硝酸、无水乙醇、苯酚、铁丁，什么反映

不能加热，个人认为会爆炸。

硝酸是强酸，苯酚虽有碱性却是弱碱，铁与硝酸本就反应剧烈，产生大量的热，无水乙醇蒸发与空气混合，呵呵，这我就不好说了。

当然硝酸与铁发生了钝化反应也是有可能的。

反正就是很危险啦，别做傻事。

一． 实验目的

1． 了解醚类合成的原理及方法。

2． 掌握回流、蒸馏、分液、洗涤等操作。

二． 实验原理

苯丁醚是芳香混醚。混醚通常用威廉森（Williamson）合成法制备。由于芳香卤代烃不活泼，一般由脂肪卤代烃和酚钠在乙醇液中反应制得：

卤代烃以溴化物为适宜。酚钠可用酚和氢氧化钠作用制得。一般认为反应是酚氧离子与溴代完进行的 反应。

主反应：

副反应：

三． 实验装

实验所用仪器必须干燥。装置见图3－4，图3－2。

四． 试剂与器材

试剂：苯酚、1－溴丁烷、氢氧化钠、无水乙醇、无水氯化钙、5％氢氧化钠溶液。

器材：100ml圆底烧瓶、球形冷凝管、干燥管、蒸馏头、接受管、直形冷凝管，50ml锥形瓶、分液漏斗。

五． 实验步骤

本实验分二步完成。

1． 第一步：在100ml圆底烧瓶中，加入 氢氧化钠．30ml无水乙醇和9ml 苯酚（苯酚室温时为固体，可用热水浴温热使其熔化后量取），加入沸石。按图3－4安装好反应装置。在热水浴上加热回流。当水浴温度达到 C左右时，反应物开始沸腾。回流开始后从冷凝管上口分批加入14 ml 1－溴丁烷。控制水浴温度在90~ C，回流1~ h。固体溴化钠逐渐溶解，烧瓶内白色沉淀逐渐增加。期间不断振荡烧瓶。

反应结束，移去水浴。反应液稍冷，将回流装置改成蒸馏装置（如图3－2），另加沸石，在水浴上把反应混合物中的乙醇尽量蒸馏出来（约得25~29ml回收）。在残留物中加入10~20ml水，使固体溴化钠溶解，塞紧瓶塞待第二步实验时处理。

2． 第二步：将混合液倒入分液漏斗中，分去水层，粗苯丁醚用10ml5％ 溶液洗涤，再用无水氯化钙干燥后，滤去干燥剂后，空气浴加热蒸馏，用空气冷凝管（用一般直形冷凝管不通水来代替）收集205~ C的馏分。产物称重．测折射率。

产量约10g，纯苯丁醚的沸点为 ，折射率 ＝ 。

六． 注意事项

1．所用的仪器必须是干燥的。

2．苯酚熔点为 C，量取时注意皮肤上不要沾染苯酚，因苯酚有较强的腐蚀性，如已不慎碰到，应立即用大量水冲洗，再用少许乙醇擦洗。

3． 实验中先回流生成苯酚钠，再加入溴丁烷与之反应，效果较好。

4． 加热回流中，如果因温度较高使溶剂挥发过多而发生液体分层现象，可补加少量无水乙醇。

七． 实验结果与讨论

纯苯丁醚为无色液体，沸点为 C，测其折射率，计算产率。如果用金属钠代替氢氧化钠，是否可行？产量能否提高？

八． 思考题

1． 在制备苯丁醚时，无水乙醇在其中起什么作用？为什么不用普通的95％乙醇？

2． 反应完毕后，为什么要尽量将乙醇蒸出？

3． 粗苯丁醚为什么要用氢氧化钠溶液洗涤？

一、背景介绍

酚醛树脂也叫电木，又称电木粉。原为无色或黄褐色透明物，市场销售往往加 着色剂 而呈红、黄、黑、绿、棕、蓝等颜色，有颗粒、粉末状。耐弱酸和弱碱，遇强酸发生分解，遇强碱发生腐蚀。不溶于水，溶于 丙酮 、酒精等 有机溶剂 中。苯酚醛或其衍生物缩聚而得。

酚醛树脂是世界最早人工合成和工业化生产的一类合成树脂，其原料易得，生产工艺简单，综合性能优良，应用非常广泛，因此研究酚醛树脂的制备方法，具有很高的社会意义和经济价值。酚醛树脂合成反应分为两步，首先是苯酚与甲醛的加成反应，随后是缩合及缩聚反应。

缩聚反应是指具有两个或两个以上官能团的单体，相互反应生成高分子化合物，同时产生有小分子（如 H2O、HX、醇等）的化学反应。酚醛树脂是由苯酚和甲醛在催化剂条件下缩聚而成。反应机理是苯酚羟基邻位上的两个氢原子比较活泼，与甲醛基上的氧原子结合为水分子，其余部分连接起来成为高分子化合物——酚醛树脂。

