们的主要区别在于，在“表抗“和c抗体均为阳性的基础上，如果e抗原也是阳性，即被称为“大三阳”，表示病毒复制活跃，常同时伴有乙肝病毒DNA(脱氧核糖核酸)阳性，说明具有较强的传染性；如果仅有e抗体阳性，即被称为“小三阳”，表示病毒已基本停止复制，若乙肝病毒DNA阴性，则基本不再具有传染性。也许这就是人们常认为“大三阳“病情重，“小三阳”病情轻，希望从“大三阳“尽快转为“小三阳”的主要原因之一。

但是，真正决定患者病情轻重的是乙肝病毒DNA、肝功能和临床症状。大致有下面三种情况：第一种情况，有一小部分“小三阳”患者，其乙肝病毒DNA仍然阳性，提示病毒复制仍然活跃，且有可能是乙肝病毒发生变异的结果，患者的病情可能较重和发展更快，应加以注意。第二种情况‘无论患者是“大三阳”还是“小三阳”，如果肝功能正常，又没有明显的症状，都称为乙肝病毒携带者，而不能诊断为乙肝患者。乙肝病毒携带者中，大多数人是在婴幼儿时期感染乙肝病毒，由于当时机体免疫系统发育尚未完全成熟，无力清除病毒，容忍乙肝病毒与其长期和平共处，而成为携带者的。第三种情况，无论是“大三阳”还是“小三阳”，如果肝功能反复出现异常，或伴有临床症状，或有肝脾肿大等，则应该判定为乙肝患者，需要积极治疗，以尽快控制活动性肝病。因为我国绝大多数肝硬化、肝癌患者，都经历了一个漫长的反复肝病活跃的过程。换句话说，只要没有活动性肝病或能避免慢性肝病的反复活跃，就能有效地阻止肝硬化、肝癌等严重后果的发生。医学研究还证明，经过一定的时间之后，每年有5％-10％的“大三阳”者自然转为“小三阳”。自然转阴对每个“大三阳”的人来说，都是一种机会，但具体何时发生，目前还没有办法确定。因此，建议“大三阳”者不必过分担心。即使试图用抗病毒药将“大三阳”转为“小三阳”，也必须选择肝功能异常者，治疗才有反应。

乙肝病毒携带者不适于药物治疗，等待自然转阴才是明智之举。他们可以正常生活、学习和工作，但不宜从事餐饮服务和保育工作。

实验一 转氨酶GPT活性的测定

【 原 理 】

转氨酶是体内重要的一类酶.转氨酶催化α–氨基酸的α–氨基与α–酮酸的α–酮基之间的相互转化,从而生成一种新的氨基酸与一种新的酮酸,这种作用称为转氨基作用.它在生物体内蛋白质的合成,分解等中间代谢过程中,在糖,脂及蛋白质三大物质代谢的相互联系,相互制约及相互转变上都起着很重要的作用.

在动物机体中活力最强,分布最广的转氨酶有两种:一种为谷氨酸草酰乙酸转氨酶(glutamic-Oxaloacetate transaminase简称GOT),另一种为谷氨酸丙酮酸转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase简称GPT).本实验以谷氨酸丙酮酸转氨酶为例.它的催化反应如下:

GPT

丙氨酸 + α–酮戊二酸 谷氨酸 + 丙酮酸

37℃

由上可见此反应最终产物是丙酮酸.测定单位时间内丙酮酸的产量即可得知转氨酶的活性.

丙酮酸可与2,4–二硝基苯肼反应,形成丙酮酸二硝基苯腙,在碱性溶液中呈棕红色,显色的深浅在一定范围内可反映所生成的丙酮酸量多少,与同样处理的丙酮酸标准液进行比色,计算出其含量,以此测定转氨酶的活性.

丙酮酸 + 2,4–二硝基苯肼 丙酮酸–2,4–二硝基苯腙(棕红色)

本实验用金氏(King)法(1)测定转氨酶的活性单位为:每毫升血清与基质在37℃下作用60分钟,生成1μmol丙酮酸为1个单位.

【 试剂和器材 】

一 试剂

1.1/15 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲溶液:

甲液:1/15 mol/L磷酸氢二钠溶液:称取磷酸氢二钠(Na2HPO4)9.47g(或Na2HPO4 · 12H2O 23.87g)溶解于蒸馏水中,定容至1 000 ml.

乙液:1/15 mol/L磷酸二氢钾溶液:称取磷酸二氢钾(KH2PO4)9.078g,溶解于蒸馏水中,定容至1 000 ml.

取甲液825 ml乙液175 ml混合,测其pH为7.4即1/15 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液.

2.GPT基质液:精确称取a–酮戊二酸29.2 mg及DL–丙氨酸1.78g,溶于1/15 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液50ml 中溶解,加1mol/L NaOH溶液0.5ml,校正pH至7.4.再以pH 7.4的磷酸缓冲液定容至100ml,充分混合,冰冻贮存.

3.2,4–二硝基苯肼溶液:精确称取2,4–二硝基苯肼20mg,先溶解于10ml浓盐酸中(可加热助溶),再以蒸馏水稀释至100ml(有沉渣可过滤),棕色瓶内保存.(注意:此溶液配制时释放大量的热和难闻气味配制时应戴上口罩)

4.丙酮酸标准液(1ml = 2μmol丙酮酸即2mmol/L):精确称取丙酮酸钠22mg于100ml容量瓶中,用1/15 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度.此溶液应新鲜配制,不能存放.

5.0.4 mol/L氢氧化钠溶液:称取16g氢氧化钠溶解于蒸馏水中,定容至1 000ml.

6.1mol/L氢氧化钠溶液:称取4g氢氧化钠溶解于蒸馏水中,定容至1 00ml.

7.血清300ml.

二 器材

1.水浴锅.

2.分光光度计.

【 操 作 】

1.标准曲线制作:取6支试管按下表操作.

