请问HPLC是做什么的

原理：

储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别。

被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据就可以以图谱形式打印出来，以便研究人员分析。

扩展资料：

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。

①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。

②高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。

③高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。

④高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级。

⑤应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。

⑥柱子可反复使用：用一根柱子可分离不同化合物

⑦样品量少、容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。

高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。

HPLC使用的色谱柱是很细的(1~6 mm)，所用固定相的粒度也非常小（几μm到几十μm)，所以流动相在柱中流动受到的阻力很大，在常压下，流动相流速十分缓慢，柱效低且费时。

为了达到快速、高效分离，必须给流动相施加很大的压力，以加快其在柱中的流动速度。为此，须用高压泵进行高压输液。高压、高速是高效液相色谱的特点之一。HPLC使用的高压泵应满足下列条件：

a. 流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围（一般为1~10 mL/min)；

b. 能抗溶剂腐蚀；

c. 有较高的输液压力；对一般分离，60×10^5Pa的压力就满足了，对高效分离，要求达到150~300×10^5Pa。

⑴往复式柱塞泵

当柱塞推入缸体时，泵头出口（上部）的单向阀打开，同时，流动相进入的单向阀（下部）关闭，这时就输出少量的流体。

反之，当柱塞向外拉时，流动相入口的单向阀打开，出口的单向阀同时关闭，一定量的流动相就由其储液器吸入缸体中。这种泵的特点是不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，连续供给恒定体积的流动相。

⑵气动放大泵

其工作原理是：压力为 p1 的低压气体推动大面积（ SA ）活塞A ，则在小面积（ SB ）活塞 B 输出压力增大至 p2 的液体。压力增大的倍数取决于 A 和 B 两活塞的面积比，如果 A 与 B 的面积之比为 50 : 1 ，则压力为 5 × Pa 的气体就可得到压力为 250×Pa 的输出液体。这是一种恒压泵。

参考资料：百度百科——高效液相色谱

百分之十的聚乙二醇是色谱柱。

系列产品无毒、无刺激性，味微苦，具有良好的水溶性，并与许多有机物组份有良好的相溶性。它们具有优良的润滑性、保湿性、分散性、粘接剂、抗静电剂及柔软剂等，在化妆品、制药、化纤、橡胶、塑料、造纸、油漆、电镀、农药、金属加工及食品加工等行业中均有着极为广泛的应用。

色谱

是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等，其粒度一般为3,5,7,10μm等，柱效理论值可达5~16万/米。

（通常用的最多的是第二种，即分配平衡，）色谱分离原理

高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。

1．液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。

2．液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。

涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。

正相色谱法 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。

反相色谱法 一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。

正相色谱法与反相色谱法比较表

正相色谱法 反相色谱法

固定相极性 高～中 中～低

流动相极性 低～中 中～高

组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出

从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。

3．离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。

缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。

离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。

4．离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。

分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。

分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。

离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。

5．排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。

高效液相的原理：

液相色谱是一类分离与分析技术，其特点是以液体作为流动相，固定相可以有多种形式，如纸、薄板和填充床等。

在色谱技术发展的过程中．为了区分各种方法，根据固定相的形式产生了各自的命名，如纸色谱、薄层色谱和柱液相色谱。

液相色谱是一类分离与分析技术，其特点是以液体作为流动相，固定相可以有多种形式，如纸、薄板和填充床等。

在色谱技术发展的过程中．为了区分各种方法，根据固定相的形式产生了各自的命名，如纸色谱、薄层色谱和柱液相色谱。

经典液相色谱的流动相是依靠重力缓慢地流过色谱柱，因此固定相的粒度不可能太小(100μm～150μm左右)。

分离后的样品是被分级收集后再进行分析的，使得经典液相色谱不仅分离效率低、分析速度慢，而且操作也比较复杂。

直到20世纪60年代．发展出粒度小于10μm的高效固定相，并使用了高压输液泵和自动记录的检测器，克服了经典液相色谱的缺点，发展成高效液相色谱，也称为高压液相色谱。

扩展资料：

高效液相统称为高柱效、高压力、高效率的液相色谱。

根据液相色谱原理，对物质进行分离。其原理可采用分配色谱，也可采用吸附色谱等等，其大体结构为：

泵（用来输送流动相，即溶剂/洗脱液,A相一般为水溶性溶剂，B相一般为有机溶剂，如乙腈、甲醇等），调节阀（分为单向或双向调节阀），色谱柱（用来分离物质，物质一般加在柱头），检测器（检测物质分离情况，一般可分为紫外，蒸发光散射等等）。