酚醛树脂主要用于制造各种塑料、涂料、胶粘剂及 合成纤维 等

二、实验仪器

试管，烧杯，胶头滴管，酒精灯，石棉网，三脚架，药匙，玻璃棒，天平，量筒

三、实验试剂

苯酚，40%甲醛溶液，浓盐酸，乙醇

四、实验原理

苯酚和甲醛在酸性或碱性的催化剂作用下，通过缩聚反应生成酚醛树脂。

在酸性催化剂作用下，苯酚过量时生成线型热塑性树脂。

在碱性催化剂作用下，甲醛过量时生成体型热固性树脂。

五、实验装置

六、实验步骤及现象

1、往试管中加入2g苯酚和3mL甲醛溶液，再用胶头滴管加入3滴浓盐酸，放在沸水浴中加热。

2、当试管中反应物渐渐沸腾时，从沸水中取出试管，并用玻璃棒不断搅拌试管中的溶液，可以观察到有白色固体生成。

3、待试管冷却至室温，往试管中加入无水乙醇，发现固体不溶解。

4、再将试管放在沸水浴中加热，白色固体也不溶解。说明制得了酚醛树脂。

七、 缩聚反应的特点是：

（1）单体不一定含有不饱和键，但必须含有两个或两个以上的反应基团（如—OH、—COOH、—NH2、—X等）。

（2）缩聚反应的结果，不仅生成高聚物，而且还有副产物（小分子）生成。

（3）所得高分子化合物的化学组成跟单体的化学组成不同。

粗配溶液才能用你说的方法，就是90%的苯酚溶液中苯酚占90%，总的物质是100，则苯酚占90，所以称取90克苯酚，加入10mL的水即可。

但是要精确的配置，则需要容量瓶。

乙醇

乙醇的物理性质主要与其低碳直链醇的性质有关。分子中的羟基可以形成氢键，因此乙醇黏度很大，也不及相近相对分子质量的有机化合物极性大。室温下，乙醇是无色易燃，且有特殊香味的挥发性液体。 作为溶剂，乙醇易挥发，且可以与水、乙酸、丙酮、苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、乙二醇、甘油、硝基甲烷、吡啶和甲苯等溶剂混溶。此外，低碳的脂肪族烃类如戊烷和己烷，氯代脂肪烃如1,1,1-三氯乙烷和四氯乙烯也可与乙醇混溶。随着碳数的增长，高碳醇在水中的溶解度明显下降。 由于存在氢键，乙醇具有潮解性，可以很快从空气中吸收水分。羟基的极性也使得很多离子化合物可溶于乙醇中，如氢氧化钠、氢氧化钾、氯化镁、氯化钙、氯化铵、溴化铵和溴化钠等。氯化钠和氯化钾则微溶于乙醇。此外，其非极性的烃基使得乙醇也可溶解一些非极性的物质，例如大多数香精油和很多增味剂、增色剂和医药试剂。 化学性质 酸性 乙醇分子中含有极化的氧氢键，电离时生成烷氧基负离子和质子。 CH3CH2OH→（可逆）CH3CH2O- + H+ 乙醇的pKa=15.9，与水相近。 乙醇的酸性很弱，但是电离平衡的存在足以使它与重水之间的同位素交换迅速进行。 CH3CH2OH+D2O→（可逆）CH3CH2OD+HOD 因为乙醇可以电离出极少量的氢离子，所以其只能与少量金属（主要是碱金属）反应生成对应的醇金属以及氢气： 2CH3CH2OH + 2Na→2CH3CH2ONa + H2 醇金属遇水则迅速水解生成醇和碱 结论： （1）乙醇可以与金属钠反应，产生氢气，但不如水与金属钠反应剧烈。 （2）活泼金属（钾、钙、钠、镁、铝）可以将乙醇羟基里的氢取代出来。 与乙酸反应

苯酚

苯酚又名石炭酸，分子式C6H6O，无色针状结晶或白色熔块，苯酚密度为1.071 g/cm3，沸点为181.8℃,熔点为40.8℃，易熔于乙醇、氯仿、乙醚、甘油和二硫化碳，熔于水，不熔于石油醚，具特殊气味，有腐蚀性。空气中的氧可将苯酚氧化生成苯醌。纯净的苯酚为白色晶体，有特殊气味，长时间存放，特别是在日光照射下易氧化而呈玫瑰色或深褐色；苯酚易潮解，是弱酸性物质。

乙醛

乙醛物理性质 乙醛密度比1小，熔点是－121摄氏度，沸点为21摄氏度，溶解度为16g/（100g H20）,因有氢键，可与水互溶。用作制取醋酸，也是许多反应的合成中间体。乙醛

1．分子结构

〔师〕展示乙醛分子的比例模型，并让学生根据乙醇催化氧化反应的本质，写出乙醛的分子式、结构式、结构简式及官能团。

〔一个学生在黑板上写，其他学生写在练习本上〕

〔学生板演，教师巡视〕

分子式：C2H4O

〔师〕乙醛的结构简式还可以写成CH3CHO，醛基也可以写成—CHO，但不能写成—COH。

〔师〕写出—CHO的电子式。

〔师〕醛基是一个中性基团，本身未失e-，也未得到e-，因此乙的写法正确。甲误以为“—”应表示一对共用电子对。

〔师〕展示乙醛样品，让学生闻其气味，并观察其颜色、状态，结合教材164页相关内容叙述乙醛的重要物理性质。

〔板书〕2．物理性质

〔生〕乙醛是无色、具有刺激性气味的液体，密度比水小，沸点是20.8℃，易挥发，易燃烧，能跟水、乙醇、氯仿等互溶。

〔师〕官能团决定物质的化学性质，乙醛的化学性质是由醛基决定的。请同学们分析醛基的结构，推测其在化学反应中的断裂方式。

〔生〕C==O键和C—H键都有极性，都可能断裂。

〔师〕下面我们通过乙醛的化学性质来验证同学们的推断是否正确。

〔板书〕3．化学性质

〔师〕C==O键和C==C键断键时有类似的地方，说明乙醛可以发生什么类型的反应？

〔生〕加成反应。

〔师〕请同学们根据加成反应的概念写出CH3CHO和H2加成

〔师〕指出：此反应在Ni作催化剂、加热的条件下才能进行。

〔板书〕(1)加成反应

〔师〕说明：①醛基与H2的加成是在分子中引入—OH的一种方法。②工业上并不用此法合成乙醇。

〔设疑〕乙醇在一定条件下被催化氧化为乙醛，实质是脱去两个氢原子，我们称之为氧化反应。而乙醛与H2的加成是乙醇催化氧化的相反过程，与氧化反应相对应，此反应还应属于什么反应类型？

〔生〕还原反应。

〔师〕在有机化学反应中，通常把有机物分子中加入氢原子或失去氧原子的反应，叫做还原反应，如乙醛和H2的加成。把有机物分子中加入氧原子或失去氢原子的反应，叫做氧化反应。如乙醇的催化氧化。

〔师〕说明：有机化学反应中的氧化反应、还原反应是针对有机物划分的。实际上都是氧化还原反应，氧化反应和还原反应总是同时进行，相互依存的，不能独立存在。只不过有机化学反应中的氧化反应是有机物被氧化，无机物被还原；还原反应中是有机物被还原，无机物被氧化罢了。

〔设疑〕乙醛可以被还原为乙醇，能否被氧化呢？请同学们根据乙醛分子式中碳的平均化合价进行分析、讨论。

〔生〕由CH3CHO变为CH3CH2OH，碳的平均化合价从-1价降到-2价，CH3CHO被还原。由于CH3CHO中碳的平均化合价为-1价，而碳的最高价态为＋4价，因此乙醛还可以被氧化，发生氧化反应。

〔板书〕(2)氧化反应

〔师〕在一定温度和催化剂存在的条件下，乙醛能被空气中的氧气氧化成乙酸。工业上可以利用此反应制取乙酸。

〔板书〕a．催化氧化

〔师〕根据乙醛的物理性质，说明它还可以燃烧。请同学们写出乙醛完全燃烧的方程式。

〔板书〕b．燃烧

2CH3CHO＋5O2 4CO2＋4H2O

〔过渡〕乙醛不仅能被氧气氧化，还能被某些氧化剂氧化。

〔板书〕c．被弱氧化剂氧化

〔演示实验6-7〕

第一步：在洁净的试管里加入1 mL 2%的硝酸银溶液，边摇动试管，边逐滴滴入2%的稀氨水。

〔问〕大家看到了什么现象？写出化学方程式。

〔生〕生成白色沉淀。

AgNO3＋NH3•H2O AgOH↓＋NH4NO3

第二步：继续滴加稀氨水，至最初产生的沉淀刚好溶解为止。

〔讲述〕大家看到沉淀溶解了，这是因为AgOH和氨水反应生成了一种叫氢氧化二氨合银的络合物，该溶液称为银氨溶液，它是一种弱氧化剂。

〔副板书〕AgOH＋2NH3•H2O 〔Ag(NH3)2〕OH＋2H2O

〔师〕下面我们看一看这种弱氧化剂能否与乙醛发生反应。

〔演示〕第三步：在银氨溶液中滴入3滴乙醛，振荡后放在热水中温热。

现象：试管内壁附上了一层光亮如镜的银。

〔师〕从现象可以看出，反应中化合态银被还原，乙醛被氧化。乙醛被氧化成乙酸，乙酸又和氨反应生成乙酸铵。这个反应叫银镜反应。

〔板书〕Ⅰ．银镜反应

CH3CHO＋2〔Ag(NH3)2〕OH CH3COONH4＋3NH3＋2Ag↓＋H2O

〔师〕从反应断键情况来看，还是 中C—H键断裂，相当于在C—H键之间插入1个氧原子。从化合价升降守恒来看，有1 mol 被氧化，就应有2 mol银被还原。因此银镜反应不仅可用于检验醛基的存在，也常用于测定有机物中醛基的数目。