试管号

试 剂

1 2 3 4 5 6

丙酮酸标准液 (ml)

GPT基质液 (ml)

PH7.4磷酸缓冲液(ml)

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

水浴37℃,10分钟

2,4二硝基苯肼溶液(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

保温37℃,20分钟

0.4N氢氧化钠溶液 (ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

相当活性(单位数) 空白 100 200 300 400 500

混匀后,用分光光度计在520nm波长处进行比色测定,以空白调零,读取各管吸光度读数.以各管相应的转氨酶活性单位值为横坐标,吸光度值为纵坐标,用坐标纸绘制标准曲线.

2.GPT测定:取2支洁净的试管按下表操作.

试 剂 空 白 测 定

血 清 (ml) 0.1 0.1

G PT基质液 (ml) -- 0.5

混匀, 37℃水浴,60分钟

G PT基质液 (ml) 0.5 --

2,4二硝基苯肼溶液 (ml) 0.5 0.5

混匀, 37℃水浴,20分钟

0.4mol/L氢氧化钠 (ml) 5.0 5.0

混匀,放置5分钟,用分光光度计在波长520nm波长处进行比色测定,以空白调零,读取测定管吸光度值.

【 实验结果 】

所测得的吸光度值在已绘制好的标准曲线上直接查对,即可得知待测转氨酶的活性单位.

【 注意事项 】

1.测定血清中转氨酶活性主要有金氏 (King) 法,赖氏 (Reitman—Frankel)法和改良穆氏(Mohun)法.这三种方法的原理,试剂和操作方法包括血清和试剂的用量及作用温度均相同,不同之处是金氏法酶作用时间为60分钟,而其他二法为30分钟.因此活性单位定义不同.

2.转氨酶只作用于L–型氨基酸,对D–型氨基酸无催化能力.实验中所用的是DL–型的混旋氨基酸.若采用L–型时,则用量比DL–型少一半.

3.所用仪器应清洁,不应含有酸,碱,Zn2+,Ca2+,Hg2+,Ag+等蛋白沉淀剂.

4.血清不应溶血,因血细胞内转氨酶含量较多.样品采集后应当日进行测定,否则应将血清分离后贮存于冰箱.

5.温度及时间一定要严格控制,准确掌握.pH要准确以免影响酶活性.

实验二 过氧化氢酶及过氧化物酶的作用

【 原 理 】

在生物机体内,某些代谢物由于需氧脱氢的结果而产生对机体有害的过氧化氢.体内的过氧化氢酶能催化过氧化氢分解成水和分子氧,使过氧化氢不致在体内积累.因此,过氧化氢酶具有保护生物机体的作用.

过氧化氢酶是一种以铁卟啉为辅基的酶,它广泛存在于动植物组织中.

过氧化物酶也是一种以铁卟啉为辅基的酶,它能催化过氧化氢释放出新生态氧以氧化某些酚类和胺类物质,例如,氧化溶于水中的焦性没食子酸生成不溶于水的焦性没食子橙(橙红色).其作用机制如下:

E + H2O2 E–H2O2

E–H2O2 + H2O2 E + 2 H2O + O2

【 试剂和器材 】

一 试剂

2%过氧化氢溶液:此溶液易见光分解,应新鲜配制.

1%焦性没食子酸溶液:焦性没食子酸1g,用蒸馏水溶解并配至100ml.此溶液易

氧化,应新鲜配制.

铁粉.

二 材料

鲜猪肝糜.

马铃薯或血液.

白菜梗提取液:白菜梗约5g,切成细块,置研钵内,加蒸馏水15ml研磨成浆,转

移出滤液,备用.

【 操 作 】

1.过氧化氢酶的作用

取试管5支,按下表操作:

试管 2% H2O2(ml) 新鲜肝糜 (g) 煮沸肝糜(g) 生马铃薯(g) 熟马铃薯(g) 铁粉

1 3 0.5 - - - -

2 3 - 0.5 - - -

3 3 - - 1 - -

4 3 - - - 1 -

5 3 - - - - 少许

加毕,观察有无气泡放出,特别是肝糜周围和马铃薯周围.

2.过氧化物酶的作用

取试管4支,按下表操作:

试管 1%焦性没食子酸 2% H2O2 蒸馏水 白菜梗提取液 煮沸的白菜梗提取液

(ml) (滴) (ml) (ml) (ml)

1 2 2 2 - -

2 2 - - 2 -

3 2 2 - 2 -

4 2 2 - - 2

摇匀后,观察并记录各管颜色变化和沉淀的出现.

实验三 琥珀酸脱氢酶及丙二酸的抑制作用

【 原 理 】

琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的一个重要的酶,测定细胞中有无这种酶可以初步鉴定

三羧酸循环途径是否存在.琥珀酸脱氢酶可使其底物脱氢,产生的氢可通过一系列传递体最后递给氧而生成水.在缺氧的情况下,若有适当的受氢体也可显示出脱氢酶的作用.如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下,可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸,脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白.这样,便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用.

琥珀酸 + 甲烯蓝 琥珀酸脱氢酶 延胡索酸 + 甲烯白

丙二酸的化学结构与琥珀酸相似,它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合.若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合,则不能再催化琥珀酸脱氢,这种现象称为竞争性抑制.如相对地增加琥珀酸的浓度,则可减轻丙二酸的抑制作用.

【 试剂和器材 】

一 试剂

1.1.5%琥珀酸钠溶液:取琥珀酸钠1.5g,用蒸馏水溶解并稀释至100ml.如无琥珀酸钠可用琥珀酸配成水溶液后,以氢氧化钠溶液中和至pH7~8.

2.1%丙二酸钠溶液:取丙二酸钠1g,用蒸馏水溶解并稀释至100ml.

3.0.02%甲烯蓝溶液.

4.1/15mol/LNa2HPO4溶液:取Na2HPO4 · 2H2O 11.88g,用蒸馏水溶解并稀释至1 000ml.

5.液体石蜡.

