化学方法测定氨含量的方法

酸碱滴定法是目前测定胺类固化剂胺值的通用方法。胺类固化剂(伯胺、仲胺、叔胺)都是电子给予体，是碱性化合物，在两性或酸性溶剂中呈碱性反应。因此可利用其碱性，用酸标准溶液进行滴定来测定其含量，通常采用以下2种方法。

二、总胺值的测定方法(酸碱滴定法)

1、盐酸-乙醇(或异丙醇等)滴定法

此方法适用于碱性较大的脂肪胺，其原理为：

RNH2+HCl→RNH3+Cl-

R2NH+HCl→R2NH2+Cl-

R3N+HCl→R3NH+Cl-

2、高氯酸-乙酸滴定法

对于芳香胺、改性胺等碱性较弱的胺，在醇溶液中滴定时，终点变色不敏锐，滴定误差较大。采用高氯酸-乙酸滴定法则可获得更精确的结果，其原理为：

RNH2+HClO4→RNH3+ClO4-

R2NH+HClO4→R2NH2+ClO4-

R3N+HClO4→R3NH+ClO4-

从上述酸碱滴定原理可知，所测出的是胺类同化剂中所含伯胺、仲胺和叔胺的总胺值。它没有反应出所含的伯氨基、仲氨基和叔氨基的相对含量，因此无法依据此胺值求出胺中的活泼氢当量。显然，若能分别测出混胺中的伯氨基、仲氨基和叔氨基的含量，就能求出混胺的活泼氢当量及其理论用量。此外还可根据伯胺值的变化来控制改性反应的终点，而能保证改性胺质量的稳定性。

用于定量测定伯胺的方法中，主要是基于伯氨基与羰基的反应或胺与亚硝酸的反应。它主要包括伯氨基与羰基的反应或胺与亚硝酸的反应。

三、伯氨基含量的测定方法

用于定量测定伯胺的方法中，主要是基于伯氨基与羰基的反应或胺与亚硝酸的反应。

1、与羰基反应的测定方法

伯胺与醛或酮反应生成西弗碱和水，而仲胺和叔胺不发生此反应。测定生成的水量或所消耗的醛或酮的量，即可求出伯氨基的含量。

RNH2+R'CHO→RN=CHR’+H2O

伯胺醛西弗碱(醛缩胺)水

再用甲醇钠的吡啶标准溶液滴定过量的水杨醛，求出伯氨基耗用的水杨醛量，进而算出伯氨基的含量。也可将试样溶解于乙酸和二唔烷混和溶剂后，用2-乙基己醛的二恶烷标准溶液直接滴定。

2、亚硝酸法(范斯莱克法)

伯胺(主要是脂肪胺)与亚硝酸反应释出氮，而仲胺和叔胺与亚硝酸反应不释出氮。测定生成的N的体积，即可求出伯氨基含量。

RHN2+HNO2→ROH+H2O+N2↑

R2NH+HNO2→R2N-N=O+H2O

R3N+HNO2→R3N·HNO2

四、叔氨基的测定方法

在有伯胺、仲胺存在下测定叔胺含量时，可先使伯胺及仲胺与乙酸酐反应，生成乙酰化产物，以排除伯胺及仲胺的影响。

胺类环氧固化剂胺值测定（三）

乙酰化产物不显碱性，不能被酸中和。而叔胺不能产生乙酰化反应，但它可以与乙酸反应：

R3N+CH3COOH→R3NH+CH3COO-

该产物可用高氯酸-乙酸标准溶液滴定，过量的乙酸酐无干扰，有时可使终点更为敏锐。

R3NH+CH3COO-+HClO4→R3NH+ClO4-+CH3COOH

伯胺与醛反应生成的西弗碱不与CS2反应，叔胺也不与CS2反应。因此可先使混胺与醛反应后，再用CS2与之(仲胺)反应生成氨荒酸，然后用碱(如0.5mol/L的NaOH)标准溶液滴定，此时伯胺不起干扰。由测定仲胺所牛成的氨荒酸含量，即可算出仲氨基的含量。

五、仲氨基的测定方法

1、2-乙基己醛-二硫化碳法

伯胺及仲胺与CS2反应牛成氨荒酸

2、从酸碱滴定法测出的总胺值中减去伯氨基和叔氨基含量，也可得到仲氨基含量。

3、先测出仲氨基和叔氨基的合量，再减去叔氨基含量即得仲氨基含量。仲氨基和叔氨基合量的测定，可先使醛与混胺中的伯氨基反应，然后再用盐酸或高氯酸标准溶液滴定，即可测出仲氨基和叔氨基的合量。

4、先测出伯氨基和仲氨基的合量，再减去伯氨基含量，即可得到仲氨基的含量。伯氨基和仲氨基合量可用乙酸酐-吡啶乙酰化法测得，其中叔胺不起反应。

胺类环氧固化剂胺值测定（四）

测定水解后释放出的乙酸量，或水解所需的水量，即可算出伯氨基和仲氨基的合量。

活泼氢当量及混胺固化剂用量(理论值)的计算，是环氧固化剂胺值测定的重要内容。

六、活泼氢当量及混胺固化剂用量(理论值)的计算

1、定义及换算关系

1)混胺的胺值

混胺的总胺值-1g混胺中所含伯氨基、仲氨基和叔氨基的物质的量的总和，单位为mol/g。相当于中和1g混胺所需标准酸的物质的量，单位为mol/g。了方便计算，不推荐采用通常用的胺值单位(KOH)mg/g)。