乙醛不仅可被弱氧化剂银氨溶液氧化，还可以被另一种弱氧化剂氧化。

〔板书〕Ⅱ．和Cu(OH)2反应

〔演示〕P165实验6—8。

现象：试管内有红色沉淀产生。

〔师〕这种红色沉淀是Cu2O。请同学们写出该反应涉及到的化学方程式。

〔学生板演〕CuSO4＋2NaOH Cu(OH)2↓＋Na2SO4

2Cu(OH)2＋CH3CHO Cu2O↓＋CH3COOH＋2H2O

〔师〕由于Cu(OH)2是微溶物，刚制备的Cu(OH)2为悬浊液，放置稍长时间就可生成沉淀。因此实验中所用Cu(OH)2必须是新制的，且NaOH要加得过量一些，因为本实验需在碱性条件下进行。

〔讨论〕乙醛能否使溴水和酸性KMnO4褪色？

〔生〕能。因为溴和酸性KMnO4都是强氧化剂，可以把乙醛氧化。

〔板书〕d．使酸性KMnO4溶液和溴水褪色

〔师〕乙醛的这些重要性质，都有重要用途，下面我们列表总结如下：

〔投影小结〕

乙醛的氧化反应

氧化剂 反应条件 现象 化学反应实质 重要应用

O2 点燃 燃烧有黄色火焰 2CH3CHO＋5O2 4CO2＋4H2O ——

O2 催化剂，加热 —— —CHO变—COOH

2CH3CHO＋O2 2CH3COOH 工业制取乙酸

银氨

溶液 水浴加热 形成银镜 —CHO变—COOH

CH3CHO＋2〔Ag(NH3)2〕OH

CH3COONH4＋2Ag↓＋3NH3＋H2O 工业制镜或保温瓶胆，实验室检验醛基

Cu(OH)2 加热至沸腾 产生红色沉淀 —CHO变—COOH

CH3CHO＋2Cu(OH)2

CH3COOH

＋Cu2O ↓＋2H2O 实验室检验醛基、医学上检验尿糖

〔小结〕通过对乙醛化学性质的学习，证明了同学们的推测完全正确，—CHO中的C O键和C—H键都能断裂。在乙醛和氢气的加成反应中，是C O键断裂，在乙醛被氧化的反应中是C—H键断裂。通过乙醛性质的学习，我们也知道了有机反应中加氧或去氢称为氧化反应，加氢或去氧称为还原反应，虽然和无机化学中对氧化还原反应的定义不同，但本质是一样的。课下请同学们根据有机反应中氧化反应和还原反应的定义，总结你学过的化学反应哪些属于氧化反应，哪些属于还原反应。

〔作业〕P166一、1、3 二、3 四

●板书设计

第五节 乙醛 醛类（一）

一、乙醛

1．分子结构

2．物理性质

3．化学性质

(1)加成反应

(2)氧化反应

a．催化氧化

2CH3CHO＋O2 2CH3COOH(乙酸)

b．燃烧

2CH3CHO＋5O2 4CO2＋4H2O

c．被弱氧化剂氧化

Ⅰ．银镜反应

CH3CHO＋2〔Ag(NH3)2〕OH CH3COONH4＋3NH3＋2Ag↓＋H2O

Ⅱ．和Cu(OH)2反应

d．使酸性KMnO4溶液和溴水褪色

●教学说明

围绕教学重点、难点，主要采用了启发、对比、设疑、实验相结合的方法。

1．充分利用化学实验这一重要媒体，引导学生观察、分析、推理、抽象概括，从而认识乙醛的重要化学性质——加成反应和氧化反应。

2．通过对比有机化学反应中的氧化反应和还原反应，能使学生从本质上认识它们的区别。

3．教学中适时设疑、层层设疑，有利于重点难点知识的突破与跨越，同时培养学生独立思考的习惯。

●参考练习

1．下列试剂，不能用于检验有机物中含有—CHO的是( )

A．金属钠 B．银氨溶剂 C．新制Cu(OH)2 D．溴水

答案：AD

2．由乙炔、苯、乙醛组成的混合物，经测定其中碳的质量分数为72%，则氧的质量分数为______。

解析：将乙醛的分子式作如下变形：C2H4O C2H2•H2O。该混合物可表示为：

•H2O，假设混合物质量为100 g，则m (C)＝100 g×72%＝72 g又方框内有n(C)∶n(H)＝1∶1，那么方框内总质量应为72 g×(12＋1)/12＝78 g，则方框外H2O的质量为100 g-78 g＝22 g，故求得m (O)＝22 g× ＝19.6 g，所以该混合物中氧的质量分数为 ×100%＝19.6%。

答案：19.6%

3．某学生做乙醛还原性的实验，取1 mol•L-1的CuSO4溶液2 mL 和0.4 mol•L-1的NaOH溶液4 mL，在一个试管内混合后加入0.5 mL 40%的乙醛溶液加热至沸，无红色沉淀，实验失败的原因是( )

A．NaOH不够量 B．CuSO4不够量

C．乙醛溶液太少 D．加热时间不够

解析：由于CH3CHO和新制Cu(OH)2的反应必须在碱性条件下进行(即用CuSO4和NaOH反应制备Cu(OH)2时须NaOH过量)，所以本实验失败的原因是NaOH不足。

答案：A

4．在实验室里不宜长期放置，应在使用时配制的溶液是( )

①酚酞试剂 ②银氨溶液 ③Na2CO3溶液 ④Cu(OH)2悬浊液 ⑤酸化的FeCl3溶液

⑥硫化氢水溶液

A．只有②④ B．除①之外 C．只有②④⑥ D．全部

解析：①③⑤在空气中可以稳定存在，因此均可长期存放。②银氨溶液必须随配随用，不可久置，否则会生成易爆炸的物质。④氢氧化铜悬浊液在空气中久置，会变为碱式碳酸铜。⑥H2S水溶液在空气中放置，易被空气中的氧气氧化为S和H2O。