二 器材

1.玻璃匀浆器.

2.离心机.

三 材料

新鲜猪心.

【 操 作 】

1.猪心脏制备液:称取新鲜猪心1.5~2.0g玻璃匀浆器放中,加入等体积的石英砂及1/15mol/LNa2HPO4溶液3~4ml,捣碎成浆,再加入6~7ml1/15mol/LNa2HPO4溶液,放置一小时,不时摇动,离心(3000r/min 10 min)取上清液备用.

2.取4支试管,编号并按下表操作:

试管 心脏制备液 1.5%琥珀酸钠溶液 1%丙二酸钠溶液 蒸馏水 0.02%甲烯蓝溶液

(滴) (滴) (滴) (滴) (滴)

1 5 5 - 10 2

2 5(先煮沸) 5 - 10 2

3 5 5 5 5 2

4 5 10 5 5 2

3.各管溶液混匀后,每管各加液体石蜡一薄层(约5~10滴).为什么

4.各管置于37℃水浴中,半小时内观察各管颜色变化,比较其速度并说明原因.然后将第一管用力摇动,观察其有何变化 为什么

实验四 γ–球蛋白的分离

【 原 理 】

中性盐 (如硫酸铵,硫酸钠,氯化钠,硫酸镁等)对球状蛋白质的溶解度有显著影响.随着中性盐浓度的增加,离子强度也增加.当溶液离子强度增加到一定数值时,溶液中蛋白质的溶解度开始下降.离子强度增加到足够高时,蛋白质可从水溶液中沉淀出来,这种现象叫做盐析.各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的高浓度盐溶液来沉淀分离各种蛋白质.

蛋白质是一种生物大分子,它具有不能通过半透膜的性质.透析就是利用这种性质使之与其它小分子物质如无机盐,单糖等分开.本次实验应用的是脱盐透析,即盐析后,将含大量盐类的蛋白质溶液放在半透膜的袋内,再将透析袋浸入蒸馏水中.经过一段时间,袋内的盐类浓度即逐渐降低.若经常更换袋外的液体,最后即可使袋内的蛋白质溶液中所含的盐类除净,从而达到脱盐的目的.应用不同浓度硫酸铵分段盐析法将血清中γ–球蛋白及α,β球蛋白分离,最后用透析法脱盐,即可得到纯度较高的γ–球蛋白.

【 试剂和器材 】

一 试剂

1.pH 7.2,0.01mol/L磷酸盐缓冲液生理盐水(简称PBS): 取0.2mol/L Na2HPO4溶液36.0ml,0.2mol /L NaH2PO4溶液14.0ml混合,加NaCl 8.5克,用蒸馏水稀释至1 000ml.

2.pH7.2饱和硫酸铵溶液:用浓氨水将2 000ml饱和硫酸铵溶液调pH到7.2.

3.纳氏试剂:

纳氏试剂贮存液:于500ml三角烧瓶内加入碘化钾150克,碘110克,汞50克及蒸馏水l00ml,用力振荡7~15分钟,至碘色将转变时,此混合液即产生高热.随即将此烧瓶浸于冷水内振荡,直至棕色之碘转变成带绿色之碘化钾汞溶液为止.将上清液倾入2 000ml量筒内,并用蒸馏水洗涤瓶内沉淀物数次.将洗涤液一并倾入量筒内,加蒸馏水至2 000ml刻度后,混匀即成.

纳氏试剂应用液:取10%氢氧化钠700ml,钠氏试剂贮存液150ml及蒸馏水150ml混匀即成,如显混浊,可静置数日后取上清液使用.此试剂之酸碱度极为重要.用lmol/L盐酸溶液20ml滴定时,需此试剂11～11.5ml恰好使酚酞指示剂变成红色时最为适宜.否则必须纠正其酸碱度.

4.双缩脲试剂:溶解1.50克硫酸铜(CuSO4·5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(NaKC4H406 · 4H20)于500ml蒸馏水中.在搅拌下加入10%氢氧化钠溶液300ml,用蒸馏水稀释到1升,贮存在内壁涂以石蜡的瓶中,可长期保存.

5.浓蔗糖液:蔗糖的饱和溶液.

6.10%氢氧化钠:取10克氢氧化钠溶解于蒸馏水中,定容至100ml.

二 器材

1.透析袋.

2.磁力搅拌器.

3.离心机.

三 材料

兔血清

【 操 作 】

一 盐析

1.取离心管1支加入血清2ml,再加入等量PBS稀释血清,摇匀后,逐渐加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2ml(相当于33%饱和度硫酸铵),边加边摇.然后静止半小时,再离心(3 000r/min)20分钟,倾去上清液(主要含白蛋白).

2.用lml PBS将离心管底部的沉淀搅拌溶解,再逐滴加饱和硫酸铵溶液0.5m1.摇匀后放置半小时,离心(3 000r/min)20分钟,倾去上清液(主要含α,β球蛋白),其沉淀即为初步纯化的γ–球蛋白.如要得到更纯的γ–球蛋白,可重复盐析过程1～2 次.

3.把提取的γ–球蛋白用1 mlPBS悬浮.

二 透析脱盐与浓缩

1.将盐析得到的γ–球蛋白放入透析袋内,用线绳缚紧上口,用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100ml烧杯中,使透析袋下半部浸入水中.

2.将烧杯放在磁力搅拌器上搅拌1小时以上(中间换水1～2次),然后将透析袋取下.小心将线绳解开,吸取袋内的液体,与烧怀中的水同时用双缩脲试剂检查袋内外的蛋白质,用纳氏试剂检查袋内外液体中的铵离子(NH4+),观察透析法的脱盐效果.

3.脱盐后得到的γ–球蛋白溶液可继续浓缩,即用透析袋装好悬于盛有10ml浓蔗糖或聚乙二醇溶液的小烧杯内1小时以上,观察袋内液体体积的变化.

