加2ml含0.3m盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀怎么配
蛋白质的提取
准备试剂：异丙醇含0.3M盐酸胍的95%乙醇无水乙醇1%SDS。
操作步骤：
1.取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml
TRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2～8℃12000×g离心10分钟弃上清。
2.用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2～8℃7500×g离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。
3.真空抽干蛋白质沉淀5～10分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50℃温浴使其完全溶解，不溶物2～8℃10000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Western
Blot或-5至-20℃保存备用。
注意事项：
1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2～8℃一个月以上或-5至-20℃一年以上。
2.用0.1%
SDS在2～8℃透析三次，10000×g离心10分钟取上清即可用于Western
Blot。
常见问题分析：
得率低：
A.样品裂解或匀浆处理不彻底。
B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解。
蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻。
电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分。
植物蛋白质提取方法总汇
一、植物组织蛋白质提取方法
1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。
2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。
3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
4、提取上清液，样品制备完成。
蛋白质提取液：300ml
1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml
2、甘油（Glycerol）75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g
这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！
二、植物组织蛋白质提取方法
氯醋酸—丙酮沉淀法
1、在液氮中研磨叶片
2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。
3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。
4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。
5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。
药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。
这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！
三、组织：肠黏膜
目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达
应用TRIPURE提取蛋白质步骤：
含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）
倒转混匀，置室温10min
离心：12000 g，10min，4度，弃上清
加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）
振荡，置室温20min
离心： 7500g，5 min，4度，弃上清
重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次
沉淀中加入100％乙醇 2ml
充分振荡混匀，置室温20 min
离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀
1％SDS溶解沉淀
离心：10000g，10min，4度
取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT）
存在的问题：加入1％SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。
解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。
四、植物材料：水稻苗，叶鞘，根
1、200毫克样品置于冰上磨碎
2、加lysis buffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清
3、重复离心5min
lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40
五、蛋白质样品制备
秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。
100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，15000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
按每mg干粉加入20μl（可调） UKS液[9.5 M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃温育30min，期间搅动几次，28度 （温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000 r/min离心15 min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存
六、植物根中蛋白质的抽取
(1) sample, 液氮研磨
(2) 装1.5 ml centrifuge 用tube
(3) 加 1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul
(4) 12000 rpm, 4度, 10-15minite
(5) 取上层液，蛋白质就在里面
事实上，问题的序列（即，遇到–SER和满足–
THR）是不存在的多肽序列
利用在目前的研究中，高效的碎片
预期的网站大大损害时，70%
三氟乙酸作为反应介质。相反的，有效的
的多肽裂解发生如果反应
介质为70%发或由一个矩阵组成的更换
0.1M的HCl / 6M盐酸胍。从我们的结果
学习是有趣的，由于广泛使用的
70% TFA对溴化氰裂解的媒介选择
[ 25 ] 23–蛋白质。事实上，值得注意的是，蛋白
化学协议一般都推荐使用
为了防止氨基酸化学修饰
侧链（例如，Ser和Thr和Tyr和甲酰化
色氨酸氧化）和提高裂解产生的
包括了–苏氨酸和丝氨酸序列的蛋白质–见面
或
在本报告中,我们表明,尽管