根据泵的结构可分为一元泵、二元泵、四元泵等，根据泵的压力可分为低压单元、高压单元等。

高效液相色谱法有“四高一广”的特点：

①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。

②高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。

③高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。

④高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级。

⑤应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。

⑥柱子可反复使用：用一根柱子可分离不同化合物

⑦样品量少、容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。

高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。

参考资料来源：百度百科-液相色谱

百度百科-高效液相色谱

高效液相色谱中固定相可分为正向色谱和反向色谱1 正相色谱法采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷）常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等

高效液相色谱柱大致可分为五类:一、高效反相液相色谱柱以C18为代表的高效反相液相色谱柱一直被描述为药物发现、开发、方法验证(validation)的心脏! 高效反相液相色谱柱也极其广泛应用在药物代谢及动力学、生命科学、医疗健康、生物分析检测、毒品和兴奋剂检测、食品安全分析、环境分析、军事、国土安全等领域! 高效反相液相色谱制备柱也是最重要的分离纯化技术之一! 无论是过去，现在和可预见的未来, 以球形B型硅胶(5um 或 3um)为材料骨架的高效反相液相色谱柱在实际应用中永远占有统治地位!常规HPLC方法的开发几乎总是从C18作为出发点，反相色谱占了80%以上的应用。 过去数十年来, 无数努力集注于: 1) 改善硅胶的品质, 优化键合化学2)开发新颖的材料骨架替代硅胶。十多年前, 使用有机硅材料取代无机硅材料作为起始原料生产球形硅胶代表一个划时代的革命! 生产的球形硅胶命名为B型球形硅胶。无机A型硅胶重金属含量很高, 硅胶表面若干位置严重酸化及螯合效应等导致许多碱性化合物回收率低。球形B型硅胶重金属含量很低, 在非常大的程度上消除了A型无机硅胶表面若干位置严重酸化及螯合效应等问题。用B型球形硅胶合成高效液相色谱填料, 导致高效液相色谱柱产品质量有质的飞跃!然而，另一方面，基于客户的大量反馈和我们对几乎所有色谱厂商产品的评估, 我们相信键合化学问题没有获得很好的解决。具体体现在:

(1) “纯粹”反相机理的键合相例如C18和C8市场上仍然是单功能，三功能和聚合物键合相"鱼目混杂"。 (2) 键合相封端问题没有获得很好的解决, 一直是困扰色谱领域最大的问题! 迄今为止全部的尝试只获得有限的成功。

(3) 极性嵌入式(Polar embedded)键合相

极性嵌入式(Polar embedded)键合相是C18高效反相液相色谱"卫星群"中最重要的产品, 是C18和C8键合相最重要的补充。

极性嵌入式(Polar embedded)键合相起源于Supelco ABZ。Supelco ABZ的键合方法是用aminopropyl键合相和长链羧酸缩合反应形成一个C16酰胺。那么市场上的极性嵌入式(Polar embedded)键合相群的主要问题是什么? 极性嵌入式键合相和所谓的水相C18主要问题是键合相泄漏, 键合相不稳定等。两者之间的内在差异是: 极性嵌入式键合相键合相泄漏和键合相不稳定等问题能够获得很好的解决, 但使用极性硅烷试剂封端的所谓的水相C18键合相键合相泄漏和键合相不稳定等问题是不可逆转的。 在类似C18链长度的硅烷试剂中嵌入极性酰胺或酰酯, 使得键合相亲水, 在100%水相条件下稳定。但按照类似C18的键合化学, 键合覆盖率低, 键合相不稳定。 Chrom-Matrix InnovationTM PEG键合相是非常极性的产品, 但测试结果表明: PEG键合相非常稳定, 在LC-MS测试中没有检测到泄漏。这一成功和我们在胶体与界面科学领域的长期经验帮助我们成功开发了新型催化条件下新的键合化学。加上超临界流体技术封端, Chrom-Matrix InnovationTM 极性酰胺或酰酯键合相比那么市场上的极性嵌入式(Polar embedded)键合相群稳定得多。色谱柱产品质量和寿命有质的飞跃! 即使这样, LC-MS测试显示: Chrom-Matrix InnovationTM 极性酰胺或酰酯键合相仍然有非常低的泄漏。(4) 无泄漏低孔和高比表面积C18键合相等是小分子化合物分离纯化的终端保证!制备型高效反相液相色谱柱, 制备型高效正相液相色谱柱, 制备型高效离子交换色谱柱和对应的闪光色谱(flash chromatograpy) 是小分子化合物分离纯化最重要的终端保证!但是市场上大多数色谱产品和闪光色谱(flash chromatograpy)键合相有明显的泄漏。尽管泄漏在紫外可见检测器中是看不见的, LC-MS信号非常明显! 最重要的是泄漏的硅烷实实在在洗脱到顾客的终端纯化产品中, 而且没有考虑在内。