实验五 γ–球蛋白含量测定(光度分析法)

【 原 理 】

双缩脲法是蛋白质光度分析法的一种,是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋白质含量的方法.因蛋白质含有两个以上的肽键,所以有双缩脲反应.在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物,其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比,而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关.在一定的实验条件下,未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反应,并于540~560nm测定,即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度.

【 试剂和器材 】

一 试剂

1.标准酪蛋白溶液(5mg/ml):用0.05mol/L NaOH溶液配制:5g酪蛋白加0.05mol/L NaOH溶液至1 000ml.

2.双缩脲试剂:溶解1.5g硫酸铜(CuSO4 · 5H2O)和6.0 g酒石酸钾钠(NaKC4H4O6 · 4H2O)于500ml蒸馏水中.在搅拌下加入10% NaOH溶液300ml,用蒸馏水稀释到1升,贮存在内壁涂有石蜡的瓶中,可长期保存.

3.未知蛋白质溶液:γ–球蛋白溶液.

二 器材

分光光度计.

【 操 作 】

1.标准曲线的绘制:取6支试管按下表操作.

试 剂 1 2 3 4 5 6

标准酪蛋白溶液(ml) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0

蒸馏水 (ml) 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0

双缩脲试剂 (ml) 4 4 4 4 4 4

室温下(15~25℃)放置30分钟,用分光光度计于540nm测定.以光密度为纵坐标,酪蛋白含量为横坐标用坐标纸绘制标准曲线.

2.γ–球蛋白溶液浓度的测定:取3支试管按下表操作.

试 剂 空白管 测定1 测定2

γ–球蛋白溶液(ml) - 1 1

蒸馏水 (ml) 2 1 1

双缩脲试剂 (ml) 4 4 4

摇匀,放置30分钟,540nm测定读取光密度.

【 实验结果 】

求出待测蛋白质溶液的光密度后,从标准曲线上查出其蛋白质浓度,按稀释倍数求出每毫升蛋白质溶液的蛋白质含量.

实验六 凝胶柱层析法(γ–球蛋白纯化)

【 原 理 】

凝胶层析(gel chromatography),又称为凝胶过滤(gel filtration),分子筛过滤(molecular sieve filtration),凝胶渗透层析(gel osmotic chromatography)等.它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术.其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相(凝胶)具有分子筛的特点,将被分离物质各成分按分子大小分开,达到分离的方法.

凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构.网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态.人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼,小于筛眼的物质分子均可通过,大于筛眼的物质分子则不能,故称为"分子筛".凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时,小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼,并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动,从一个颗粒的网眼流出,又进入另一颗粒的网眼,如此连续下去,直到流过整个凝胶柱为止,因而流程长,阻力大,流速慢大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼,只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动,其流程短,阻力小,流速快,比小分子先流出层析柱小分子最后流出.分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子,则居中流出.这样被分离物质即被按分子的大小分开.

用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品,主要有交联葡聚糖(商品名为Sephadex),琼脂糖(商品名为Sepharose),聚丙烯酰胺凝胶(商品名为Bio–gel)及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物.

本实验主要介绍葡聚糖凝胶,这是由葡萄糖的多聚物与1–氯–2,3–环氧丙烷 (CH2—CH—CH2C1)交连而成.环氧丙烷引入丙三醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来,凝

\/

O 胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和环氧丙烷的比例(交联度)来控制.

葡聚糖具有较强的亲水性,在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的凝胶,其吸水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系.交联度大的,孔径小,吸水少,膨胀的程度小交联度小的,孔径大,吸水多,膨胀的程度大.因此,葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量的大小来表示,常以G–10至G–200号码标记.G后面的数字是其吸水量(毫升水/克干胶)乘以10所得的值.如G–25即表示吸水量为2.5ml/g干胶.市售有G–10,G–25,G–50,G–75,G–100,G–150,G–200等型号.G–75以上的胶因吸水量大,膨胀后形态柔软易变,统称为软胶.G–75以下的称为硬胶.

葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万.可根据被分离物质的分子大小及目的选择使用.一般说Sephadex G–l0～15通常用于分离肽及"脱盐".Sephadex G–75～200用以分离各类蛋白质.

凝胶层析是一种物理分离法.葡聚糖凝胶基本上不带电荷呈多惰性,不与被分离物质发生反应,所以分离的效果较好.然而由于它是葡萄糖的聚合物,因而仍有少量活性羟基,能吸附少量蛋白质等被分离的物质.为了克服这个缺点,一般使用含有离子强度达0.08的NaCl等中性盐缓冲液作洗脱液.

本实验采用凝胶过滤法纯化γ–球蛋白,除去其中的硫酸铵,以达到纯化目的.

【 试剂和器材 】

一 试剂

1.实验二提取出的γ–球蛋白

2.磷酸盐缓冲液(pH6.7,0.0175mol):取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5ml,0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6ml混合,用蒸馏水稀释至1 000ml.

3.Sephadex G–25.

4.奈氏试剂

5.20%磺酰水扬酸

6.洗脱液:磷酸盐缓冲液(pH 7.0,0.01mol) 取0.2mol/L Na2HPO4溶液30.5ml,0.2mol /LNaH2PO4溶液19.4ml混合,加NaCl 8.5克,用蒸馏水稀释至1 000ml.

二 器材

1.lcm×20cm层析柱

2.洗脱瓶.

3.部分收集器

恒流泵

5.监测仪

【 操 作 】

1.凝胶处理:溶胀(水化):商品葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶均为干燥颗粒,使用前必须水化溶胀.商品琼脂糖凝胶呈悬浮胶体可直接用,玻璃球不用溶胀.

凝胶溶胀有两种方法:一种是将所需葡聚糖凝胶浸入蒸馏水中于室温下溶胀另一种 是置于沸水浴中溶胀.各种葡聚糖在上述溶胀方法中所需的时间见实验原理部分.

必须浸泡足够的时间以使凝胶充分溶胀.两种方法中,沸水浴溶胀不但节省时间,还可以杀灭凝胶中污染的细菌并排出网眼.