混胺的伯胺值Va(-NH2)-1g混胺中所含伯氨基的物质的量，单位为mol/g。

胺类环氧固化剂胺值测定

混胺固化剂用量的计算按等物质的量的原则计算，主要包括1g混胺中伯氨基耗用环氧树脂的量、00g环氧树脂需用混胺量。

2、混胺固化剂用量的计算

按等物质的量的原则计算

1g混胺中伯氨基耗用环氧树脂的量

100g环氧树脂需用混胺量为

七、结论

1、建议采用伯胺值、仲胺值和叔胺值来表征混胺的氨基含量。

(1)可依此计算出混胺固化剂的理论片用量，为配比设计提供理论依据。

(2)可依此准确地控制混胺合成的终点，保证混胺生产质量的稳定。

2、推荐用下列方法测定伯胺值、仲胺值和叔胺值，但需进一步研究。

(1)用乙酸酐-高氯酸法测定叔胺值。

(2)用水杨醛-高氯酸法测定仲胺和叔胺的合量，减去叔胺值，即町求出仲胺值。

(3)用水杨醛-甲醇钠法测定伯胺值。

A 总胺值的滴定

    实验原理：

    胺类固化剂(伯胺、仲胺、叔胺)都是电子给予体，是碱性化合物，在两性或酸性溶剂中呈碱性反应。因此可利用其碱性，用酸标准溶液进行滴定来测定其含量。

    实验方法有以下两种:

    1.高氯酸-乙酸滴定法

    对于芳香胺、改性胺等碱性较弱的胺，在醇溶液中滴定时，终点变色不敏锐，滴定误差较大。采用高氯酸-乙酸滴定法则可获得更精确的结果（相关文献中实验结论说明此情况下盐酸-乙醇法滴定结果是偏低的），其原理为： 

RNH2+HClO4→RNH3+ClO4-

R2NH+HClO4→R2NH2+ClO4-

R3N+HClO4→R3NH+ClO4-

    2.盐酸-乙醇(或异丙醇等)滴定法

    此方法适用于碱性较大的脂肪胺，其原理为：

RNH2+HCl→RNH3+Cl-

R2NH+HCl→R2NH2+Cl-

R3N+HCl→R3NH+Cl-

一、高氯酸-乙酸滴定法

    1.仪器和试剂

    烘箱、分析天平(万分之一)、量筒(100 mL、10 mL)、锥形瓶(250 mL)、酸式滴定管、干燥器。

    70%高氯酸(分析纯)、冰乙酸(分析纯)、纯苯(分析纯)、醋酸酐(分析纯)、邻苯二甲酸氢钾(基准物)，甲基紫(指示剂)。

    2.配制溶液及指示剂

    指示剂：0.1%甲基紫冰乙酸溶液（变色蓝变紫，范围2-3）。

    溶  剂：体积比冰乙酸:纯苯=2:l。

    3.标准溶液的配制

    量取 70%高氯酸溶液 4.3 mL，溶于 500 mL冰乙酸中，然后再取醋酸酐 7.5 mL，分数次加入，摇动至混合均匀，放置过夜，使与高氯酸中含的水分反应，转变为醋酸，即为[c(HCl04)=0.1 mol/L(0.1N)]高氯酸标准溶液。

    4.标定3中的高氯酸标准液

    称取 0.2～0.3g 邻苯二甲酸氢钾（必须保证干燥恒重），准确至 0.0001g，置于干燥的锥形瓶中，加入 50 mL 冰乙酸，温热溶解，加入 3～4 滴甲基紫指示剂，用配制好的高氯酸标准溶液[c(HCl04)=0.1mol/L]滴定至溶液由紫色变为纯蓝色，即为终点。

    5.计算

    c(HCl04)=m/(V×0.2042)式中：

    c(HCl04)——高氯酸标准溶液的浓度，mol/L；

    m——邻苯二甲酸氢钾的质量，g；

    V——消耗的高氯酸标准溶液体积，mL；

    0.2042——与 1.00 mL 高氯酸标准溶液[c(HCl04)=0.1 mol/L]相当的以克表示的邻苯二甲酸氢钾的质量。

    注：本溶液使用前标定。标定高氯酸标准溶液时的温度应与使用该标准溶液滴定时的温度相同。

    6.测定方法

    精确称取适量的样品，置于 250 mL 锥形瓶中，加入约 25 mL 冰乙酸一纯苯溶剂，摇动至完全溶解后(如样品不容易溶解时， 可稍微加热然后让它冷却到室温)，加入甲基紫指示剂 3～4 滴， 用[c(HCl04)=0.1mol/L]高氯酸标准溶液滴定至溶液由紫色转变成纯蓝色，即为终点。

    7.计算

    AN(mgKOH/g)=(cV×56.11)/m

    式中：C——高氯酸标准溶液的浓度，mol/L；

    V——消耗的高氯酸标准溶液体积，mL：

    m——样品的质量，g；

    56.11——每摩尔氢氧化钾的质量。

二、盐酸-乙醇滴定法

    1.实验仪器：锥形瓶、滴定管

    2.试剂及溶液

    ①盐酸（分析纯）

    ②0.5摩尔每升盐酸异丙醇标准液：以2L容量瓶为准，先加1000mL异丙醇，再加85mL浓盐酸摇匀后用异丙醇溶液稀释至刻度。（用无水碳酸钠在溴甲酚绿钠盐为指示剂的情况下标定，原理同盐酸的标定）

    ③氢氧化钠（分析纯），0.5摩尔每升

    ④无水乙醇（基准试剂）

    ⑤溴甲酚绿钠盐指示剂：0.1g溴甲酚溶于100毫升水中，再加0.05摩尔每升的氢氧化钠溶液1毫升

    ⑥溴酚蓝：0.2g溴酚蓝溶于100毫升无水乙醇

    3.测定方法

    取适量样品于250mL锥形瓶中，加50mL无水乙醇在电炉上煮沸1min（除去游离氨的干扰），冷却至室温后，加入5滴溴酚蓝，用0.5摩尔每升盐酸异丙醇标准液滴定至黄色为终点。

    4.计算（同法一，C和V分别指盐酸异丙醇标准液的浓度及用量）

 