Chrom-Matrix公司成功地解决了上述所有问题! InnovationTM所有反相高效液相色谱产品都使用B型球形硅胶合成, 使用最优化个性化合成工艺, 使用超临界流体封端, 使用LC-MS/MS和表面电荷滴定等多种独特技术配合多种色谱测试保证产品的品质和批次重现性。其中大部分产品LC-MS/MS测试无泄漏, 极性嵌入式(Polar embedded)键合相非常低的泄漏。二、高效正相液相色谱柱正相液相色谱是最早的色谱模式。直到现在, 合成后通过硅胶柱做进一步纯化仍然是有机化学家日常工作的一个重要组成部分。在理论上, 几乎所有的溶于正己烷，乙酸乙酯或异丙醇的有机化合物都可以用高效正相液相色谱分析。但在实际应用中，高效正相液相色谱的应用比高效反相色谱少得多。这是因为正己烷, 乙酸乙酯没有像水，甲醇或乙腈那样受欢迎。此外, A型硅胶正相液相色谱给客户一个惯性思维: 高效正相液相色谱的平衡时间很长。事实上, 高效正相液相色谱在制备规模的色谱纯化中一直发挥了重要作用。这是因为:(1) 高效正相液相色谱比高效反相色谱柱压低得多。(2) 高效正相液相色谱用的溶剂例如正己烷, 乙酸乙酯很容易通过旋转蒸发除去。(3) 吡咯等蒸发性溶剂彻底改善了碱性有机化合物在B型球形硅胶, Diol和PEG正相液相色谱柱上的峰形。此外, 不管制备规模或分析测试,(1) 结构异构体分离分析必须使用正相液相色谱或超临界流体色谱。(2) 环境中腐殖酸的结构鉴定必须使用甲基化或硅烷化消除小分子聚集, 然后使用正相液相色谱或超临界流体色谱。这种小分子聚集的自然现象一定相当广泛。PEG正相液相色谱键合相等将让客户重新评估高效正相液相色谱的价值。三、高效亲水液相色谱柱 高效亲水液相色谱是一个介于正相和反相高效液相色谱之间的运作模式。这个模式最早来自NH2色谱柱的糖分析应用。在此之后，逐步在Diol, 硅胶和亲水性高分子键合相找到了一些有价值的应用。近年来，高效亲水液相色谱成为比较流行的色谱的运作模式, 主要是因为亲水性化合物有良好的保留和高效亲水液相色谱在LC-MS/MS中的应用。尽管如此，迄今为止没有权威的论文, 评论和教科书揭示了高效亲水液相色谱真正的价值和局限性。近年来，我们帮助客户采用高效亲水液相色谱的运作模式成功地开发和验证了数以百计的HPLC和LC-MS/MS应用。我们总结出:(1) 高效亲水液相色谱是LC-MS/MS应用的第一选择。请参阅我们的LC-MS/MS产品手册应用案例。(2) 除了InnovationTM TX多功能色谱柱, 所有亲水液相色谱仅可用于分析，而不是制备规模的分离。(3) 高效亲水液相色谱流动相A是乙腈(pH值用少量的甲酸或其他调节), 流动相B是水(pH值用少量的甲酸或其他调节)。化合物洗脱秩序类似于正相液相色谱, 疏水性化合物首先洗脱, 然后是亲水化合物。流动相A一般不使用甲醇或丙酮或其他有机溶剂。(4) 进样体积太大会导致一些峰值扭曲或分裂。柱承载能力通常是非常小的。(5) InnovationTM TX, HP Amide, Silica三种高效亲水液相色谱覆盖99 ％以上的应用, NH2色谱柱用于简单糖分析应用。(6) 除了InnovationTM TX多功能色谱柱, 所有亲水高效液相色谱柱柱效不如正相和反相高效液相色谱。四、高效强阳离子交换液相色谱柱 离子交换液相色谱是生物分离最常见最有用的一种色谱模式。另一方面，小分子分离分析极少使用高效离子交换液相色谱。