凝胶溶胀后,需用蒸馏水洗涤几次,每次应将沉降缓慢的细小颗粒随水倾倒出去,以免在装柱后产生阻塞现象,降低流速.洗后将凝胶浸泡在洗脱液中待用.

一支层析柱中应该装入的干胶量可以用下法推算:称取1g所需型号的葡聚糖干胶,放在5ml量筒中,用室温溶胀的方法充分溶胀,观察溶胀后凝胶的体积.然后在层析柱中加水到所需柱床高度,将水倒出,量取柱床体积.根据1g干胶溶胀后的体积和所需柱床体积,即可推算出干胶的需要量.

2.装柱 将层析剂装入柱中进行层析的方法称柱层析法.作层析用的柱子称层析柱.层析柱有玻璃和透明塑料的两种.柱子的一端为进口,另一端为出口,出口端底部有烧结玻璃砂板或尼龙布,能阻止层析剂流出,溶剂则可流过.如果没有市售的层析柱,可以选用粗细均匀,长短合适的玻璃管,在两端塞上合适的胶塞,胶塞中插人细玻璃管,在一端放一层尼龙布为出口,即可作为层析柱使用.层析柱的长短粗细根据实验的目的而定,一般说来,凝胶层析时柱越长,分离效果越好.但柱过长,层析时间长,样品易稀释造成扩散,反而影响分离效果.柱的内径不宜较细,直径1cm以下的柱易发生"管壁效应",即柱中部分的物质组分移动较快,管壁周围的则移动较慢,造成分离混乱.当然柱的内径也不宜过粗.

凝胶层析中,在把小分子物质(mw<1 500),如无机或其他物质与大分子物质 (mw0.5ml/支).

配制测定试剂:1号试剂:2号试剂:3号试剂=1.0:0.1:0.1,混匀.临用前视需要量配制,现用现配.

二 器材

1.水浴锅

2.分光光度计

三 材料

血清

【 操 作 】

试剂测定管(U) 标准管(S) 空白管(B)

血清 (μl)(1:5) 30 – –

标准液 (μl) – 30 –

测定试剂 (ml) 0.6 0.6 0.6

蒸馏水 (ml) 0.25 0.25 0.28

4号应用液(ml) 0.15 0.15 0.15

充分混匀,置37℃水浴30分钟

显色剂 (ml) 1.0 1.0 1.0

血清(1:5):0.1ml+0.4ml生理盐水1:5稀释后使用.

混匀,室温10分钟后,分光光度计550nm,1cm厚度比色杯比色,用蒸馏水调零.

酶活性单位表示:SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个单位.结果以每毫升酶单位表示.

【 实验结果 】

SOD U/ml = B-U/B-S×33.3×标准液体积/样品的体积

=B-U/B-S×33.3×30/30×1000/5000

=B-U/B-S×167

正常参考值:人血清SOD:59.5±17.1U/ml(血清取样量6μl)

实验十七 等电聚焦法测定SOD等电点

【 原 理 】

等电点聚焦就是在电泳槽中放入载体两性电解质,当通以直流电时,两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度,当蛋白质放进此体系时,不同的蛋白质即移动到或聚焦于与其等电点相当的pH位置上.等电聚焦的优点是:有很高的分辨率,可将等电点相差0.01-0.02 pH单位的蛋白质分开一般电泳由于受扩散作用的影响,随着时间和所走的距离加长,区带越走越宽,而等电聚焦能抵消扩散作用,使区带越走越窄由于这种电聚焦作用,不管样品加在什么部位,都可聚焦到其电点,很稀的样品也可进行分离可直接测出蛋白质的等电点,其精确度可达0.01pH单位.

载体两性电解质必需具备的条件:(1)在等电点处必需有足够的缓冲能力,以便能控制pH梯度,而不致被样品蛋白质或其他两性物质的缓冲能力改变pH梯度的进程. (2)在等电点必需的足够高电导,以便使一定的电流通过,而且要求具备不同pH值的载体有相同的电导系数,使整个体系中的电导均匀,如果有局部电导过小,就会产生极大的电位降,从而其他部分电压就会太小,以致不能保持梯度,也不能使应聚焦的成分进行电迁移,达到聚焦.(3)分子量要小,便于与被分离的高分子物质用透析或凝胶过滤法分开. (4)化学组成应不同于被分离物质,不干扰测定.(5)应不与分离物质反应或使之变性.总起来说,当一个两性电解质的等电点介于两个很近的pk值之间时,它在等电点的解离度大,缓冲能力强,而且电导系数高,这就是好的载体两性电解质.

理想的载体两性电解质的合成:具有几个pH值很相近的多乙烯多胺(如五乙烯六胺)为原料,与不饱和酸(如丙烯酸)发生加合反应:加合反应优先加在α,β饱和酸的β碳原子上,调节胺和酸的比例可以加上一个或多个羧基,这种合成方法与一般有机会合成不同,有机合成一般要求合成的产物越纯越好,而这里要求合成出的产物越复杂越好,要有多异构物和同系物,以保证的很多具有不同而又互相接近的pK值和pI值,从而得到平滑的pH梯度.载体两性电解质的等电点在pH3-10的范围,分子量在300-1000之间,它们的缓冲能力等于或优于组氨酸,电导性能良好,可以使电场强度分布较均匀,它们的水溶性良好,在1%水溶液中的紫外吸收值(260mμ)很低.

【 试剂和器材 】

一 试剂

1. 1mol/LNa3PO3

2. 1mol/LNaOH

3. 1%甘氨酸

4.染色液:0.2%考马斯亮蓝

5.10%三氯乙酸

6.5%磺基水杨酸

7.电泳仪

8.脱色液:35%无水乙醇与10%冰乙酸等体积混和

9.20%甘油

二 器材

1.微量注射器

2.薄层胶片

3.滤纸

三 材料

透析后的蛋白质样品

【 操 作 】

1.薄层胶片的灌制

(1)配制凝胶溶液(2)架制胶室(3)灌胶(4)保存

2.样品的预处理:透析除盐,用1%甘氨酸或载体两性电解质为溶剂溶解透析后的蛋白质样品.

