硫酸铵沉淀法的原理及步骤

主要的影响因素有：

蛋白质的浓度，蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。

离子强度，也就是盐浓度，例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同。

pH值，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。

温度，25度和4度时，盐析的程度并不一样。

盐析剂中的金属阳离子的电荷数越大，盐析作用越强。在阳离子的电荷数相同的情况下，盐析作用与阳离子的半径成反比，这是因为价态高半径小的阳离子的水化能力较强，所以使自由水分子减少的作用较大。

由于饱和硫酸铵是强电解质，解离作用强，饱和硫酸铵的解离可抑制蛋白质弱电解质的解离，使蛋白质带电荷减少，更容易聚集析出。

扩展资料：

中性盐在蛋白质溶液中，一方面与蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质胶体颗粒表面的水膜；另一方面又大量中和蛋白质颗粒上的电荷，从而使水中蛋白质颗粒积聚而沉淀析出。常用的中性盐有硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，但以硫酸铵为最多。

得到的蛋白质一般不失活，一定条件下又可重新溶解，故这种沉淀蛋白质的方法在分离、浓缩，贮存、纯化蛋白质的工作中应用极广。

总硫酸铵沉淀法纯化蛋白质采用的是盐析法。当硫酸铵溶液达到饱和时，蛋白质大量析出。采用硫酸铵，因为不含有水，可以很快达到饱和度，从而使蛋白质析出。而采用硫酸铵溶液，会带入大量的水，即使能够使蛋白质析出，因为硫酸铵溶液带入的大量的水，也会导致溶液大量稀释，使析出效率大大降低。因此，必需使用无水的固体氯化铵作为析出剂。

一种优良的氮肥（俗称肥田粉），适用于一般土壤和作物，能使枝叶生长旺盛，提高果实品质和产量，增强作物对灾害的抵抗能力，可作基肥、追肥和种肥。能与食盐进行复分解反应制造氯化铵，与硫酸铝作用生成铵明矾，与硼酸等一起制造耐火材料。加入电镀液中能增加导电性。也是食品酱色的催化剂，鲜酵母生产中培养酵母菌的氮源，酸性染料染色助染剂，皮革脱灰剂。此外，还用于啤酒酿造，化学试剂和蓄电池生产等。还有一重要作用就是开采稀土,开采以硫酸铵作原料，采用离子交换形式把矿土中的稀土元素交换出来，再收集浸出液除杂、沉淀、压榨、灼烧后即成稀土原矿，每开采生产1吨稀土原矿约需5吨硫酸铵。

生物学上的用途也很多，多用于蛋白纯化工艺方面，因为硫酸铵属于惰性物质，不易与其他生物活性物质发生反应，在纯化过程中能最大程度的保护蛋白活性，另外，硫酸铵的可溶性极好，能形成高盐环境，对于蛋白沉淀与后续的高盐纯化做准备。硫酸铵在零度与常温25度的溶解度有较大区别，以下是硫酸铵在两个温度下不同饱和度的摩尔浓度。

蛋白质分离主要根据五种原理：

分子大小、溶解度、电荷、吸附性质、对配体分子的生物学亲和力等。

一、根据分子大小不同的纯化方法

1.透析和超过滤：

透析是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质分开。常用的半透膜是玻璃纸或称赛璐玢纸、火棉纸和其它改型纤维素材料。

2.密度梯度离心；

3.凝胶过滤；

二、利用溶解度差别的纯化方法

1.等电点沉淀和pH控制；

2.蛋白质的盐溶和盐析；

3.有机溶剂分级分离法；

4.温度对蛋白质溶解度的影响；

三、根据电荷不同的纯化方法

1.电泳；

2.聚丙烯酰胺凝胶电泳；

3.毛细管电泳；

4.等电聚焦；

5.层析聚焦；

6.离子交换层析；

四、利用选择性吸附的纯化方法

1.羟磷灰石层析；

2.疏水作用层析；

五、利用对配体的特异性生物学亲和力的分离纯化

六、高效液相层析和快速蛋白质液相层析

在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出,这种方法称为盐析.常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等.各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同,故可用于对混和蛋白质组分的分离.例如用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白,饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来,盐析沉淀的蛋白质,经透析除盐,仍保证蛋白质的活性.调节蛋白质溶液的pH至等电点后,再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好.盐析法分为两类,第一类叫Ks分段盐析法,在一定PH和温度下通过改变离子强度实现,用于早期的粗提液；第二种叫b分段盐析法,在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现,用于后期进一步分离纯化和结晶.影响盐析的因素包括：蛋白质浓度、离子强度和类型、PH值、温度等.针对温度这一条,需要强调：在低离子强度或纯水中,蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加.但在高浓度下,蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降.在一般情况下,蛋白质对盐析温度无特殊要求,可在室温下进行,只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行.

使用硫酸铵沉淀蛋白需要注意：硫酸铵中常含有少量的重金属离子,对蛋白质巯基有敏感作用,使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓溶液,通入H2S饱和,放置过夜,用滤纸除去重金属离子,浓缩结晶,100℃烘干后使用.另外,高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性(PH=5.0左右),使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH.

2.有机溶剂沉淀法——多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化；

有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数,导致具有表面水层的生物大分子脱水,相互聚集,最后析出.该法优点在于：1)分辨能力比盐析法高,即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2)沉淀不用脱盐,过滤较为容易；3)在生化制备中应用比盐析法广泛.但是,在常温下,有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性.例如酒精消毒灭菌就是如此.因此,操作要求在低温下进行.有机溶剂的选择首先是能和水混溶,使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮,还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等.

3.等电点沉淀法——此法单独应用较少,多与其它方法结合使用；

两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低,不同的两性电解质具有不同的等电点,以此为基础可进行分离.如工业上生产胰岛素时,在粗提液中先调PH8.0去除碱性蛋白质,再调PH3.0去除酸性蛋白质.利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性,不然盲目使用十分危险.不少蛋白质与金属离子结合后,等电点会发生偏移,故溶液中含有金属离子时,必须注意调整PH值.等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联合使用,以提高其沉淀能力.

很全面实用的答案,