这是因为:(1) 新颖的反相和多功能键合相例如InnovationTM Polar-Embedded Stable Amide和TX连续出现, 在很大的程度上补偿了常规C18键合相的缺点。 C18, C8键合相也有重大进展。高效亲水液相色谱柱也覆盖了许多分析应用。(2) 相比之下, 硅胶基质的高效离子交换键合相近几十年来产品质量没有取得质的突破。硅胶基质的高效离子交换键合相柱寿命普遍短, 疏水相互作用明显。(3) 聚合物基质的高效离子交换键合相在生物分析上面的应用比较广泛, 但其柱效过低，表面积太小，对小分子分离分析难有吸引力。科学发明往往来自现实世界的挑战! 在对海洋毒素, 微生物代谢产物和天然植物(包括中草药)有效成分的分离纯化过程中, 我们深深感到高质量的硅胶基质的高效离子交换键合相是必不可少的! 因此，我们开发了硅胶基质的SCX, WCX, DEAE和SAX高效离子交换键合相。五、InnovationTM高效多功能液相色谱柱我们介绍四种高效多功能液相色谱柱:(1) InnovationTMTX毒品分析HPLC柱InnovationTM TX毒品分析HPLC柱是实际应用中最有价值的一种色谱柱。由于其在毒品分析上出色的表现, DEA专家称它毒品分析HPLC柱。InnovationTM TX是一个多功能色谱柱, 具有反相, 弱阳离子离子交换, 亲水等作用, 能够使用在100%水相或100%有机相。由于它的弱阳离子离子交换机理, InnovationTM TX对碱性化合物的分离效果是所有色谱柱中最好的。它对碱性化合物有完美的峰形。它的绝对柱效和反相色谱分析柱相同的，甚至优于反相, 远胜传统的亲水色谱分析柱。(2) InnovationTM DNPH HPLC柱InnovationTM DNPH HPLC柱主要用于环境中醛和酮DNPH衍生物分析。在特定的DNPH衍生物分析应用中, 任何其他色谱柱没有它优越的选择性。(3) InnovationTM PAH HPLC柱 (4) 血浆，血清直接进样的InnovationTM PEG色谱柱限制进入键合相(Restricted access media)最早由Merck公司发明。一个典型的方法是首先制造Diol键合相, 然后通过酰酯或酰胺反应嵌入疏水链。硅胶外表面的酰酯或酰胺链使用酶切断开。但酶不能扩散到内表面。由此外表面亲水, 内表面疏水。血浆，血清, 尿样可以直接进样。蛋白质等生物流体通过亲水外表面时没有保留, 小分子化合物可以扩散到内表面通过反相保留最后洗脱。限制进入键合相(Restricted access media)在学术领域比较欢迎, 但随着固相萃取产品的发展, 在工业领域的应用相当少。但我们最后发现, 血浆，血清, 尿样可以直接进样的限制进入键合(Restricted access media), 尤其是InnovationTM PEG色谱柱在药物代谢领域具有独特价值。药物代谢研究, 尤其是全盲条件下的早期药物代谢研究, 追求绝对回收率! 一种药物代谢之后, 打破成许多小分子化合物。全盲条件下不可能使用固相萃取回收全部小分子代谢产物。最理想的方法是, 血浆，血清, 尿样可以直接进样, 每毫升收集液使用14C同位素检测, 然后建立一个明确的代谢概况。InnovationTM PEG色谱柱是一种多功能色谱柱。它是最好的正相色谱柱! 同时，使用乙醇取代储存溶剂后, 它能够被用来作为反相让血浆，血清, 尿样可以直接进样。