3.样品的施加: 将滤纸(擦净纸)剪成0.4×0.5cm2的小方块,先贴在胶质上,再用微量注射器滴加一定量的样品.

4.电极液的施加:电极液采用1mol/LNa3PO3为正极液,1mol/LNaOH为负极液.用滤纸条浸润电极液,然后分正负极,贴加在薄层胶片的两端.

5. 电泳的条件: 4℃下电泳或室温通冷凝水电泳.起始电压为60V,15分钟调至120V,转而恒流(每cm胶片长度0.8-1.0mA),约1小时左右,电压便上升到600～700V,再转而恒压600V或700V,维持3～3.5小时即可结束电泳.

6.pH梯度的测定: 把1×7 cm2薄层胶片切下来,分成14等分,每份加0.4ml重蒸水,搅碎后,测出pH.

7.染色及保存: 蛋白质染色步骤:5%磺基水杨酸与10%三氯乙酸等体积混合固定1小时置脱色液(35%无水乙醇与10%冰乙酸等体积混匀)45min0.2%考马斯亮蓝R250的脱色液溶液(W/V)染色30min置脱色液中,37℃温箱内过夜.染色后的胶片可放在20%甘油中,也可制成干片.

8.等电点的测定: 测定染色后所分离的区带距正极端的长度,按pH曲线找出其相应的等电点.

实验十八 牛乳中酪蛋白磷酸肽的制备

【 原 理 】

牛乳中含丰富的蛋白质,其中主要是酪蛋白.酪蛋白在牛乳中约占总蛋白量的5/6.酪蛋白是一种含磷蛋白的不均一混合物.蛋白质在其等电点pH溶液中溶解度降低.将牛乳的pH调整至4.8,即酪蛋白的等电点时,酪蛋白即沉淀出来.用乙醇除去酪蛋白沉淀中不溶于水的脂肪,得到纯的酪蛋白.牛乳酪蛋白中含有磷酸肽,其活性中心是磷酸化的丝氨酸和谷氨酸簇,是最有效的促钙吸收因子.酪蛋白经酶水解可产生酪蛋白磷酸肽.氮磷比是评价CPP产品质量的最重要指标,氮磷比(N/P)越小,则CPP产品中磷酸基密度越高和肽链越短,它促进人体对钙吸收的生理活性也越高,N/P一般应小于7.5.

【 试剂和器材 】

一 试剂

1.乙酸钠缓冲液(0.2mol/L pH4.6)

2.1%NaOH

3.10%乙酸

4.乙醇

5.乙醚

6.0.1mol/LnaOH

7.胰蛋白酶

8.pH7.4,0.1mol/LTris-HCl缓冲液

二 器材

1.pH计

2.离心机

3.表面皿

4.

三 材料

1.新鲜牛乳

2.酪蛋白

【 操 作 】

酪蛋白的制备

取新鲜牛乳300ml,放入250ml烧杯中加热至40℃.加入100ml加热至同样温度的乙酸钠缓冲液,一边加一边摇动,并用pH计检测,调整混合液的pH为4.8(用1%NaOH或10%乙酸进行调整).冷却至室温,继续放置5分钟,离心(2500r/min,20min)获沉淀物,用少量蒸馏水洗几次,过滤.将洗净的沉淀物悬浮在约 30ml乙醇中,离心得沉淀,用乙醇和乙醚等量混合液洗涤两次,最后用50ml乙醚洗一次.取出抽干的粉状物,摊开在表面皿上,使乙醚完全挥发.

1. 人的成熟红细胞的特殊性：

①成熟的红细胞中无细胞核

②成熟的红细胞中无线粒体、核糖体等细胞器结构

③红细胞吸收葡萄糖的方式为协助扩散

④葡萄糖在成熟的红细胞中通过糖酵解获得能量(两条途径：糖直接酵解途径EMP和磷酸己糖旁路途径HMP)。

2. 蛙的红细胞增殖方式为无丝分裂。

3. 乳酸菌是细菌，全称叫乳酸杆菌。

4. XY是同源染色体，但其大小不一样(Y染色体短小得多)，所携带的基因不完全相同(Y染色体上基因少得多)。

5. 酵母菌是菌，但为真菌类，属于真核生物。

6. 一般的生化反应都需要酶的催化，可水的光解不需要酶，只是利用光能进行光解，这就是证明“并不是生物体内所有的反应都需要酶”的例子。

7. 人属于需氧型生物，人的体细胞主要是进行有氧呼吸的，但红细胞却进行无氧呼吸。

8. 细胞分化一般不可逆，但是植物细胞很容易重新脱分化，然后再分化形成新的植株。

9. 高度分化的细胞一般不具备全能性，但卵细胞是个特例。

10. 细胞的分裂次数一般都很有限，但癌细胞又是一个特例。

11. 人体的酶发挥作用时，一般需要接近中性环境，但胃蛋白酶却需要酸性环境。

12. 矿质元素一般都是灰分元素，但N例外。

13. 双子叶植物的种子一般无胚乳，但蓖麻例外单子叶植物的种子一般有胚乳，但兰科植物例外。

14. 植物一般都是自养型生物，但菟丝子、大花草、天麻等是典型的异养型植物。

15. 蜂类、蚁类中的雄性个体是由卵细胞单独发育而来的，只具有母方的遗传物质雌性个体由受精卵发育而来。

16. 一般营养物质被消化后，吸收主要是进入血液，但是甘油与脂肪酸则被主要被吸收进入淋巴液中。

17. 纤维素在人体中是不能消化的，但是它能促进肠的蠕动，有利于防止结肠癌，也是人体必需的营养物质了，所以也称为“第七营养物质”。

18. 酵母菌的呼吸方式为兼性厌氧型，有氧时进行有氧呼吸，无氧时进行无氧呼吸。

19. 高等植物无氧呼吸的产物一般是酒精，但是某些高等植物的.某些器官的无氧呼吸产物为乳酸，如：马铃薯的块茎、甜菜的块根、玉米的胚等。

20. 化学元素“砷”是唯一可以使人致癌而不使其他动物致癌的致癌因子。

21. 体细胞的基因一般是成对存在的，但是，雄蜂和雄蚁就是孤雌生殖，只有卵细胞的染色体!