B 非直接滴定总胺的测定方法

    原理：利用氨基的乙酰化、氧化、与羰基反应生成西弗碱以及芳香胺的重氮化和亚硝化等方法来分别测定伯仲叔氨基相对含量的方法。

    测定方法：

    1.伯氨基含量的测定方法

    原理：主要是基于伯氨基与羰基的反应或胺与亚硝酸的反应。

    测定方法：①伯胺与醛或酮反应生成西弗碱和水，而仲胺和叔胺不发生此反应。测定生成的水量或所消耗的醛或酮的量，即可求出伯氨基的含量。

RNH2+R'CHO→RN=CHR'+H2O

    ②伯胺(主要是脂肪胺)与亚硝酸反应释出氮，而仲胺和叔胺与亚硝酸反应不释出氮。测定生成的N的体积，即可求出伯氨基含量。

RHN2+HNO2→ROH+H2O+N2↑

R2NH+HNO2→R2N-N=O+H2O

R3N+HNO2→R3N•HNO2

    2.叔氨基含量的测定方法

    在有伯胺、仲胺存在下，测定叔胺含量时，可先使伯胺及仲胺与乙酸酐反应，生成乙酰化产物，以排除伯胺及仲胺的影响。

    乙酰化产物不显碱性，不能被酸中和。而叔胺不能产生乙酰化反应，但它可以与乙酸反应：

R3N+CH3COOH→R3NH+CH3COO-

    该产物可用高氯酸-乙酸标准溶液滴定，过量的乙酸酐无干扰，有时可使终点更为敏锐。

R3NH+CH3COO-+HClO4→R3NH+ClO4-+CH3COOH

    3.仲氨基含量的测定方法

    原理：伯胺及仲胺与CS2反应牛成氨荒酸

一般来说人体必须的17种氨基酸，也较为重视

氨基酸的定性测定

一、氨基酸的一般显色反应

本节介绍三种显色反应：茚三酮法、吲哚醌法和邻苯二甲醛法。前二种是经典的常用显

色法，后一种是近年来发展起来的荧光显色法，具有灵敏度高的特点。

1. 茚三酮法

显色方法有下列数种：

①常用法：将点有样品的层析或电泳完毕的滤纸充分除尽溶剂，用 5g/L 茚三酮无水丙

酮溶液喷雾，充分吹干，置65℃烘箱中约30min（温度不宜过高，避免空气中氨，以免背

景泛红色），氨基酸斑点呈紫红色。

为了使各种氨基酸呈现不同颜色，可用下列方法：

②用 0.4g 茚三酮，10g 酚和90g 正丁醇的混合液显色。

③用 1g/L 茚三酮无水丙酮溶液显色完毕后，再用盐酸蒸汽熏1min。

④用 1g 茚三酮，600mL 无水乙醇，200mL 冰醋酸及80mL2,4,6-三甲基吡啶混合液80

℃染色5～10min。

为了使显色稳定，可用下列方法：

⑤配制含醋酸镉 2g 加蒸馏水200mL 及冰醋酸40mL 的贮存液。将上述贮存液加200mL

丙酮及2g 茚三酮，即为显色液。点有样品的滤纸上浸有此显色液后，放置于盛有一小杯浓

硫酸的密闭玻璃容器中，25℃，18h，或较高温度下适当缩短时间。背景色浅，氨基酸斑点

也比较稳定。

⑥用含 2g/LCoCl2(或CuSO4)的4g/L 茚三酮异丙酮溶液显色时，氨基酸斑点呈红色，也

可在茚三酮显色后喷以含钴、镉或铜等无机离子的异丙醇溶液，斑点自蓝紫色变成红色。

2．吲哚醌法

（1）原理

各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同颜色，因此可借此辩认氨基酸。氨对吲哚醌显色没

有妨碍，但其灵敏度较茚三酮法稍差，显色不稳定，颜色只有在绝对干燥的环境中才能保存。

（2）试剂

①显色剂：1g 吲哚醌溶于100mL 乙醇及10mL 冰醋酸中（若冰醋酸用量减少则灵敏度

稍差）。

②底色褪色剂：在 100mL 200g/L 碳酸钠溶液中加入60g 硅酸钠（Na2SiO3•9H2O）在水

浴（60～70℃）中加热搅拌直至完全溶解，待溶液比较清澈为止。在溶解过程中，有时硅酸

钠会结成凝胶，此时只需继续搅拌即可溶解。配制时若硅酸钠用量多则褪色较快，但背景容

易变黄，硅酸钠用得少（40g），虽裉色较慢，但背景较为洁白。

显色步骤

层析或电泳后滤纸烘干后，仔细喷上或涂上显色剂，用电吹风迅速吹干，待醋酸气味不

太刺鼻时移置100℃烘箱烘5～15min，直至显色为止（温度不要太高，以免引起减色）注

意观察所显出的颜色，然后均匀地涂上底色褪色剂，纸的背景即由黄色变为绛红而后逐渐变

浅，待黄色背景几乎褪尽时，迅速用电吹风吹干，并随时观察颜色的变化。例如苏氨酸在褪

色前为浅红带褐色，褪色后则呈橙黄色或黄色：脯氨酸在褪色前为蓝色，吹干时很快褪成无

色。室温较低时，底色褪色很慢，此时可将褪色剂加温到30～40℃。温度过高也不宜，因

氨基酸斑点的褪色速度也同时加快，应该避免。

其他显色步骤：显色剂为 1g 吲哚醌，1.3g 醋酸锌溶解于70～80mL 热异丙醇中，冷却

后加1mL 吡啶。或者1g 吲哚醌，1.5g 醋酸锌溶解于95mL 热异丙醇中，加3mL 水，冷却

后加1mL 冰醋酸。点有样品的滤纸仔细喷以显色剂后，80～85℃放置10min，背景可用水

迅速浸洗去而不使氨基酸斑点退去

由于吲哚醌试剂配制方法不同，对同一种氨基酸所显颜色往往也有差异。

3．邻苯二甲醛法

邻苯二甲醛法是目前纸上层析、硅胶薄层层析荧光显色氨基酸最灵敏的方法之一，也可

用于氨基酸溶液定量，并推广应用于乙内酰苯硫脲氨基酸、多肽和蛋白质的检出和定量。根

据文献报道，氨基酸纸上层析灵敏度达0.5μmoL，在硅胶薄层层析上为0.05～0.2μmoL。

这里介绍在纸上层析显现氨基酸方法。（荧光胺是另一种常用的荧光试剂，由于荧光胺来源

比较困难，这里未作介绍）

（1）原理

邻苯二甲醛在 2-巯基乙醇存在下，在碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适

的激发光和发射光波长分别为340nm 和455nm。

各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小大致顺序如下：天门冬氨酸，

异亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸，缬氨酸，谷氨酸，苏氨酸，甘氨

酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸和半胱氨酸。