答案：C

乙酸

醋酸（乙酸）的化学性质 不稳定 见光，受热易分解 其分解一般需要的条件是 加热 光照 具有弱酸性，酸性弱于碳酸 2 可以和醇发生酯化反应 3 可以燃烧（很多人可能会想当然地认为不行） 受热分解分子式: 2CH3COOOH=2CH3COOH+O2

乙酸是一种弱酸。乙酸能与乙醇起酯化反应。

1、与钠2、消去3、与氢卤酸取代4、氧化成醛5、酯化

A．高锰酸钾溶液呈紫色，Na 2 SO 3 溶液与高锰酸钾溶液恰好反应时，溶液是无色的，当高锰酸钾过量时溶液呈紫色，用高锰酸钾溶液滴定Na 2 SO 3 溶液至终点：滴入最后一滴高锰酸钾溶液，溶液恰好由无色变为紫色，且半分钟不变色，故A正确；

B．该实验需要量取溶液的体积、称量反应体系的温度和记录溶液变浑浊的时间，故所需的计量仪器有量筒、温度计和秒表，故B错误；

C．溴的萃取实验中，溴水体积较大，四氯化碳体积较小，故C错误；

D．苯酚固体与Na不反应，应为钠与乙醇、苯酚液体的反应可比较羟基上H的活泼性，故D错误．

故选A．

72.7.2.1 氯离子含量的测定

(1)硝酸银容量法

适用油气田水中氯离子含量在100mg/L以上，溴、碘离子合量为氯离子含量的1%以下时的氯离子含量的测定。

试剂

硝酸。

硫酸铝钾溶液(10g/L)。

碳酸钠溶液(0.5g/L)。

硝酸银标准溶液(0.05mmol/L)。

铬酸钾指示剂(0.07mol/L)。

试样处理

无色、透明、含盐度高的油气田水样，以适当稀释(稀释后的试样，氯离子含量应在500～3000mg/L)即可测定。如水中含有硫化氢、悬浮物或水样颜色较深时，则需用加硝酸使水样呈酸性，再煮沸至无硫化氢味另外用硫酸铝钾脱色和消除悬浮物或用灼烧法脱色和消除悬浮物。

测定

量取一定体积油气田水样或经处理后的试样或滤液(试样中氯离子含量应在10～40mg)于锥形瓶中。加水使总体积为50～60mL，用(1+1)HNO3或0.5g/LNa2CO3溶液调节pH值至6.0～8.5，加1mL0.07mol/L铬酸钾指示剂。用硝酸银标准溶液滴至生成淡橘红色悬浮物为终点，用同样方法作空白试验。

按下两式分别计算氯离子的量浓度(mmol/L)和质量浓度(mg/L):

岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术

式中:c(Cl-)为氯离子的量浓度，mmol/Lρ(Cl-)为氯离子的质量浓度，mg/Lc(AgNO3)为硝酸银标准溶液浓度，mol/LV1为滴定消耗硝酸银标准溶液的体积，mLV0为空白试验消耗硝酸银标准溶液的体积，mLV为量取水样体积，mL35.45为氯的摩尔质量数值，单位用g/mol。

(2)离子色谱法

适用于油气田水中氟、氯、溴、硫酸根离子的测定。进样100μL时，最低检测浓度为:F-0.035mg/L、Cl-0.05mg/L、Br-0.2mg/L、SO42-0.3mg/L。

试样处理

量取1.0mL水样放入预处理柱中，除去阳离子、机械杂质和有机化合物。流出液收集于10mL瓶中，用水淋洗预处理柱，收集流出液直至刻度，摇匀，用于氟、氯、溴、硫酸根离子的测定。若各组分含量太高，还需进一步稀释。

色谱条件

阴离子分析柱。

抑制柱。

洗脱液:碳酸钠溶液1.2～1.4mmol/L。

洗脱液流速为1.0mL/min。

记录器纸速为4mm/min。

量程:氯离子5kΩ×1V氟、溴、硫酸根离子5kΩ×50mV。

校准曲线

分别吸取适量的氟离子、氯离子、溴离子和硫酸根离子标准溶液配成4种离子的混合标准系列，含量为见表72.10。

表72.10 氟离子、氯离子、溴离子和硫酸根离子混合标准系列(ρB:mg/L)

按色谱条件调好仪器，待基线稳定后，依次注入50μL不同含量的混合标准溶液，记录各离子的峰高(或峰面积)，并分别绘制各离子的浓度-峰高(或峰面积)校准曲线。

试样测定

与校准曲线相同条件下，注入50μL试液，记录器依次记录各离子的色谱峰。根据各离子的色谱峰高(或峰面积)从相应的标准曲线上求出水样中氟、氯、溴、硫酸根离子的含量，乘以稀释倍数，得原水样中含量(mg/L)。

72.7.2.2 碳酸根、重碳酸根、氢氧根含量的测定

适用于一般油气田水中碳酸根、重碳酸根和氢氧根含量的测定，及水中共存的硼酸盐、硅酸盐、亚硫酸盐和磷酸盐等碱性物质干扰测定。不适用于高含硫化氢、铁离子、水样颜色较深和含有缓蚀剂的所谓特殊油气田水中碳酸根、重碳酸根和氢氧根含量的测定。

试剂

盐酸标准溶液(0.05mol/L)需准确标定浓度。

甲基橙指示剂(1g/L)。

酚酞指示剂(1g/L)(9+1)乙醇溶液。

分析步骤

移取50～100mL刚开瓶塞的水样于锥形瓶中，加2～3滴酚酞指示剂，若水样出现红色，则用盐酸标准滴定溶液滴至红色刚消失，所消耗的盐酸标准溶液的体积(mL)，记作V1再加3～4滴甲基橙指示剂，水样呈黄色，则继续用盐酸标准溶液滴至溶液由黄色突变为橙红色，所消耗的盐酸标准滴定溶液的体积(mL)，记作V2。若加酚酞指示剂后水样无色，则继续加甲基橙指示剂至水样呈黄色，用盐酸标准滴定溶液滴至橙红色为终点。

表72.11 碳酸根、重碳酸根和氢氧根的含量关系

当V1=0时，表明仅有重碳酸根，计算公式如下:

岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术

岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术

当V1<V2时，表明有重碳酸根和碳酸根，无氢氧根，碳酸根计算公式如下:

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当V1=V2时，表明仅有碳酸根，用上述两公式计算其含量。

当V1>V2时，表明有碳酸根和氢氧根，无重碳酸根，计算公式如下:

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当V2=0时，表明仅有氢氧根，计算公式如下:

岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术

式中:c(HCO-3)为重碳酸根的浓度，mmol/Lρ(HCO-3)为重碳酸根的质量浓度，mg/Lc(CO2-3)为碳酸根的量浓度，mmol/Lρ(CO2-3)为碳酸根的质量浓度，mg/Lρ(OH-)为氢氧根的量浓度，mmol/Lρ(OH-)为氢氧根的质量浓度，mg/Lc(HCl)为盐酸标准溶液的浓度，mol/LV1为加酚酞指示剂时，盐酸标准滴定溶液的耗量，mLV2为加甲基橙指示剂时，盐酸标准滴定溶液的耗量，mL61.0、60.01、17.01分别为HCO-3、CO2-3和OH-的摩尔质量数值，单位取g/mol。