22. 体细胞的基因一般是成对存在的，植物中的香蕉是三倍体，进行无性生殖。

23. 红螺菌的代谢类型为兼性营养厌氧型。

24. 猪笼草的代谢类型为兼性营养需氧型。

25. 病毒是DNA或RNA病毒，但是朊病毒没有DNA或RNA，其遗传物质只是蛋白质(“朊”意即是蛋白质)。

一、捕获光能的色素

叶绿体中的色素有4种，他们可以归纳为两大类：

叶绿素(约占3/4)：叶绿素a(蓝绿色)叶绿素b(黄绿色)

类胡萝卜素(约占1/4)：胡萝卜素(橙黄色)叶黄素(黄色)

叶绿素主要吸收红光和蓝紫光，类胡萝卜素主要吸收蓝紫光。白光下光合作用最强，其次是红光和蓝紫光，绿光下最弱。因为叶绿素对绿光吸收最少，绿光被反射出来，所以叶片呈绿色。

二、实验——绿叶中色素的提取和分离

1 实验原理：绿叶中的色素都能溶解在层析液(有机溶剂如无水乙醇和丙酮)中，且他们在层析液中的溶解度不同，溶解度高的随层析液在滤纸上扩散得快，绿叶中的色素随着层析液在滤纸上的扩散而分离开。

2 方法步骤中需要注意的问题：(步骤要记准确)

(1)研磨时加入二氧化硅和碳酸钙的作用是什么?二氧化硅有助于研磨得充分，碳酸钙可防止研磨中的色素被破坏。

(3)滤纸上的滤液细线为什么不能触及层析液?防止细线中的色素被层析液溶解。

(4)滤纸条上有几条不同颜色的色带?其排序怎样?宽窄如何?有四条色带，自上而下依次是橙黄色的胡萝卜素，黄色的叶黄素，蓝绿色的叶绿素a，黄绿色的叶绿素b。最宽的是叶绿素a，最窄的是胡萝卜素。

三、捕获光能的结构——叶绿体

结构：外膜，内膜，基质，基粒(由类囊体构成)。与光合作用有关的酶分布于基粒的类囊体及基质中。光合作用色素分布于类囊体的薄膜上。吸收光能的四种色素和光合作用有关的酶，就分布在类囊体的薄膜上。类囊体在基粒上。

叶绿体是进行光合作用的场所。它内部的巨大膜表面上，不仅分布着许多吸收光能的色素分子，还有许多进行光合作用所必须的酶。

四、光合作用的原理

1、光合作用的探究历程：光合作用是指绿色植物通过叶绿体，利用光能，把二氧化碳和水转化成储存着能量的有机物，并且释放出氧气的过程。

植物更新空气。

植物进行光合作用时，把光能转化成化学能储存起来。

光合作用的产物除氧气外还有淀粉。

光合作用释放的氧气来自水。(同位素标记法)

CO2中的碳在光合作用中转化成有机物中的碳的途径，这一途径称为卡尔文循环。

2、光合作用的过程： (熟练掌握课本P103下方的图)

总反应式：CO2+H2O →(CH2O)+O2 ，其中(CH2O)表示糖类。

根据是否需要光能，可将其分为光反应和暗反应两个阶段。

生物学中常见的物理、化学、生物方法及用途 ：

1、致癌因子：物理因子：电离辐射、X射线、紫外线等。

化学因子：砷、苯、煤焦油

病毒因子：肿瘤病毒或致癌病毒，已发现150多种病毒致癌。

2、基因诱变：物理因素：Χ射线、γ射线、紫外线、激光

化学因素：亚硝酸、硫酸二乙酯

3、细胞融合：物理方法：离心、振动、电刺激

化学方法：PEG（聚乙二醇）

生物方法：灭活病毒（可用于动物细胞融合）

生物学中常见英文缩写名称及作用

1．ATP：三磷酸腺苷，新陈代谢所需能量的直接来源。ATP的结构简式：A—P～P～P，其中：A代表腺苷，P代表磷酸基，～代表高能磷酸键，—代表普通化学键

2．ADP ：二磷酸腺苷

3．AMP ：一磷酸腺苷

4．AIDS：获得性免疫缺陷综合症（艾滋病）

5．DNA：脱氧核糖核酸，是主要的遗传物质。

6．RNA：核糖核酸，分为mRNA、tRNA和rRNA。

7．cDNA：互补DNA

8．Clon：克隆

9．ES（EK）：胚胎干细胞

10．GPT：谷丙转氨酶，能把谷氨酸上的氨基转移给丙酮酸，它在人的肝脏中含量最多，作为诊断是否患肝炎的一项指标。

11．HIV：人类免疫缺陷病毒。艾滋病是英语“AIDS”中文名称。

12．HLA：人类白细胞抗原，器官移植的成败，主要取决于供者与受者的HLA是否一致或相近。

13．HGP：人类基因组计划

一、 生物学中常见化学元素及作用：

1、Ca：人体缺之会患骨软化病，血液中Ca2+含量低会引起抽搐，过高则会引起肌无力。血液中的Ca2+具有促进血液凝固的作用，如果用柠檬酸钠或草酸钠除掉血液中的Ca2+，血液就不会发生凝固。属于植物中不能再得用元素，一旦缺乏，幼嫩的组织会受到伤害。