一、使用前准备

1、使用前认真阅读色谱柱的说明书，了解色谱柱的种类，选用合适的色谱柱。

在选用色谱柱时，应充分考虑所分析样品的极性大小、化合物的种类数量、结构特征。根据化合物的性质，选择合适的色谱柱和分析条件。不同类型的色谱柱使用的流动相不同，使用错误的流动相会降低柱效，损伤柱子。如分析极性较大的多糖类成分，应当采用亲水性的反相填料。对于首次使用的色谱柱，还应按照厂家的出厂说明对色谱柱进行低流速的冲洗活化，活化后的色谱填料共价键键合力增强，柱效提高，寿命延长。

2、样品的准备与预处理

我们的经验是样品纯化得越干净，色谱柱的使用寿命越长。许多样品，尤其是生物样品，组份非常复杂，对色谱柱的损伤性较大，不经预处理的样品直接分析，会严重缩短色谱柱的使用寿命。因此，在样品的准备时需对样品进行预处理，包括准备溶剂的选择、样品过滤等。

2.1 制样溶剂的选择

制样溶剂通常需要考虑样品的溶解性、与流动相的相溶性、色谱填料的适用性等方面。这类溶剂需对样品有较大的溶解性，而且与流动相溶，洗脱强度最好低于流动相或梯度洗脱中的起始流动相，以免影响样品分离。目前许多手性色谱柱都禁止使用DMSO、四氢呋喃、氯仿等溶解样品，这些溶剂会破坏固定相的结构，从而缩短色谱柱的使用寿命。此外，制样溶剂还应与色谱系统其他部件如高压泵、进样器等相适用。

2.2 制样溶剂过滤

在进样前需过滤样品溶液，如采用0.22μm的微孔滤膜除去不溶性微粒，以免堵塞柱头滤片及柱内填充床。在条件允许的情况下，最好采用与色谱柱同种填料的固相萃取柱过滤进样溶液，可以减少在色谱柱上死吸附的物质或易堵塞的大分子样品。如生物样品中的小极性的油脂类易于沉淀死吸附在C18反相色谱柱中，导致柱效降低、柱压升高。采用SPE柱过滤后，可以有效减少在色谱柱中附着沉积的死吸附成分，保护色谱柱不被污染，保证其使用寿命。

2.3 其他，如溶液浓度、进样量等

分析物的某些性质同样能影响色谱柱的使用寿命。强酸、强碱性物质和蛋白质类生物大分子，它们能与固定相填料作用，或生成不可逆吸附层，改变填料表面特征，使色谱柱性能发生变化，最终导致分离失效。此外样品的进样量过大、超载都会影响色谱柱的分离性能和使用寿命。

二、使用过程中的维护

1、流动相的使用和分析方法的选择

流动相的纯度、溶剂的选择、适当分析方法的使用与色谱柱的性能和寿命密切相关。

1.1 流动相的选择

所选用的流动相应与色谱柱、待分析样品相兼容，即样品、样品溶液和流动相是互溶的。流动相能够溶解样品，避免样品沉淀析出；同时还要求流动相与样品不发生化学反应，并且要求与色谱柱不能发生溶解或化学反应。

色谱分析应选择色谱级的流动相。通常分析纯的溶剂含有微量杂质，如有机溶剂中的聚乙二醇、无机铁离子（Fe+）等，作为流动相大量使用后会引起色谱柱性能变化。最好是使用色谱纯级或者更高纯度的试剂，尽量降低溶剂中杂质带来的损伤。

1.2 流动相过滤

使用色谱纯试剂配制流动相，使用前需经0.45μm或者更小孔径的滤膜过滤和超声脱气处理，减少灰尘、微生物等杂质堵塞色谱柱，尤其是水溶性流动相易引起微生物生长而造成色谱柱阻塞。流动相最好是现配现用，放置时间最好不要超过2天。

1.3 流动相的pH和缓冲盐的选择

极端pH的流动相会破坏填料内的共价键，“溶解”硅胶，使固定相流失，从而降低柱效，缩短使用寿命。以硅胶作基质的固定相一般要求pH在2.5~7范围内使用。长期在pH>7或pH<2使用环境中，硅胶会逐渐溶解或者表面键合的官能团会逐渐流失。如果一定要用高或低pH的流动相，最好是选用相适应的色谱填料。

1.4 流速的控制

目前粒径为1.8μm的UPLC的流速常设为0.3~0.5mL/min，粒径为5μm的HPLC分析流速不大于1.5mL/min，粒径为10μm半制备柱流速控制在3mL/min。流速过大，压力升高，会引起色谱填料冲垮、塌陷。

2、色谱仪器的操作

每次开机使用分析仪器时，泵启动太快，流速和柱压的瞬间升高，柱床受到冲击，引起紊乱，产生空隙，影响色谱柱的使用寿命。因此，在操作实验开始时，应当将流速和柱压逐渐增加。