（2）试剂

邻苯二甲醛显色液：取0.1g 邻苯二甲醛，0.1mg 巯基乙醇，1mL 三乙胺，加丙酮+石油

醚（60℃～90℃）（1+1）的混合溶剂至100mL。放置0.5h 后使用。

显色步骤

将含有氨基酸样品的滤纸浸入邻苯二甲醛显色液中 1min，冷风吹干，在温度18℃以下，

湿度50%～90%之间显色0.5h，于紫外灯下观察荧光点。

说明

在滤纸上显现氨基酸时，邻苯二甲醛浓度以 0.1%为宜。显色时必须有一定的湿度，以

便氨基酸溶解，提高分子碰撞机率，并使极性基团解离，促进反应趋于完全。湿度太低，显

不出荧光。温度对显现的荧光延时有显著影响，温度高荧光延时短，温度低荧光延时长。

二、个别氨基酸的显色反应

利用个别氨基酸与某些试剂具有特殊的显色反应定性氨基酸。可应用于纸层析和纸电

泳显色，也可单独应用。方法很多，仅将常用的方法介绍如下：

1．精氨酸的显色——坂口（Sakaguchi）反应

(1)第一种方法

试剂：①5g 尿素溶解于100mL0.1g/Lα-萘酚乙醇中。使用前，每100mL 加约5g KOH。

②0.7mL 溴水溶解于100mL 5%NaOH 中。

显色步骤：在点有样品的滤纸上喷试剂①后，在空气中吹几分种，再喷试剂②。精氨

酸或含精氨酸的多肽显红色。此试剂对含精氨酸的蛋白质也适用。

(2)第二种方法：

试剂：①1g/L 8-羟基喹啉的丙酮溶液。②0.02mL 溴水溶解于100mL 0.5mol/LnaOH 溶

液中。

显色步骤：将点有样品的滤纸烘干后，喷上试剂①，吹干后，再喷试剂②。精氨酸或

其他胍类物质显桔红色。

2．胱氨酸和半胱氨酸的显色

试剂：①1.5g 亚硝基铁氰化钠（Na2Fe(CN)5NO2•5H2O）溶于5mL 2mol/L H2SO 4 溶液

中，加95mL 甲醇。此时会有沉淀产生，可保存一个月以上。使用时在每100mL 上述溶液

中加10mL 28%氨水，过滤除去沉淀，清液仅能保持一天左右。②2g 氰化钠溶于5mL 水中，

然后加95mL 甲醇。此时有沉淀产生，使用时只需摇匀即可。

显色步骤：半胱氨酸的显色：在滤纸上喷以试剂①的清液，5min 后半胱氨酸显红色。

胱氨酸的显色：先将滤纸浸入试剂②，迅速取出，稍等片刻再喷试剂甲的清液，5min 后胱

氨酸显红色。也可以把试剂②配制的浓度增加一倍，在显色前混和，再喷到滤纸上。

3．甘氨酸的显色

试剂；0.1g 邻苯二甲醛溶于100mL 77%乙醇中。

显色步骤：点有样品的滤纸喷上试剂，甘氨酸显墨绿色，在汞灯（365nm）下显巧克力

棕色。吲哚醌显色后，再用此试剂仍有效。以甘氨酸为N 端的小肽也能显色，但其N 端被

保护后，以及其他氨基酸均不显色。

4．脯氨酸的显色

试剂：1g 吲哚醌和1.5g 醋酸锌，1mL 醋酸，5mL 蒸馏水混和，再加入95mL 异丙醇。

新鲜配制。

显色步骤：层析滤纸除尽溶剂，喷上以上试剂，80℃～85℃烘箱内放置30min，脯氨酸

显蓝色，再以30℃温水漂洗除去多余的试剂后，背景为白色或浅黄色。

也可剪下脯氨酸斑点，在试管中加入5mL 水饱和酚，在黑暗中洗脱15min，间歇振摇，

于610nm 测定其吸光度。从已知标准曲线即可求得样品内脯氨酸含量，测定范围5～20μg。

5．丝氨酸和羟赖氨酸的显色

试剂：①0.035mol/L 过碘酸钠（748mgNaIO4 溶于数毫升甲醇中，加2 滴6mol/L 盐酸，

再用甲醇稀释至100mL）。②15g 醋酸铵加0.3mL 冰醋酸，加1mL 乙酰丙酮，用甲醇稀释到

100mL。

显色步骤：点有样品的滤纸吹干，先喷试剂①，近干后再喷试剂②，室温放置 2h，紫

外灯下照射0.5h，丝氨酸和羟赖氨酸呈黄色斑点，在紫外线下都有荧光。

6．羟脯氨酸的显色

试剂：①1g 吲哚醌溶于100mL 乙醇及10mL 冰醋酸。②1g 对二甲胺苯甲醛溶于100mL

的丙酮浓盐酸（9＋1）混合液中。（此试剂不稳定，隔数日后溶液颜色增深发黑，灵敏度降

低，故用时新鲜少量配制。

显色步骤：将待鉴定的溶液点于小方块纸上，干后先点上试剂①，热风吹干。这时纯

羟脯氨酸呈墨绿色，纯脯氨酸呈深蓝色（极灵敏），对其他氨基酸呈程度不同的紫红色（不

太灵敏）；然后再点上试剂②吹干，如溶液中含有羟脯氨酸即转变为玫瑰红色，而其他氨基

酸与吲哚醌所生成的颜色则褪去。

7．色氨酸的显色

(1)第一种方法

试剂：1g 对二甲氨基苯甲醛加90mL 丙酮，10mL 浓盐酸。新鲜配制。

显色步骤：点有样品的滤纸干燥后，喷上以上试剂，在室温下放置几分钟后，色氨酸

显蓝色或紫红色。茚三酮显色后，仍可使用本法。

(2)第二种方法：

试剂：10mL 35%甲醛加10mL25%盐酸，20mL 无水乙醇。

显色步骤：点有样品的滤纸喷上以上试剂后，100℃烘5min，色氨酸在长波长紫外光下

呈现荧光（黄-橙-带绿色）。

8．酪氨酸的显色

试剂：①0.1%α-亚硝基β-萘酚的95%乙醇溶液。②10%硝酸水溶液。

显色步骤：点有样品的滤纸喷上试剂①后，吹干，再喷试剂②，然后在100℃烘3min，

酪氨酸或含酪氨酸的多肽在浅灰绿色的背景上显红色，0.5h 后转变为桔红色，其后渐退去。

灵敏度1～2μg 酪氨酸。茚三酮显色后，再用此试剂处理，仍能显色，茚三酮所显出的紫红

色斑点变成红色。

9．酪氨酸和组氨酸的显色——pauly 反应

试剂：①4.5g 对氨基苯磺酸与45mL 12mol/L 盐酸共热溶解，以蒸馏水稀释至500mL。

用时取出30mL，在0℃与等体积的5%亚硝酸钠水溶液相混合。（室温放置太长会失效）

②10%碳酸钠水溶液。

显色步骤：点有样品的滤纸上喷试剂①，片刻后再喷试剂②。组氨酸及含组氨酸的多

肽显桔红色；酪氨酸及含酪氨酸的多肽显浅红色。

第六节 氨基酸定量测定

一、氨基酸的一般定量测定

（一）甲醛滴定法

1．原理

氨基酸具有酸性的-COOH 基和碱性的-NH2 基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内