2、Fe：血红蛋白的组成成分，缺乏会患缺铁性贫血。血红蛋白中的Fe是二价铁，三价铁是不能利用的。属于植物中不能再得用元素，一旦缺乏，幼嫩的组织会受到伤害。

3、Mg：叶绿体的组成元素。很多酶的激活剂。植物缺镁时老叶易出现叶脉失绿。

4、B：促进花粉的萌发和花粉管的伸长，缺乏植物会出现花而不实。

5、I：甲状腺激素的成分，缺乏幼儿会患呆小症，成人会患地方性甲状腺肿。

6、K：血钾含量过低时，会出现心肌的自动节律异常，并导致心律失常。

7、N：N是构成叶绿素、ATP、蛋白质和核酸的必需元素。N在植物体内形成的化合物都是不稳定的或易溶于水的，故N在植物体内可以自由移动，缺N时，幼叶可向老叶吸收N而导致老叶先黄。N是一种容易造成水域生态系统富营养化的一种化学元素，在水域生态系统中，过多的N与P配合会造成富营养化，在淡水生态系统中的富营养化称为“水华”，在海洋生态系统中的富营养化称为“赤潮”。动物体内缺N，实际就是缺少氨基酸，就会影响到动物体的生长发育。

8、P：P是构成磷脂、核酸和ATP的必需元素。植物体内缺P，会影响到DNA的复制和RNA的转录，从而影响到植物的生长发育。P还参与植物光合作用和呼吸作用中的能量传递过程，因为ATP和ADP中都含有磷酸。P也是容易造成水域生态系统富营养化的一种元素。植物缺P时老叶易出现茎叶暗绿或呈紫红色，生育期延迟。

9、Zn：是某些酶的组成成分，也是酶的活化中心。如催化吲哚和丝氨酸合成色氨酸的酶中含有Zn，没有Zn就不能合成吲哚乙酸。所以缺Zn引起苹果、桃等植物的小叶症和丛叶症，叶子变小，节间缩短。

二、生物学中常用的试剂：

1、斐林试剂： 成分：0.1g/ml NaOH（甲液）和0.05g/ml CuSO4（乙液）。用法：将斐林试剂甲液和乙液等体积混合，再将混合后的斐林试剂倒入待测液，水浴加热或直接加热，如待测液中存在还原糖，则呈砖红色。

2、班氏糖定性试剂：为蓝色溶液。和葡萄糖混合后沸水浴会出现砖红色沉淀。用于尿糖的测定。

3、双缩脲试剂：成分：0.1g/ml NaOH（甲液）和0.01g/ml CuSO4（乙液）。用法：向待测液中先加入2ml甲液，摇匀，再向其中加入3~4滴乙液，摇匀。如待测中存在蛋白质，则呈现紫色。

4、苏丹Ⅲ：用法：取苏丹Ⅲ颗粒溶于95%的酒精中，摇匀。用于检测脂肪。可将脂肪染成橘黄色（被苏丹Ⅳ染成红色）。

5、二苯胺：用于鉴定DNA。DNA遇二苯胺（沸水浴）会被染成蓝色。

6、甲基绿：用于鉴定DNA。DNA遇甲基绿（常温）会被染成蓝绿色。

7、50%的酒精溶液：在脂肪鉴定中，用苏丹Ⅲ染液染色，再用50%的酒精溶液洗去浮色。

8、75%的酒精溶液：用于杀菌消毒，75%的酒精能渗入细胞内，使蛋白质凝固变性。低于这个浓度，酒精的渗透脱水作用减弱，杀菌力不强；而高于这个浓度，则会使细菌表面蛋白质迅速脱水，凝固成膜，妨碍酒精透入，削弱杀菌能力。75％的酒精溶液常用于手术前、打针、换药、针灸前皮肤脱碘消毒以及机械消毒等。

9、95%的酒精溶液：冷却的体积分数为95%的酒精可用于凝集DNA。

10、15%的盐酸：和95%的酒精溶液等体积混合可用于解离根尖。

11、龙胆紫溶液：(浓度为0.01g/ml或0.02g/ml)用于染色体着色，可将染色体染成紫色，通常染色3~5分钟。（也可以用醋酸洋红染色）

12、20%的肝脏、3%的过氧化氢、3.5%的氯化铁：用于比较过氧化氢酶和Fe3+的催化效率。（新鲜的肝脏中含有过氧化氢酶）

13、3%的可溶性淀粉溶液、3%的蔗糖溶液、2%的新鲜淀粉酶溶液：用于探索淀粉酶对淀粉和蔗糖的作用实验。

14、碘液：用于鉴定淀粉的存在。遇淀粉变蓝。

15、丙酮：用于提取叶绿体中的色素。

16、层析液：（成分：20份石油醚、2份丙酮、和1份苯混合而成，也可用93号汽油）可用于色素的层析，即将色素在滤纸上分离开。

17、二氧化硅：在色素的提取的分离实验中研磨绿色叶片时加入，可使研磨充分。

18、碳酸钙：研磨绿色叶片时加入，可中和有机酸，防止在研磨时叶绿体中的色素受破坏。

19、0.3g/mL的蔗糖溶液：相当于30%的蔗糖溶液，比植物细胞液的浓度大，可用于质壁分离实验。

20、0.1g/mL的柠檬酸钠溶液：与鸡血混合，防凝血。

21、氯化钠溶液：

①可用于溶解DNA。当氯化钠浓度为2mol/L、 0.015mol/L时DNA的溶解度最高，在氯化钠浓度为0.14 mol/L时，DNA溶解度最高。

②浓度为0.9%时可作为生理盐水。

22、胰蛋白酶：

①可用来分解蛋白质；

②可用于动物细胞培养时分解组织使组织细胞分散。

23、秋水仙素：人工诱导多倍体试剂。用于萌发的种子或幼苗，可使染色体组加倍，原理是可抑制正在分裂的细胞纺锤体的形成。

24、氯化钙：增加细菌细胞壁的通透性（用于基因工程的转化，使细胞处于感受态）