72.7.2.3 硫酸根含量测定

(1)重量法

适用于油气田水中含量为80～5000mg/L硫酸根的测定。

试剂

盐酸。

氢氧化铵。

氯化钡溶液(100g/L)。

甲基红指示剂(1g/L)(6+4)乙醇溶液。

试样制备

移取一定体积水样(硫酸根含量应在20～150mg)于烧杯中，加2～3滴甲基红指示剂，加(1+1)HCl酸化样品。置烧杯于电炉上煮沸5min。搅拌下滴加(1+1)NH4OH，使溶液呈碱性，铁离子以氢氧化物沉淀。待沉淀完全后，趁热过滤，将杯中沉淀全部移至滤纸，用热水洗沉淀至滤液无氯离子，滤液和洗涤液一并收集在另一烧杯中。用水冲稀至120～150mL，用于硫酸根测定。

分析步骤

用除去铁离子的滤液测定硫酸根。向滤液中滴加(1+1)HCl使呈酸性，置烧杯于电炉上，煮沸。搅拌下滴加1mLBa(Cl)2溶液。煮沸3～5min。于大约60℃静置4h，用定量滤纸过滤。将烧杯中沉淀全部移至滤纸上，用热水洗沉淀至滤液无氯离子。将滤纸和沉淀放入已恒量的坩埚中，先在电炉上炭化至滤纸变白，最后将坩埚放入高温炉中，升温至800℃，保持30min。停止加热，待炉温降到400℃时取出坩埚，并在干燥器中冷却至室温、称量、再灼烧至恒量。

按下式计算硫酸根含量:

岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术

式中:ρ(SO2-4)为氢氧根的质量浓度，mg/Lc(SO2-4)为氢氧根的量浓度，mmol/Lm1为坩埚质量，gm2为坩埚加沉淀质量，gV为试料体积，mL0.4116为硫酸钡与硫酸根的换算因数96.06为硫酸根的毫摩尔质量数值，单位用mg/mmol。

(2)EDTA容量法

适用于硫酸根含量大于10mg/L的油气田水的测定。

试剂

盐酸

氢氧化铵-氯化铵缓冲溶液pH=10称取27gNH4Cl溶于适量的水中，加197mLNH4OH，再用水冲稀至1L。

EDTA标准溶液(0.0125mol/L)需准确标定浓度。

钡、镁混合标准溶液ρ(Ba，Mg)=1.00mg/mL。

铬黑T指示剂(5g/L)(1+1)三乙醇铵溶液。

甲基红指示剂(1g/L)(6+4)乙醇溶液。

分析步骤

移取一定体积水样(硫酸根含量0.5～7.5mg)于锥形瓶中，加水使总体积为50mL。加1滴甲基红指示剂，滴加(1+1)HCl至溶液呈红色，再滴加1～2滴。将试样煮沸，趁热加入10.00mL钡、镁离子混合标准溶液，边加边摇动锥形瓶。将试液再次煮沸，并在近沸的温度下保持1h，取下静置冷却。加10mL氢氧化铵-氯化铵缓冲溶液，加3～4滴铬黑T指示剂。用EDTA标准溶液滴至纯蓝色为终点。消耗EDTA标准溶液体积V1(mL)。

移取50mL蒸馏水于锥形瓶中，依次取10.00mL钡、镁混合标准溶液，10mL氢氧化铵-氯化铵缓冲溶液和3～4滴铬黑T指示剂。用EDTA标准溶液滴至纯蓝色为终点。消耗EDTA标准溶液体积V2(mL)。

移取一定体积水样(硫酸根含量0.5～7.5mg)于锥形瓶中，加水使总体积为50mL，加10mL氢氧化铵-氯化铵缓冲溶液、3～4滴铬黑T指示剂，用EDTA标准溶液滴至纯蓝色为终点。消耗EDTA标准溶液V3(mL)。

按下式计算硫酸根的含量:

岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术

式中:ρ(SO2-4)为试液中硫酸根的质量浓度，mg/Lc(EDTA)为EDTA标准溶液浓度，mol/LV为试液体积，mL96.06为硫酸根的摩尔质量数值，单位取g/mol。

72.7.2.4 镁、钙、锶、钡离子含量的测定

适用于油气田水中镁、钙、锶、钡(锶、钡合量)含量的测定。

(1)配位滴定法

试剂

氯化铵。

盐酸。

氢氧化铵。

氢氧化铵-氯化铵缓冲溶液(pH=10)称取27gNH4Cl溶于适量的水中，加197mLNH4OH，再用水冲稀至1L。

硫酸钠溶液(50g/L)。

EDTA标准溶液(0.0125mol/L)。

氢氧化钠溶液(40g/L)。

钙试剂指示剂称取0.5g钙试剂和硫酸钾于玛瑙乳钵中，仔细研磨，保存在干燥器中。

铬黑T指示剂(5g/L)(1+1)三乙醇铵溶液。

分析步骤

A.除铁离子量取一定体积水样(钙含量应在100mg)于烧杯中，加水至总体积80mL，加0.3gNH4Cl，用(1+1)HCl调节至pH3～4。在电炉上煮沸，搅拌下滴加5～10mLNH4OH煮沸1min。趁热过滤，用热水洗沉淀至无氯离子。滤液和洗涤液一并收集在另一烧瓶中，置烧杯于电炉上，煮沸、逐尽氨，冷却至室温后，用(1+99)HCl调节至pH3～4。移入250mL容量瓶中，定容、摇匀。用于镁、钙、锶、钡离子总量的测定。

B.镁、钙、锶、钡离子总量的测定

移取一定体积滤液于锥形瓶中，加水至总体积80mL，加10mL氢氧化铵-氯化铵缓冲溶液，加3～4滴铬黑T指示剂。用EDTA标准溶液滴至纯蓝色为终点，消耗EDTA标准溶液体积V1(mL)。

C.镁、钙离子合量的测定

移取一定体积滤液(钙含量应在40mg左右)于烧杯中，加水至120mL，置烧杯于电炉上，加热至微沸，搅拌下滴加10mL硫酸钠溶液，煮沸3～5min。于约60℃静置4h，将溶液和沉淀一并移入250mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。放置数分钟后，在滤纸上干过滤，滤液已除去钡、锶离子，用于测定镁、钙合量。移取与测镁、钙、锶、钡离子总量的原水样体积相同的滤液于锥形瓶中，加水使总体积为80mL，加10mL氢氧化铵-氯化铵缓冲溶液，加3～4滴铬黑T指示剂。用EDTA标准溶液滴至纯蓝色为终点，消耗EDTA标准溶液体积V2(mL)。