盐。当加入甲醛溶液时，-NH2 基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用标准强碱

溶液来滴定-COOH 基，并用间接的方法测定氨基酸总量。反应式（有三种不同的推论）如

下：

2．方法特点及应用

此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用此

法测定发酵液中氨基氮含量的变化，来了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此

作为控制发酵生产的指标之一。脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪

氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反

应，往往使结果偏高。

3．操作方法

吸取含氨基酸约 20mg 的样品溶液于100mL 容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20.0mL

置于200mL 烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定至

酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液mL 数，供计算总酸含量。

加入10.0mL 甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消

耗氢氧化钠标准溶液毫升数。

同时取 80mL 蒸馏水置于另一200mL 洁净烧瓶中，先用氢氧化钠标准溶液调至pH8．2，

（此时不计碱消耗量），再加入10.0mL 中性甲醛溶液，用0.05mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定

至pH9.2，作为试剂空白试验。

4．结果计算

氨基酸态氮质量分数（%）=

式中：V1——样品稀释液在加入甲醛后滴定至终点（pH9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液

的体积，mL；

V2——空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，mL；

c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；

m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g；

0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmoL。

5．说明

①本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定。②浑浊和色深样液可不经处

理而直接测定。

(二)茚三酮比色法

1．原理

氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），

可用吸光光度法测定。

该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为 570nm，故据此

可以测定样品中氨基酸含量。

2．操作方法

(1)标准曲线绘制

准确吸取 200μg /mL 的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（相当于

0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加

水补充至容积为4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH 为8.04）各

1mL，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置15min

后，在570nm 波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克

数为横坐标，吸光度A 为纵坐标，绘制标准曲线。

(2)样品测定

吸取澄清的样品溶液 1～4mL，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A 值，

用测得的A 值在标准曲线上可查得对应的氨基酸微克数。

3．结果计算

氨基酸含量（mg/100g）=

式中：c——从标准曲线上查得的氨基酸的质量数，μg；

m——测定的样品溶液相当于样品的质量，g。

4．说明及注意事项

①通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎样品 5～10g 或吸取样液样品5～10mL，

置于烧杯中，加入50mL 蒸馏水和5g 左右活性炭，加热煮沸，过滤，用30～40mL 热水洗

涤活性炭，收集滤液于100mL 容量瓶中，加水至标线，摇匀备测。

②茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行

纯化，具体操作可参阅黄伟坤等编著《食品检验与分析》。

(三)非水溶液滴定法

1．原理

氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的标准溶液滴定其含量。根据酸

碱的质子学说：一切能给出质子的物质为酸，能接受质子的物质为碱；弱碱在酸性溶剂中碱

性显得更强，而弱酸在碱性溶剂中酸性显得更强，因此本来在水溶液中不能滴定的弱碱或弱

酸，如果选择适当的溶剂使其强度增加，则可以顺利地滴定。氨基酸有氨基和羧基，在水中

呈现中性，而在冰醋酸中就能接受质子显示出碱性，因此可以用高氯酸等强酸进行滴定。

本法适合于氨基酸成品的含量测定。允许测定的范围是几十毫克的氨基酸

2．测定

(1)直接法（适用于能溶解于冰醋酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样品50mg 左右，溶解