3、保护柱的使用

“保护柱”是与所使用液相色谱柱相同填料的短型色谱柱，可以有效地阻拦容易损坏色谱柱的大分子和不溶性颗粒，过滤易沉着色谱柱上产生死吸附的物质，从而延长色谱柱使用寿命。

4、柱温的控制

不同类型的色谱柱耐受的温度各有差别。通常色谱柱温维持在10～40℃之间，能够充分、最优的发挥色谱柱的性能。超出色谱柱温度范围，尤其高于柱温范围，会增加对流动相中化学物质的吸附，引起色谱柱固定相结构的改变；此外，还可能引起柱床塌陷，改变峰形，降低柱效，产生不可逆性的损伤。

三、使用后的清洗与保存

柱子使用一段时间后，总会有一些杂质累积在柱内，保留值较弱的物质，一般能快速从色谱柱冲洗出来，不产生干扰；中等保留强度的杂质能被缓慢冲洗出来，但对分析产生一定的干扰；强保留杂质通常聚集在柱头或色谱柱中，难以被洗脱，甚至可能与填料发生相互作用，形成新的伪固定相，改变色谱柱的分离性能。通常表现为柱压升高、基线不平、色谱双峰、分离性能降低等。这些被污染的色谱柱经清洗后，可恢复部分甚至大部分离能力。因此使用后认真、定期清洗，不仅能延长色谱柱的使用寿命，节省资源，还能大大降低分析的成本。以我们常用的硅胶基质色谱柱为例，简要阐述常用色谱柱的清洗与再生。

1，色谱柱的清洗与再生

色谱柱的使用前后都需经较强的流动相冲洗。通常情况下，在使用硅胶、氧化铝、极性键合相色谱柱时，每次用完后可先用二氯甲烷或正己烷等溶剂低流速长时间的冲洗；键合反相硅胶色谱柱、离子交换色谱柱和凝胶色谱柱可先用高比例的水（甲醇水混合溶剂）冲洗，再用100%甲醇冲洗。此外，色谱柱低流速的反相冲洗能够有效除去堵塞在柱头或筛板上的杂质，以及清洗聚集在柱头部位的较强吸附物质。有些色谱柱在许多方法处理污染失效后，反过来使用，不仅柱压降变小，柱效也可恢复如，延长了色谱柱的使用时间。

若上述常规清洗法无法清除污染物，则有必要采用更强的洗脱剂清洗，如反相材料的冲洗顺序为：100%甲醇→100%乙腈→乙腈∶异丙醇(75∶25，V/V)→100%异丙醇。或者可以采用较低浓度的稀酸或稀碱可将有机溶剂不能洗脱的污染物除去。例如采用0.05mol/L的硫酸和流动相溶液冲洗色谱柱，可取得良好效果；或者采用1%氢氧化铵或50%二甲基甲酰胺水溶液，对聚集在柱头的污染物具有良好的清洗效果。

如果分析时流动相中含有缓冲液（通常为盐溶液），冲洗时宜用水取代缓冲液与有机相混合冲洗色谱柱（20倍柱体积）；再用100%有机溶剂冲洗。若直接用100%有机溶剂冲洗，可造成缓冲液沉积析出，从而损坏柱子品质。同样的，若流动相中加入酸、碱溶液时，也应当按照上述方法，先采用高比例的水（水：甲醇10:90）冲洗20倍柱体积，防止强酸强碱溶液导致硅胶基质填料的溶解。

蛋白质对反相色谱柱的污染已成为常见问题，尤其在分离未经处理的动物组织等生物样品。一般情况下，纯有机溶剂如乙腈或甲醇不能很有效地清洗色谱柱，因而需要一些特殊的清洗方法。首先尝试用高比例强极性溶剂的流动相进行冲洗，如乙腈∶异丙醇（1:2,V/V）；或使用0.1%的三氟乙酸水溶液或者0.1%乙酸水溶液清洗。此外，还可以采用1%十二烷基硫酸钠 (SDS)，然后用5%～95%乙腈/水（含0.1%TFA）梯度冲洗，去除蛋白污染物效果也较好。

