trizol法提取rna原理是什么？
Trizol作用原理：
在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。
水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。
扩展资料
RNA和DNA一样，也是由各种核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接构成的多核苷酸链，但与DNA有一系列差异。
1、在化学组成方面，RNA含核糖而不含脱氧核糖。含尿嘧啶而不含胸腺密啶。例外的是，每个tNA分子含有一个胸腺嘧啶，这是在RNA链合成后由尿嘧啶甲基化生的，此外，前面已提到，少数DNA含有少量核糖，但这些个别的例外并不能以此否定两类核酸组成上的差异。
2、RNA一级结构的概念虽与DNA相同.但其基本结构单位是核糖核苷酸而不是脱氧核糖核苷酸。此外，部分RNA5′端或3′端有特殊的核苷酸序列，而且RNA一级结构中没有DNA那样复杂的顺序组织。
3、绝大多数RNA为单链分子，单链可自身折迭形成发夹（hairpin）样结构而有局部双螺旋结构的特征，这是各种RAN空间结构的共同特征。RNA局部双螺旋结构中碱基互补配对规律是A对U和G对C。由于RNA分子内部不能全面形成碱基配对，故其碱基克分子比A不等于U，G不等于C，不存在DNA碱基比例的 Chargaff规律。
在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1. 提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；
2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；
3. 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；
4. 取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；
5. 弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；
6. 让沉淀的RNA在室温下自然干燥；
用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
Trizol可以破坏细胞使RNA释放出来的同时，同时使RNA酶变性失活，保护RNA的完整性。Trizol的主要成分为异硫氰酸胍、酚和B-巯基乙醇，异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
提取中加入氯仿，主要用处是用来分相，加速有机相和水相的分层，上层为水相，PH 5.1左右，只有RNA分子留在水相，DNA分子沉淀在酚与溶液的界面。加入异丙醇，主要沉淀大分子rRNA和mRNA。最后加入乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白，去除杂质。
判断RNA 的质量主要有两个标准，一是完整性（是否被降解），二是纯度。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明，未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现28S、18S和5S rRNA对应的条带，如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带。
完整性的图片大致如下图所示：
RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260／A280值来判断。蛋白中trp、tyr、phe的吸光度为280nm，所以 280nm常用来表示蛋白质吸光度；而260nm为DNA的吸光度。
理论上， 纯的RNA情况下：OD260/OD280的值为2，纯的DNA情况下：OD260/OD280的值为1.8.
OD260反映的是溶液中核酸的浓度，OD280反映的是溶液中蛋白质或者氨基酸的浓度。
样品中如果含有蛋白质及苯酚，A 260 /A 280 比值会明显下降。对于纯的样品只要读出260 nm 的A值即可以算出含量。通常以A值为1相当于50微克/ml 双螺旋DNA，或者40微克/ml 单链DNA（RNA），或者20微克/ml 寡核苷酸计算。
OD260/OD280=1.9~2.0 RNA居多，纯度已经很高了。
纯DNA：OD 260 /OD 280 ≈1.8(>1.9，表明有RNA污染；<1.6，表明有蛋白质、酚等污染）
纯RNA：1.9 <OD 260 /OD 280 <2.0（2.0时表明可能有异硫氰酸残存）
提取前需要准备：
75%的乙醇（提前于-20冰箱保存）、氯仿、RNAase-free water、1.5ml Eppendorf离心管、Tips（RNAase-free）。
需要特别注意的是 一定要带好手套和口罩，做好个人防护工作！！！并且也可以防止RNA降解
步骤：
（1） 培养细胞： 收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。
（2） 组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入0.8~1ml Trizol充分匀浆，室温静置5min。
（3）按200ul氯仿/ ml Trizol的量加入氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。注：剧烈震荡使基因组DNA断裂。
（4）4℃离心，12000rpm，15min。注：离心后分为三层，下层为红色的苯酚—氯仿层，中间层和上层的水样层，RNA存在于水样层中。若只提RNA，千万不要吸取中间层和下层酚—酚相，可保存于4℃冰箱。
（5）将上层水相转移至另一个EP管中，加入等体积的异丙醇并混匀(约500ul)，室温放置10min或者-20冰箱沉淀2h，也可以-20冰箱沉淀过夜。
（6）4℃离心，12000 rpm，10min，用枪头小心吸走液体，RNA沉于管底。
（7）用0.5ml 75%冰乙醇洗涤RNA沉淀，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
（8）4℃离心，8,000rpm，5min。重复两次。弃去乙醇后，室温干燥RNA沉淀5-10min。
（9）可用50ul H2O溶解RNA样品，55-60℃ 溶解5-10min，保存于-80℃。
所得RNA可以继续用于下游实验。
RNA提取时，就变性剂的选择来说，CTAB（CTAB法）比异硫氰酸胍（RIZOL试剂法）和 SDS（改良热硼酸法）更有效；就CTAB法来说，由于以CTAB为变性剂，同时加入PVP和β一巯基乙醇共同作用变性蛋白、抑制RNase的活性，使用无水乙醇或异丙醇沉淀杂蛋白和总核酸等，然后再选择性地分离出RNA。所以CTAB法是一种很好得总RNA得提取方法。
所以现在有了next generation 的rna seq。原理是一样的不过就是直接测RNA了。
third generation里边就开始测single molecule了，像前两天ibm说的那样哈哈。。。。。
2.加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。
3.RNA存在于水相中。
4.水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。
5.移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。
6.Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。
7.目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。
8.RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。
9.在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA（转运RNA），rRNA（核糖体RNA），mRNA（信使RNA）。
10.mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录。
11.tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者。
12.rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。
Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA（转运RNA），rRNA（核糖体RNA），mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。