于20mL 冰醋酸中，加2 滴甲基紫指示剂，用0.100mol/L 高氯酸标准液滴定（用10mL 体积

的微量滴定管），终点为紫色刚消失，呈现蓝色。空白管为不含氨基酸的冰醋酸液，滴定至

同样终点颜色。

(2)回滴法（适用于不易溶解于冰醋酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样

品30～40mg 左右，溶解于5mL0.1mol/L 高氯酸标准溶液中，加2 滴甲基紫指示剂，剩余的

酸以醋酸钠溶液滴定，颜色变化由黄，经过绿、蓝至初次出现不褪的紫色为终点。

3．说明

(1)能溶解于冰醋酸的氨基酸，可以用直接法测定的有：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、组

氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸。不易溶解于冰

醋酸，但能溶解于高氯酸可以回滴法测定的有：赖氨酸、丝氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。

(2)谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以将样品溶解于2mL 甲酸中，再

加20mL 冰醋酸，直接用标准的高氯酸溶液滴定。

(四)邻苯二甲醛法(OPT 法)

1．原理

邻苯二甲醛在 2-巯基乙醇存在下，于碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适

的激发光和发射光波长分别为340 和455nm。可能产物为：

各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小大致顺序如下：天门冬氨酸，

异亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸，缬氨酸，谷氨酸，苏氨酸，甘氨

酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸，和半胱氨酸。

本法可用于测定游离氨基酸的含量。灵敏度较茚三酮法约高 100 倍以上，可测到0.1～

1×10－4mol 氨基酸。如用于血清中α-氨基氮的测定，每次血清用量只需5～10μL。与另一

种荧光试剂（萤光胺）一样，空白无荧光，只有与氨基酸结合才产生荧光。缺点是与脯氨酸

不产生荧光，邻苯二甲醛与半胱氨酸荧光值太低。荧光胺已有用于氨基酸自动分析定量分析，

但由于试剂昂贵及个别氨基酸反应不满意，目前还未普遍应用。

(五)三硝基苯磺酸法

三硝基苯磺酸（TNBS）是定量测定氨基酸的重要试剂之一。TNBS 在偏碱性的条件下

与氨基酸反应，先形成中间络合物，如下式所示：

中间络合物在光谱上有二个吸收值相近的高峰，分别位于355nm 和420nm 附近。然

而溶液一旦酸化，中间络合物转化成三硝基苯-氨基酸（TNP-氨基酸），420nm 处的吸收值

显著下降，而350nm 附近的吸收峰则移至340nm 处。

利用 TNBS 与氨基酸反应的这一特性，可在420nm 处（偏碱性溶液中）或在340nm

（偏酸性溶液中）对氨基酸进行定量测定。下表列出各种氨基酸与TNBS 反应后在不同条

件下测定的吸光度。在340nm 处，各氨基酸的吸收度大致相近，而在420nm 处的吸光度

因氨基酸种类而异；在加入适量SO3

2－时，吸收值升高。

本法允许的测定范围是 0.05～0.4μmol 氨基酸。

表 10-3 各种氨基酸与TNBS 反应后在不同条件下测定的吸光度

氨基酸种类 碱性溶液① 酸性溶液加 SO3

①取不同含量氨基酸液1mL，加4%NaHCO3 1mL，0.1%TNBS 1mL，于40℃反应2h，用水补充至4mL，

在420nm 处测定。制作氨基酸浓度—吸光度坐标图，从曲线中求得各氨基酸于1μmol 时的吸光度。

②条件同上，但在与TNBS 反应时加0.01mol/L Na2SO3 1mL，最后总体积也是4mL，同样在420nm 处

测定。

③条件同①，但与 TNBS 反应后加1mol/L HCl 1mL 酸化，在340nm 处测定。

(六)乙酰丙酮和甲醛荧光法

1．原理

氨基酸与乙酰丙酮和甲醛反应，生成 N-取代基2,6-二甲基-3,5-二乙酰基1,4-二氢吡啶，

产生黄-绿色荧光，可用荧光分析法检测。主要反应如下：

乙酰丙酮 甲醛 氨基酸 荧光物质

2．试剂

混合试剂：取1mol/L 乙酸钠溶液10mL，加入乙酰丙酮溶液0.4mL 和30%甲醛溶液1mL，

用水稀释至30mL。

3．测定

取氨基酸液 1mL，加入混合试剂1mL，用棉花塞满试管口，避光于100℃下加热10min，

冷却，加水2mL，然后测定荧光值。

表 10-4 各种氨基酸的发射波长和检测范围

化合物（激发波长405nm） 发射波长（nm） 检测范围（mg/L）

甘氨酸 485 2～10

苯丙氨酸 490 8～40

丝氨酸 485 5～25

半胱氨酸（盐酸盐） 500 20～100

谷氨酸 485 20～100

与标准相比较求出样品中的氨基酸含量。

二、个别氨基酸的定量测定

（一）赖氨酸的测定

1．原理

用铜离子阻碍游离氨基酸的α-氨基,使赖氨酸的ε-氨基可以自由地与1-氟-2,4 二硝基

苯(FDNB)反应,生成ε-DNP-赖氨酸。经酸化和用二乙基醚提取,在波长390nm 处有吸收峰,

从而求出样品中游离赖氨酸的含量.