若采用上述的条件清洗后色谱柱仍不能达到理想的效果，有必要将固定相从色谱柱内取出，进行清洗再生后重新装填。具体操作是：将色谱固定相从色谱柱内打出后，用甲醇浮选，去除其中细小的破碎颗粒；然后用二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇超声清洗；最后干燥固定相，重新装填色谱柱。经该方法处理的色谱柱，性能可得到显著提高。

2、色谱柱的保存

色谱柱的保存应按照使用说明书中所指明的溶剂进行填充，尽可能的贮存于100%有机溶剂。色谱柱不能贮存在水或含水量高的溶剂中，会引起微生物的滋生，影响色谱柱寿命。如反相色谱柱长期不用，最好采用90%~95%的有机溶剂混合水溶液保存，防止色谱柱因密封不严造成色谱柱两头干涸、断层引起的寿命缩短。

此外，色谱柱还应当轻拿轻放，避免剧烈碰撞引起的色谱柱填料产生塌陷、断层，缩短使用寿命。答案来自

楼主的意思是看流动相和固定相的类型来区分正相还是反相么

正相反相取决于固定相的极性高于流动相是正相反之则反

流动相极性大于固定相，称之为反相

流动相极性小于固定相，称之为正相

看色谱柱的固定相填料是什么

正相色谱法 采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。

反相色谱法 一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

根据流动相 固定相之间的极性大小 来区分的 \(^o^)/~

流动相极性大于固定相，称之为反相

流动相极性小于固定相，称之为正相

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怎么选择色谱柱？首先确定我们需要检测什么样品。在根据样品选择使用的色谱柱，还有品牌型号，然后根据商家的推荐结合自己的样品来挑选。下面为大家介绍哈填充柱和毛细管柱

填充柱比毛细管柱具有更高的样品容量，虽然这一差距由于HP发明了大孔 530mm 毛细管而大大缩小。检测器灵敏度的改进也减少了对大剂量样品的需要。

填充柱可能具有优势的领域是气体样品的分析。

对于几乎所有的其他样品，毛细管柱具有高很多的效率（窄峰），这可以大大改进峰分离。实际上，分离能力很大，以至于许多分析物在很简单的分析中使用非常短的色谱柱就可以完成分离了。节省的时间可以直接转化为循环时间的缩短和样品通量的增加。

对于新的或更新的方法，如果没有非常具有说服力的理由使用填充柱的话，我们推荐使用毛细管柱。

1.色谱柱材料

这种材料必须尽可能是惰性的，尤其是对于痕量分析或容易拖尾的化合物，例如硫醇或类似的活性化合物。对于毛细管柱，熔融石英是可选的材料。

有两种类型的熔融石英毛细管柱：壁涂开管柱 (WCOT) 色谱柱和多孔层开管柱 (PLOT) 色谱柱。WCOT 色谱柱是固定相液膜涂渍在去活的色谱柱壁上。这是气相色谱中最常用的色谱柱。PLOT 色谱柱中固定相是固体物质涂渍到色谱柱壁上。

填充柱可以是玻璃或金属，通常是不锈钢的。金属虽然比较有活性，但其对非极性物质比较稳定。但是如果样品中有极性组分需要分析，请选择玻璃柱。如果玻璃柱还是活性强（引起峰拖尾、样品丢失等），请进行去活处理。

2.固定相

选择毛细管柱时，首先需要确定是否需要 PLOT 色谱柱。下面是 3 种 PLOT 色谱柱的典型应用领域：分子筛 不挥发气体，对水比较敏感二乙烯基苯 (DVB) — HP-PLOT Q C1 到 C3 全部异构体的分离，部分 C4 和更高的（直到 C14）的异构体分离，极性化合物，挥发性溶剂可以允许含水氧化铝 Al2O3 C1 到 C10 异构体的分离, 对水比较敏感.

如果上面提到的应用没有感兴趣的，则您可以选择一个 WCOT 类型色谱柱。

当面对一种未知样品时，首先尝试目前在GC上的色谱柱。如果不能获得满意的结果，请考虑所了解的样品信息。基本原理是分析物与具有相似化学性质的固定相间更容易相互作用。这意味着了解的样品信息越多，越容易找到最佳分离固定相。