D.钙离子的测定

使用除去钡、锶离子得到的滤液测定钙离子含量。移取与测镁、钙离子合量的体积相同的滤液于锥形瓶中，加水至总体积80mL，加10mL40g/LNaOH溶液，加3mg钙试剂。用EDTA标准溶液滴至纯蓝色为终点，消耗EDTA标准溶液体积V3(mL)。

按下列各式计算镁、钙、锶、钡的含量:

岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术

式中:c(Ca2+)为试样中Ca2+的量浓度，mmol/Lρ(Ca2+)为试样中Ca2+的质量浓度，mg/Lc(Mg2+)为试样中Mg2+的量浓度，mmol/Lρ(Mg2+)为试样中Mg2+的质量浓度，mg/Lc(Ba2++Sr2+)为试样中Ba2+和Sr2+的量浓度，mmol/Lρ(Ba2+)为试样中Ba2+和Sr2+的质量浓度，以Ba计，mg/Lc(EDTA)为EDTA标准溶液浓度，mol/LV1为测镁、钙、锶、钡离子合量时，EDTA标准滴定溶液耗量，mLV2为测镁、钙离子合量时，EDTA标准滴定溶液耗量，mLV3为测钙离子时，EDTA标准滴定溶液耗量，mLV为量取原水样体积，mL:40.08、24.305、137.34分别为钙、镁、钡离子的摩尔质量数值，单位取g/mol。

(2)离子色谱法

适用于油气田水中镁、钙、锶、钡离子含量的测定。进样100μL时，最低检测浓度为:Mg2+0.10mg/L、Ca2+0.20mg/L、Sr2+1.20mg/L、Ba2+2.00mg/L。

A.镁、钙、锶离子的测定

色谱条件

洗脱液乙二胺(0.8mmol/L)与柠檬酸(1.0mmol/L)混合液。

镁、钙、锶离子分析柱。

记录器纸速4mm/min。

洗脱液流速0.8mL/min。

量程500Ω×10mV。

校准曲线

分别移取适量的镁、钙、锶标准溶液按表72.12配成3种元素的混合标准系列。

表72.12 镁、钙、锶混合标准系列(ρB:mg/L)

按色谱条件将仪器准备好，待基线稳定后。顺序注入50μL混合标准系列溶液1～5，根据各离子浓度和记录的3种离子的峰高(或峰面积)，绘制校准曲线。

试样测定

按校准曲线同样条件操作，注入50μL经适当稀释后的水样，记录的3种离子的峰高(或峰面积)，从相应的校准曲线上求出稀释水样中镁、钙、锶离子的含量，乘以稀释倍数，得到原水样中各离子含量(mg/L)。

B.钡离子的测定

色谱条件

洗脱液乙二胺硝酸盐溶液(2mmol/L，pH值5.9～6.1)。

钡离子分析柱。

记录器纸速4mm/min。

洗脱液流速0.9mL/min。

量程:200Ω×5mV。

校准曲线

移取适量的钡标准溶液配成钡离子标准系列:4.0mg/L、8.0mg/L、16.0mg/L、24.0mg/L、32.0mg/L。

按色谱条件将仪器准备好，待基线稳定后。顺序注入50μL钡离子标准系列溶液，根据钡离子浓度和记录的峰高(或峰面积)，绘制校准曲线。

试样测定

按校准曲线同样条件操作，注入50μL经适当稀释后的水样，记录的钡离子的峰高(或峰面积)，从校准曲线上求出稀释水样中钡离子的含量，乘以稀释倍数，得到原水样中钡离子含量(mg/L)。

72.7.2.5 碘、溴离子含量的测定

采用碘量法测定油气田水中含量大于5mg/L的碘离子及含量大于20mg/L的溴离子。

试剂

碘化钾。

氯化钠。

磷酸。

硝酸。

冰乙酸。

饱和溴水。

氢氧化钠溶液(40g/L)。

碳酸锌悬浮液将10g碳酸锌溶于200mL水中，与100mL100g/LNaOH溶液混合。

甲酸钠溶液(100g/L)。

苯酚乙醇溶液(200g/L)将100g苯酚溶于100mL无水乙醇中，加水至500mL，摇匀。

醋酸钠溶液(200g/L)。

次氯酸钠溶液(200g/L)。

硫代硫酸钠溶液标准溶液(30mmol/L)。

甲基橙指示剂(1g/L)。

淀粉指示剂(5g/L)

水样处理

量取一定体积水样于烧杯中，加两滴硝酸，放置1～2h后，加40g/LNaOH溶液至铁离子完全沉淀，加5～10mL碳酸锌悬浮液，在电炉上加热至微沸，冷却后移入250mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。干过滤，该滤液已除去硫化氢、铁离子、锰离子和有机物，用于碘、溴离子的测定。

碘离子的测定

量取一定体积上述处理的滤液(碘离子含量应在1～2mg)于碘量瓶中，加1～2滴甲基橙指示剂，加冰乙酸使溶液呈酸性，再加2～3mL饱和溴水，盖紧，放置10～15min。滴加甲酸钠溶液分解过剩溴，直至溴的颜色褪尽，再补加1mL苯酚乙醇溶液，用水沿瓶口冲洗两次。加8～10mLH3PO4、0.5gKI，盖紧，置于暗处，5min后用硫代硫酸钠溶液标准溶液滴至淡黄色时加1mL淀粉指示剂，继续滴至蓝色消失为终点，消耗硫代硫酸钠标准溶液V1(mL)。同样方法作空白试验，空白消耗硫代硫酸钠标准溶液体积V0(mL)。

碘、溴离子合量的测定

量取一定体积上述处理的滤液(溴含量应在1～10mg)于碘量瓶中，加水稀释至50mL，加2mL冰乙酸，滴加40g/LNaOH溶液至沉淀生成为止。然后滴加冰乙酸至沉淀溶解。此时溶液的pH值为6.0～6.5。加5mL200g/LNaAc溶液，如有沉淀出现，则应补加冰乙酸使沉淀完全溶解。在电炉上煮沸2～3min后，在冷水中将试液冷却至室温。加0.5gKI(此时试液应无色，否则应重做)。再加20mL(1+1)HCl，加入10mL次氯酸钠溶液，放置10～15min。盖严，在暗处放置5min，用硫代硫酸钠标准溶液滴至淡黄色，加1mL淀粉指示剂，继续滴至溶液蓝色褪尽为终点。消耗硫代硫酸钠标准溶液体积为V2(mL)。同样方法作空白试验(空白中加0.5gNaCl)。空白消耗硫代硫酸钠标准溶液体积为V3(mL)。

按下式计算水样中碘、溴离子含量:

岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术

式中:ρ(I-)为原水样中碘离子的质量浓度，mg/Lρ(Br-)为原水样中溴离子的质量浓度，mg/Lc为硫代硫酸钠标准溶液浓度，mol/LV0为测碘空白时，消耗硫代硫酸钠标准溶液体积，mLV1为测碘时，消耗硫代硫酸钠标准溶液体积，mLV2为测碘、溴离子合量时，消耗硫代硫酸钠标准溶液体积，mLV3为测碘、溴离子合量空白时，消耗硫代硫酸钠标准溶液体积，mLV'为测碘离子时，量取水样体积，mLV″为测碘、溴离子合量时，量取水样体积，mL21.15、13.32分别为1/6I与1/6Br的摩尔质量数值，单位取g/mol。

72.7.2.6 硼含量的测定

适用于油气田水中含量大于10mg/L无机硼的测定。

试剂

甘露醇。

盐酸。

氯化钡溶液(100g/L)。

饱和氢氧化钡溶液。

氢氧化钠标准溶液(0.05mmol/L)需准确标定。

酚酞指示剂(1g/L)(9+1)乙醇溶液。

甲基红指示剂(1g/L)(6+4)乙醇溶液。

试样处理

量取100mL含硼水样于烧杯中，加两滴甲基红指示剂，加(1+1)HCl使呈酸性。煮沸、搅拌下滴加5～10mLBaCl2溶液，硼酸盐转化为硼酸，硫酸根以钡盐沉淀下来，二氧化碳、硫化氢则以气态逸出。再加氢氧化钡溶液使呈碱性，煮沸，以除去铵、铁、铝离子。冷却后移入250mL容量瓶中，定容、摇匀，干过滤于锥形瓶中，用于硼的测定。

硼的测定

量取一定体积滤液(硼含量应在2～10mg)于碘量瓶中。加两滴甲基红指示剂，滴加(1+1)HCl使呈酸性，煮沸10min逐尽二氧化碳并分解硼酸盐，立即置于冷水中冷却。从滴定管逐滴加入氢氧化钠标准溶液调节试样溶液的pH值，至溶液由红色刚变为黄色为止。按每100mL溶液加3g甘露醇的比例加入甘露醇，再加2～3滴酚酞指示剂，用氢氧化钠标准溶液继续滴定至溶液变为红色。再加少许甘露醇，若溶液的红色消失，则应补滴氢氧化钠标准溶液，直至红色不消失为终点。消耗氢氧化钠标准溶液体积V1(mL)。以同样方式做空白试验，消耗氢氧化钠标准溶液体积为V0(mL)。

按下式计算试样中硼的质量浓度:

岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术

式中:ρ(B)为试样中硼的质量浓度，mg/Lc为氢氧化钠标准溶液浓度，mol/LV1为测定硼时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积(不包括调节pH值时的耗量)，mLV0为空白试验时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mLV为量取水样体积，mL10.81为硼的摩尔质量数值，单位取g/mol。

72.7.2.7 钠、钾、锂、铵离子含量的测定(离子色谱法)

油气田水中以钠(钠+钾)、镁、钙、钡(钡+锶)、氯、硫酸根和重碳酸根(其中钡和硫酸根离子不能共存于同一水体中)等离子为主。根据溶液电中性原理，所有阴离子带负电荷的总和，应等于所有阳离子带正电荷的总和。当测出除钠离子外的其他5种离子的含量，即可计算出钠离子(包括锂、铵、钾及许多未被测定的阳离子)的含量:

岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术

也可采用离子色谱法等其他方法直接测定钠、钾、锂、铵离子。

离子色谱法适用于油气田水中锂、钠、铵、钾离子的测定。进样100μL时，测定限分别为:Li-0.01mg/L、Na-0.03mg/L、NH-40.05mg/L、K-0.20mg/L。

色谱条件

洗脱液硝酸溶液2.8mmol/L。

记录器纸速4mm/min。

洗脱液流速0.5mL/min。

分析柱锂、钠、铵、钾离子的分析柱。

量程锂、铵、钾离子100Ω×5mV，钠离子100Ω×50mV。

校准曲线

移取适量锂、铵、钾标准溶液按表72.13配成锂、铵、钾混合标准系列。

表72.13 镁、钙、锶混合标准系列(ρB:mg/L)

移取适量的钠标准溶液配成钠离子标准系列:5.00mg/L、10.00mg/L、20.00mg/L、30.00mg/L、40.00mg/L、50.00mg/L。

按色谱条件将仪器准备好，待基线稳定后。顺序注入50μL锂、铵、钾混合标准系列溶液和钠离子的标准溶液系列。根据各离子浓度和记录的峰高(或峰面积)，绘制校准曲线。

分析步骤

按校准曲线同样条件操作，注入50μL经适当稀释后的水样，记录的3种离子的峰高(或峰面积)，从相应的校准曲线上求出稀释水样中锂、铵、钾、钠离子的含量，乘以稀释倍数，得到原水样中各离子含量(mg/L)。

72.7.2.8 电感耦合等离子体发射光谱法测定油气田水中钠、钾、钙、镁等阳离子

方法提要

油气田水经适当稀释、酸化后，直接用ICP-AES法测定钠、钾、钙、镁、锂、铷、锶、钡、硼、硫等元素。以Sc为内标补偿高盐试样的基体效应。

仪器

电感耦合等离子体发射光谱仪。

试剂

盐酸。

各元素标准储备溶液配制见表72.14。

表72.14 各元素标准储备溶液

由以上标准储备溶液配制组合标准溶液，见表72.15。表72.15 组合标准溶液

岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术

Sc内标元素溶液ρ(Sc)=100μg/mL用Sc2O3(光谱纯)配制，测定时通过三通在线引入。

分析步骤

取适量油气田水，用(5+95)HCl稀释。一般控制稀释后试液的总盐量小于5g/L为宜。

以IRIS-INTREPID型ICP-AES为例的仪器工作参数见表72.16。

表72.16 TJA-IRIS-Intrepid型ICP-AES工作参数

各元素分析谱线波长见表72.17。

表72.17 各元素分析谱线波长

点燃等离子炬，稳定30min以上。以(5+95)HCl为低点，组合标准溶液为高点建立校准曲线，然后分析试样。校准和分析过程中，通过三通在线引入Sc内标溶液，以补偿较高含量的Na造成的基体效应。由计算机根据取样量和稀释倍数，给出分析结果。

72.7.2.9 电感耦合等离子体质谱法测定油气田水中痕量元素

方法提要

油气田水经适当稀释、酸化后，直接用ICP-MS法测定锂、铷、铯、锶、钡、硼、溴、碘、锗、砷、铜、铅、锌、铀等元素。

仪器

电感耦合等离子体质谱仪。

试剂

纯化水经纯化水系统处理达到18MΩ·cm-1。

硝酸BVIII级。

单元素标准储备溶液ρ(B)=1.00mg/mL。

组合标准储备溶液ρ(B)=20.0μg/mL，见表72.18。

表72.18 组合标准储备溶液

由组合标准储备溶液稀释为ρ(B)=20.0ng/mL的组合标准工作溶液。

内标溶液ρ(Rh，Re)=20.0ng/mL。

分析步骤

取适量油气田水，用(2+98)HNO3稀释。一般控制稀释后试液的总盐量小于1g/L为宜，当盐样纯度较高时，其水不溶物滤液稀释10～20倍即可。

以TJAExCell型ICP-MS为例的仪器工作参数及选用测定同位素见表72.19(表72.20)。

表72.19 ICP-MS工作参数(以TJAPQ-ExCell型为例)