2．试剂

(1)氯化铜液：称28.0g 无水氯化铜，用水稀释至1000mL。

(2)磷酸三钠溶液：称68.5g 无水磷酸钠,用水稀释至1000mL。

(3)硼酸盐缓冲液（pH9.1～9.2）：称54.64g 带有10 结晶水的四硼酸钠，用水稀释至

1000mL 。

(4)磷酸铜悬浮液：搅拌情况下，把氯化铜液200mL，缓慢倒入400 mL 的磷酸三钠溶液

中，把悬浮液以2000r/min 速度离心5min ，用硼酸盐缓冲液再悬浮沉淀物，洗涤离心3 次，

把最后的沉淀物悬浮在硼酸盐缓冲液中，并用缓冲液稀释至1L。

(5)1-氟-2，4 二硝基苯(FDNB)溶液：吸取FDNB10mL 用甲醇稀释至100mL。

(6)赖氨酸-HCl 标准溶液：称取一定量赖氨酸-HCl，用水配成200mg/L 的工作标准液。

(7)100g/L 丙氨酸溶液。

3．测定

(1)称取通过40 目筛的均匀试样1.00g，置于100mL 烧瓶中。另吸取赖氨酸-HCl 标准工

作液5mL（相当1mg 赖氨酸-HCl），连同试剂空白同时进行试验。

(2)向各烧瓶中加入25mL 磷酸铜悬浮液，然后再加10%丙氨酸1.0mL,振摇15min。吸

取10%FDNB 溶液0.5mL.置于各处理烧瓶中,将烧瓶置沸水中加热15min。

(3)取出烧瓶,立即加入1mol/LHCl 溶液25mL,并不断摇动使之酸化和分散均匀。

(4)烧瓶中的溶液冷却至室温,用水稀释至100mL.取约40mL 悬浮液进行离心。

(5)用25mL 二乙基醚提取上清液3 次，除去醚。并将溶液收集于有刻度试管中,于65℃

水浴中加热15min，以除去残留的醚。并记录溶液的毫升数。

(6)吸取上述各处理液10mL，分别与95%乙醇溶液10mL 混合，用滤纸过滤。

(7)用试剂空白液凋零，测定样液A390nm，与赖氨酸-HCl 标准液对照，求出样品中赖氨

酸-HCl 的含量。

本法在 0～40mg/L 赖氨酸溶液范围内呈良好线性关系。

4．说明

(1)添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸，增加总氨基酸的浓度，有助于赖氨酸-HCl 浓度

具有良好的线性关系。

(2)用醚提取酸性溶液，可将所有中性或酸性的DNP-氨基酸衍生物除去，并把FDWB

的产物破坏，否则这些产物在390nm 处存在干扰。

（二）色氨酸的测定

1.原理

样品中的蛋白质经碱水解后，游离的色氨酸与甲醛和含铁离子的三氯乙酸溶液作用，生

成哈尔满化合物（norharman），具有特征荧光值，可以进行定量测定。

2．试剂

(1)0.3mmol/L 三氯化铁-三氯乙酸溶液：称取三氯化铁(FeCl3•6H2O)41mg，加入10%三

氯乙酸溶液溶解并定溶至500mL。

(2)2%甲醛：量取甲醛溶液(36%～38%)5.5mL，加水至100mL。

(3)色氨酸标准溶液：称取10mg 色氨酸，用0.1mol/LNaOH 溶液溶解并定容至100mL,

置棕色瓶中备用,使用时用水稀释成1mg/L 的标准溶液.

3．测定

称取样品粉末 100～200mg 于离心管中，加入4mL 乙醚,摇匀后过夜，以3000r/min 速

度离心。将乙醚提取液移入试管内,并用乙醚洗涤残渣3 次，收集乙醚液于试管中，于40℃

水浴除去醚。残留物中加入6.25mol/L N aOH 4mL，火焰封口，于110℃水解16～24h。水

解液用4mol/L HCl 溶液调节至pH6～8 后,用水定容至50mL,过滤备用。

吸取滤液 0.2mL，加入2%甲醛0.2mL 和0.3mmol/L 三氯化铁-三氯乙酸混合液2mL，

摇匀后于100℃水浴中加热1h，取出，冷却后用水定容至10mL。在激发波长为365nm，发

射波长449nm 条件下，测定样品的荧光强度，与色氨酸标样作对照，求出样品中色氨酸含

量。

本法在 0～10mg/L 色氨酸溶液范围内呈良好线性关系。

氨基酸（amino acids）：含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物，氨基一般连在α-碳上。

氨基酸的结构通式：构成蛋白质的氨基酸都是一类含有羧基并在与羧基相连的碳原子下连有氨基的有机化合物，目前自然界中尚未发现蛋白质中有氨基和羧基不连在同一个碳原子上的氨基酸。

其理化特性大致有：

1）都是无色结晶。熔点约在230°C以上，大多没有确切的熔点，熔融时分解并放出CO2；都能溶于强酸和强碱溶液中，除胱氨酸、酪氨酸、二碘甲状腺素外，均溶于水；除脯氨酸和羟脯氨酸外，均难溶于乙醇和乙醚。

2）有碱性[二元氨基一元羧酸，例如赖氨酸（lysine）]；酸性[一元氨基二元羧酸，例如谷氨酸（Glutamic acid）]；中性[一元氨基一元羧酸，例如丙氨酸（Alanine）]三种类型。大多数氨基酸都呈显不同程度的酸性或碱性，呈显中性的较少。所以既能与酸结合成盐，也能与碱结合成盐。

3)由于有不对称的碳原子，呈旋光性。同时由于空间的排列位置不同，又有两种构型：D型和L型，组成蛋白质的氨基酸，都属L型。 由于以前氨基酸来源于蛋白质水解（现在大多为人工合成），而蛋白质水解所得的氨基酸均为α-氨基酸，所以在生化研究方面氨基酸通常指α-氨基酸。至于β、γ、δ……ω等的氨基酸在生化研究中用途较小，大都用于有机合成、石油化工、医疗等方面。氨基酸及其 衍生物品种很多，大多性质稳定，要避光、干燥贮存。

　1、茚三酮反应 （ninhydrin reaction）

ninhydrin reaction

在加热条件下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫色（与脯氨酸反应生成红色）化合物的反应。

茚三酮反应，即：所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质。

此反应十分灵敏，根据反应所生成的蓝紫色的深浅，在570nm波长下进行比色就可测定样品中氨基酸的含量，也可以在分离氨基酸时作为显色剂对氨基酸进行定性或定量分析。在法医学上，使用茚三酮反应可采集嫌疑犯在犯罪现场留下来的指纹。因为手汗中含有多种氨基酸，遇茚三酮后起显色反应。