3.最重要的步骤是确定分析物的极性特征：

§ 非极性分子 — 通常只包含碳氢原子没有偶极距。

§ 直链碳氢化合物（n-烷烃）是非极性化合物的例子。

§ 极性分子 — 主要包含碳氢，也包含氮、氧、磷、硫或卤原子。例如醇、胺、硫醇、酮、腈、有机卤化物等。

§ 可极化的分子 — 主要包含碳氢，也包含不饱和键。例如烯烃、炔烃和芳香族化合物。

成都摩尔科学仪器有限公司提供赛分科技针对特定分离需要提供正确的固定相：样品是具有相同化学类型的非极性物质的混合物吗？例如大多数石油馏分中的碳氢化合物？请尝试非极性色谱柱，如 HP-1，可以将它们按（近似）沸点顺序分离。如果怀疑有一些芳香族化合物，请尝试 HP-5 或 HP-35 等适用苯基化合物的色谱柱。极性或可极化化合物通常在含有苯基的更强极性和/或可极化基团的固定相上进行分离，其分离度会更好一些。例如 HP-210 或 HP-225 色谱柱。 如果需要更强的极性固定相，则可以选择聚乙二醇 (PEG) 固定相，通常称为 WAX 固定相。

请参见后面几页中的选择图表，这些图表根据应用和分析物的极性特征推荐固定相。

键合可以在固定相和色谱柱管间产生化学键。交联在适当位置聚合固定相以增加分子量。这两个过程是在制备键合/交联色谱柱过程中同时发生的，它可以增加热稳定性并减少色谱柱流失。可以冲洗键合/交联色谱柱以去除可能随时间积累的污染物并允许更大的进样量。如果可以选择，则我们建议在标准涂渍型色谱柱类型中选择键合/交联色谱柱。

4.膜厚

一般规律为薄液膜比厚液膜分离物质的速度快一些，并可以在相对较低温度下得到更高的分离度。这说明它适合于高沸点化合物、接近的化合物或热敏性化合物。“标准”膜厚为 0.25~0.5mm。这些厚度对在高达 300°C 温度下分离的大多数样品（包括石蜡、甘油三酸酯和类固醇）效果很好。对于需要在更高温度下分离的物质，可以使用薄液膜 (0.1mm) 色谱柱。

标准或薄液膜色谱柱用于分离高沸点物质，而厚液膜柱用于分离低沸点物质。1~1.5mm 的膜可以很好的分离沸点为 100~ 200°C 的物质。超厚液膜 (3~5mm) 用于气体、溶剂和吹扫物以提高它们和固定相的相互作用。

使用超厚液膜色谱柱的另一个原因是当更换大孔径色谱柱时，可以保持分离度和保留时间。由于这个原因，大孔径色谱柱都使用厚液膜。

厚液膜意味着色谱柱中有更多物质，因此会有更多的流失。随着膜厚度的增加，能达到的最高温度将降低。

5.柱长

一般而言，15m 色谱柱用于快速分离、简单混合物或大分子量化合物。对于大多数分析，30m 长的色谱柱是最常用的一种。很长的色谱柱（50、60 和 105m）用于非常复杂的样品。

柱长并不是色谱柱性能中一个很重要的参数。例如，柱长加倍，等温分析时间加倍，但峰分离度仅增加 40%。如果分析不是很理想，则有比柱长更有效的途径来改善它。可以选择薄一点的液膜、优化载气通过色谱柱的流速、使用温度程序等。

一种特殊情况是含有非常活性组分的样品分析。如果它们接触色谱柱材料，则它们拖尾会非常严重。相对短一些的色谱柱，使用厚膜可以减少接触的机会，这是由于接触色谱柱材料的时间相对少一些，并可以将分析物用固定相封闭与活化点的接触。

6.内径

增加内径意味着固定相增加，即使厚度不变，可以分析更大量的样品。它也意味着减小分离能力和更大的流失。

细柱用于复杂样品分离，但是通常要求分流进样，这是由于允许的样品量较小。如果可以允许减小分离度，则使用更粗的色谱柱可以避免这种情况。当样品量为主要因素时，比如气体、易挥发样品、吹扫和捕集或顶空进样，大内径或者甚至 PLOT 色谱柱更为合适。

同时也要考虑所使用仪器的限制和需要。一个适合的填充柱进样口可以使用大孔径毛细管柱，但不能用细柱。专门为毛细管柱设计的进样口通常适用于所有内径的色谱柱。GC/MS 和 MSD 直接联合可能要求细色谱柱，这是由于真空泵不能处理粗柱中的高流速。考察整个系统以查明哪些部分限制对色谱柱内径的选择。