表72.20 选用同位素、内标

点燃等离子体，稳定15min后，用仪器调试溶液进行参数调试，达到铟(1ng/mL)的计数率大于20000s-1。

用高纯水和20ng/mL组合标准溶液进行校准。以高纯水为低点，以组合标准溶液为高点，得到各元素的两点标准化直线，然后对试样溶液进行测定。在整个测定过程中，始终通过三通和多道蠕动泵将内标溶液与试样溶液及空白、标准溶液进行在线混合后引入仪器，计算机监测内标元素计数率的变化，借此对仪器漂移和试样溶液的基体效应对待测元素的影响进行实时校正。

计算机根据事先输入的稀释倍数，给出分析结果。

注意事项

1)ICP-MS法测定碘时存在较严重的记忆效应，在试样测定的间隔使用蠕动泵快速引入(2+98)氨水清洗进样系统，可在10s左右使碘的信号强度降至背景水平。

2)较高含量的锶、钡、硼采用ICP-AES法的分析结果。

本法还可同时测定Sc、Ti、V、Cr、Mn、Co、Ni、Ga、As、Rb、Sr、Cd、Cs、REEs、Hf、Ta、W、Tl、Bi、Th等元素。

方法中没有注明浓度的为无水乙醇。

苯酚钠：称取62.5+g苯酚溶于少量酒精中，加2+mL甲醇和18.5+mL丙酮，酒精定容至100+mL(A液)。称取27+g+NaOH，定容至100+mL(B液)。两者均置于4+℃冰箱中。使用时，两者各取20+mL混合，定容至100+mL。

提取基因组DNA和细胞核DNA是不同的方法

提取细胞核要先把细胞破碎分离出细胞核，要在甘油或其他保护剂中进行

SDS十二烷基磺酸钠：可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离

CATB是一种抽提液，破坏细胞膜的~具体忘了~

DNA不溶于异丙醇，异丙醇可以析出DNA，产生白色絮状沉淀，用枪头挑出就可以了

以下是一些具体方法，希望有用

基因组DNA提取方法

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法,碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等

试验步骤：

1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。

2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。

3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混匀。

4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀，50℃水浴3h,

5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相

6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min.。

7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。

2500rpm,离心10min。弃上清。

8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。

9、12000r/min,室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。

外周血DNA提取技术

分离外周血白细胞提取方法：

试验步骤：

1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。

2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。

3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。

4、2500rpm离心10min，弃上清。

5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。

6、3000rpm离心10min，弃上清。

7、倒置离心管，去掉残液。

8、得白细胞，－80?C冻存。

试验要求：

血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。

氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：

试验试剂：

Ligsisbuffer：

133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。

ACD抗凝剂：柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。

提取缓冲液（Extractionbuffer）：

10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌

试验步骤：

1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。

2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。

3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。

4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5、每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。

6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

7、取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。

9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。

10、加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。

NaI提取法提取外周血白细胞基因组：

实验步骤：

1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm离心12min。

2、弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。

3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。

4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。

5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。

6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。

7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

常用的外周血白细胞基因提取方法：

试验原理：

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

试验步骤：

1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。

2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。

3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。

4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

真核细胞DNA的制备

一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：

1、防止和抑制DNase对DNA的降解。

2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

试剂准备：

1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8)1mMEDTA(pH8.0)。

2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4)200mMNaCl5mMKCl。

3、裂解缓冲液：250mMSDS使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

4、20%SDS

5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris饱和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、无水乙醇、75%乙醇

试验步骤：

材料处理：

1、新鲜或冰冻组织处理：

1)取组织块0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。

2)将匀浆液转移到1.5ml离心管中。

3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。

4)60°C水浴1-3hr。

2、培养细胞处理：

1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。

2)离心4000g×5min，去除上清液。

3)加10倍体积的裂解缓冲液。

4)50-55°C水浴1-2hr。

DNA提取：

1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。

2、离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。

3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。

5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。

7、待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。

8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。

9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。

植物组织中DNA的提取

试验原理：

脱氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。

植物DNA的SDS提取法：

试验试剂：

1、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。

2、10×SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。

3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。

4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。

5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。

6、氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。

7、5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。

9、1mol／LHCl。

10、0.2mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液〔浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。

12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。

13、0.05mol/LNaOH。

14、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。

实验步骤：

1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。

2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。

3、离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4、将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液〔提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）〕，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。

5、再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。

6、用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。

7、然后加入0.5ml左右的10×SSC，使最终浓度为1×SSC。

8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

9、加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。

10、加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。

11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。

植物DNA的CTAB提取法：

试验步骤：

1、称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。

2、将粉末转移到加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65℃水浴中，温育30min。

3、取出离心管,冷却至室温，加入氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。

4、将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300rpm离心20min。

5、转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。

6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中过夜。

7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗30min。

8、离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。

9、将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存。

细菌DNA的提取方法

针对一些不易于提取的细菌的方法:

试验试剂：

抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)

25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl

10MLiCl

2MLiCl

DEPC-water（抑制RNA酶活性）

3MNaAc(pH5.2)

96%乙醇

70%乙醇

试验步骤：

1、抽提缓冲液65℃预热。

2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。

3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12,000rpm，离心10min。

4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12,000rpm，离心10min。

5、重复再作一次步骤4。

6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C下沉淀。

7、以2,000rpm，离心10min。

8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。

较为常用的细菌DNA提取方法：

实验步骤：

1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。

2、取1.5ml培养物12000rpm离心2min。

3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.

4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。

5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．

真菌DNA提取总结的两种方法：

第一种方法：

试验步骤：

1、取真菌菌丝0.5g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。

3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。

4、以4℃，1000rpm，离心5min。

5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

6、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min。

7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下处理1h。

9、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc,2.5倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc。

第二种方法：

试验步骤：

1、真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次。

3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。

4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）。

5、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30min。

6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1h。

8、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

9、取上清，1/10V3MNaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

植物基因组提取(CATB法)

作者：时间：2008-05-13 14:26:27 来源: 生物谷 浏览评论

一、实验目的

掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。

二、实验原理

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

三、实验材料

水稻幼叶

四、主要配方

2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇 （400ul） 氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

五、实验步骤

1. DNA的提取

（1） 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。

（2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；

（3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；

（4） 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌中，磨碎液的高度约占管的三分之二；

（5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；

（6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀；

（7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌中；

（8） 10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；

（9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；

（11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解；

（12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；

（13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；

（14）加入50 µl 0.5 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解；

（15）置于-20℃保存、备用。

2. DNA质量检测

琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。

六、 注意事项

（1）叶片磨得越细越好。

（2）移液器的使用。

（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。