2、坂口反应 （Sakaguchi reaction）

坂口反应Sakaguchi reaction

本法广泛用于精氨酸的分析与测定。精氨酸与α-萘酚在碱性次溴酸钠(或次溴酸钾)中发生反应，得到如左式的红色产物：当用茚三酮方法发现可能有精氨酸时，可用此法检测确证。单取代的胍基衍生物如章鱼肉碱、胍基乙酸等对此反应敏感，显示正反应。该反应可用于精氨酸的定性和定量测定。

3、米隆反应

HgNO3+HNO3+热 红色 （检验酚基 酪氨酸有此反应）

4、Folin-Ciocalteau反应

磷钨酸-磷钳酸 蓝色 （检验酚基 酪氨酸有此反应）

5、黄蛋白反应

浓硝酸煮沸 黄色 （检验苯环 酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸有此反应）

6、Hopkin-Cole反应（乙醛酸反应）

乙醛酸+浓硫酸 乙醛与浓硫酸接触面处产生紫红色环 （检验吲哚基 色氨酸有此反应）

7、Ehrlich反应

P-二甲氨基苯甲醛+浓盐酸 蓝色 （检验吲哚基 色氨酸有此反应）

8、硝普盐试验

Na2(NO)Fe(CN)2*2H2O+稀氨水 红色 （检验巯基 半胱氨酸有此反应）

9、Sulliwan反应

1，2萘醌、4磺酸钠+Na2SO3 红色 （检验巯基 半胱氨酸有此反应）

10、Folin反应

1，2萘醌、4磺酸钠在碱性溶液 深红色 （检验α－氨基酸）

据我了解 武汉武达生物科技用头发提取氨基酸技术生产的胱氨酸、亮氨酸、酪氨酸等系列产品，是世界公认的绿色生化制品，因此，可以说全球80%以上的氨基酸市场是属于我们的，这就给我们提供了一个极好的发展空间。

氨气，无机化合物，常温下为气体，无色有刺激性恶臭的气味，易溶于水，氨溶于水时，氨分子跟水分子通过*氢键结合成一水合氨(NH3·H2O)，一水合氨能小部分电离成铵离子和氢氧根离子，所以氨水显弱碱性，能使酚酞溶液变红色。氨与酸作用得可到铵盐，氨气主要用作致冷剂及制取铵盐和氮肥。

氨基改性硅油的氨值定义为中和1 g氨基硅油所需1 mol／L盐酸的毫升数．以乙醇为溶剂，溴酚蓝为指示剂，在磁力搅拌器不停搅拌的同时，用1 mol／L的盐酸滴定．氨值便等于滴定时所用1 mol／L的盐酸的毫升数．

5.20.1 原理：氨基酸为两性电解质。在接近中性的水溶液中，全部解离为双极离子。当甲醛溶液加入后，与中性的氨基酸中的非解离型氨基反应，生成单羟甲基和二羟甲基诱导体。此反应完全定量进行。此时放出氢离子可用标准碱液滴定。根据碱液的消耗量，计算出氨基态氮的含量。5.20.2 试剂：所用试剂均为分析纯，使用的水为蒸馏水或同等纯度的水。5.20.2.1 0.1MOL/L 氢氧化钠标准溶液：按GB601配制与标定。5.20.2.2 0.05MOL/L 氢氧化钠标准滴定溶液：用0.1MOL/L的氢氧化钠标准溶液当天稀释。5.20.2.3 中性甲醛溶液：量取200ML甲醛溶液（GB685）于400ML烧杯中，置于电磁搅拌器上，边搅拌边用0.05MOL/L氢氧化钠溶液调至PH8.1。5.20.2.4 30%过氧化氢（HG3-1082）5.20.2.5 PH7.00、4.01缓冲溶液。5.20.3 仪器设备：实验室常用玻璃仪器及下列各项：5.20.3.1 PH计：直接读数，测量范围0-14PH，精度±0.1PH。5.20.3.2 电磁搅拌器。5.20.3.3 玻璃电极5.20.4 试样的制备：5.20.4.1 浓缩果蔬汁在浓缩果蔬汁中，加入与在浓缩过程中失去的天然水分等量的水，使其成为果汁，并充分混匀，供测试用。5.20.4.2 果蔬原汁及果蔬汁饮料将试样充分混匀，直接测定。5.20.5 测定步骤：5.20.5.1 PH计校正：按W-PBB-4303中“PH值测定作业规范”校正步骤校正。5.20.5.2 吸取试样M克(毫升)(氨基态氮的含量为1-5毫克)于烧杯中，加5滴30%过氧化氢，将烧杯置于电磁搅拌器上，电极插入烧杯内试样中适当位置。如需要加适量蒸馏水。5.20.5.3 开动电磁搅拌器，先用0.1MOL/L氢氧化钠溶液慢慢中和试样中的有机酸。当PH达到7.5左右时，再用0.05MOL/L氢氧化钠溶液调至PH8.1，并保持1分钟不变。然后慢慢加入10-15ML中性甲醛溶液。1分钟后用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至PH8.1。记录消耗0.05MOL/L氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。5.20.6 结果表示：测定结果表示见公式： X= X：每100克（或100毫升）试样中氨基态氮的毫克数，（mg/100g或mg/100ml）C：氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，MOL/LV：加入中性甲醛溶液后，滴定试样消耗0.05MOL/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积，MLM：试样的重量，G（或体积ML）K：稀释倍数14：1ML1N氢氧化钠标准滴定溶液相当于氮的毫克数同一样品以两次测定结果的算术平均值作为结果，精确到小数点后第一位。

非水滴定法进行测定。

原理氨基改性硅油是一种弱碱性硅油，不溶于水，因而难以用水相酸碱滴定法测定其氨值，在此采用HClO4HAC非水滴定法进行测定，并用三氯甲烷作质子惰性溶剂。

氨基改性聚硅氧烷类化合物是构成纺织品高级柔软剂的最重要组分，而氨基改性聚硅氧烷类柔软剂也是最具代表性的聚硅氧烷类柔软剂品种。