有问题的序列(即。Met-Ser,遇到了-
刺)在多肽的序列都不存在
在当前的研究中,利用高效的碎片
预计网站大大受损时为70%
出来作为反应介质。相比之下,有效
劈理的多肽发生反应
中被替换为70%足总或矩阵组成
0.1 m盐酸/ 6 m GdnHCl。从我们的结果
研究是有趣的,考虑到广泛的使用
70%的TFA的媒介选择CNBr乳沟
蛋白质(第23 - 25)。事实上,值得注意的是,蛋白质
化学协议通常推荐其利用率
为了防止氨基酸的化学改性
侧链(例如、丝氨酸和苏氨酸甲酰化和酪氨酸
给出Trp氧化),也使乳沟产量提高
蛋白质由Met-Thr和Met-Ser序列
2. 避免在buffer中包含EDTA或柠檬酸盐等螯合剂。
3. 若重组蛋白以包涵体形式表达，在所有的buffer中添加6 M盐酸胍或8 M尿素
4. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等
5. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如DTT，防止二价Ni被还原；
6. 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；
7. 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%（v/v）
8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；
9. 可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染
注：
1. 包含尿素的样品可直接进行SDS-PAGE分析，若样品中包含盐酸胍，在SDS-PAGE前则需先用含有尿素的buffer进行透析
2. 除利用咪唑洗脱蛋白，其它方法，如低pH值法等可被应用，详见说明书
Binding buffer 中咪唑的浓度
在洗涤时所用的Binding buffer 中咪唑浓度越大，重组蛋白纯度越高。但过高的咪唑浓度将导致蛋白的洗脱。合适的咪唑浓度需要优化。
Buffer 的准备
所用的水及化学物质须是高纯度的。Buffer 在使用前需经0.45μm滤膜过滤。所用高纯度的咪唑需在280nm 处无吸光度或吸光度极低。
推荐 buffer （使用前用0.45 μm filter过滤）
Binding buffer：20 mM 磷酸盐
0.5 M NaCl
20- 40 mM 咪唑 pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）
Elution buffer ：20 mM 磷酸盐
0.5 M NaCl
500 mM 咪唑 pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）
1. 样品准备
样品需被充分溶解。过柱前经0.45 μm滤膜过滤。样品以pH 7.4 binding buffer 溶解。勿用强酸强碱调节pH 值，否则将可能导致沉淀。
2. 重力纯化法 Ni-NTA Column 准备
1.温和地颠倒瓶中的N
包涵体染色的方法有哪些？原理是什么
包涵体染色的方法有哪些？原理是什么
蛋白包涵体-溶解原理及方法2009年03月15日；维持包涵体内蛋白质结构的作用力是分子内的作用力，；1.遵循标准；包涵体蛋白质的溶解同样是一个工艺的关键的步骤；(1)快速溶解的动力学；；(2)与蛋白质的结合是可逆的；；(3)对细胞碎片的分离方法没有干扰作用；；(4)对温度没有依赖作用；；(5)抑制蛋白质酶的降解作用；；(6)与蛋白质的氨基没有化学修饰作用；；
维持包涵体内蛋白质结构的作用力是分子内的作用力，这种作用力也维持天然蛋白质的稳定性的结构。先前有报道这种作用力是共价键结合的，但是，现在趋向于一致，就是维持包涵体内部的蛋白质的紧密的结构的是非共价键的作用力。二硫键，无论是正确的还是错误的二硫键，在维持内部蛋白质的紧密的结构中都没有发挥直接的作用。最经常的获得活性蛋白质的第一步是溶解这些包涵体蛋白质，溶解液是使这些包涵体蛋白质完全变性的成分，当蛋白质被溶解以后，则进入到蛋白质的体外折叠的过程。
1. 遵循标准
包涵体蛋白质的溶解同样是一个工艺的关键的步骤。溶剂的选择会影响后续的操作、最终的各种蛋白质的收率以及最终的成本，必须遵循以下的标准：
(1) 快速溶解的动力学；
(2) 与蛋白质的结合是可逆的；
(3) 对细胞碎片的分离方法没有干扰作用；
(4) 对温度没有依赖作用；
(5) 抑制蛋白质酶的降解作用；
(6) 与蛋白质的氨基没有化学修饰作用；
(7) 在可能的情况下，选择最低的溶解浓度和廉价的溶剂，并适于以后的复性方法。
2. 溶解包涵体的试剂
最经常使用溶解包涵体的试剂包括离液剂或者去垢剂。
最经常使用的溶解和制备蛋白质的离子型的离液剂最早于1969年Hatefi等人发展的离子型的去垢剂如SDS是另外一种溶解包涵体蛋白质和膜蛋白质的试剂，但是一般不用来大规模的生产，而是用来定性。除了强酸、强碱和利用有机溶剂来提取疏水性很强的蛋白质以外，其他的变性方法如非可逆的共价修饰在工业的大规模生产中很少用到。一旦蛋白质被溶解，蛋白质中的巯基很容易快速地氧化并形成共价的聚集体或者分子内错配的二硫键，然后这些蛋白质就不能再进行折叠。为了防止氧化，可以使这些基团或者利用缓冲液中含有低分子量的疏基试剂保持在还原的状态或形成磺酸盐或者形成混合的二硫键。
（1）去垢剂
去垢剂是一种最经济的溶解包涵体蛋白质的方法，一个最大的优点是溶解的蛋白质有可能保持全部的生物活性，说明在此条件下保持了蛋白质的四级结构。最重要的是稀释以后蛋白质的聚集比其它溶剂生成的很
少。阳离子型、阴离子型的和非离子型的去垢剂都可以使用，使用时的浓度一般高于去垢剂的临界胶束浓度（CMC ），通常是0.5-5%。
SDS仅仅在大量生产牛生长激素、干扰素和白介素-2中用到。SDS由于具有较低的临界胶束浓度（CMC）而使得结合到蛋白质分子上的SDS比较难于除去。由于N-十二烷肌氨酸它的CMC比SDS高0.4%，也被用来溶解包涵体蛋白质并可用稀释的方法使蛋白质复性，残余的去垢剂可以使用阴离子交换色谱或者超滤的方法除去。这种去垢剂是一种比较温和的去垢剂，可以选择性地溶解一些包涵体，但是不能溶解完全的变性的蛋白质的聚集体和大肠杆菌的内膜的蛋白质分子。使用去垢剂一个主要的缺点是对以后的纯化和复性的步骤的干扰，去垢剂结合到蛋白质上的强度大离子交换色谱复性蛋白质小不同，比较难于除去，并干扰离子交换和疏水相互作用色谱的过程，在变性的浓度时超滤膜会吸附这些变性剂。所以复性后需要尽量洗涤这些去垢剂，也可以使用环状糊精链状糊精或者环状淀粉从复性缓冲液中提取去垢剂。
一个不容忽视的问题是去垢剂可以溶解全部的膜蛋白质中的蛋白质酶，这些蛋白质酶的活性在去垢剂的存在的情况下被活化，可能造成溶解和复性过程的收率的降低。蛋白质复性的收率可以通过以下的方法来提高： a) 先期使用可以溶解膜蛋白质但是不溶解包涵体蛋白质的溶剂尽量洗涤包涵体蛋白质；
b) 包涵体的含有的菌体碎片被完全除去；
c) 溶解包涵体的液体中含有蛋白质酶的抑制剂，如EDTA，苯甲基磺酰氟（PMSF ）等 。
（2）离液剂
其它的离液剂也被用来溶解包涵体蛋白质，最主要的溶解包涵体蛋白质的离液剂是盐酸胍和尿素，这是最经常使用的溶解试剂，一般情况下选择6-8mo1/L的浓度，蛋白质浓度在1-10mg/mL。
在溶解色氨酸合成酶A的过程，发现阳离子的溶解能力顺序是Gdm+ >Li+ >K+ >Na+，阴离子的顺序是SCN- >I- >Br- >Cr-。一些离液剂由于它们的溶液比盐酸胍和尿素有更高的密度和黏度而不适合用于溶解包涵体，因为利用离心和色谱分离起来比较困难。
为了溶解包涵体蛋白质需要的尿素或者盐酸胍的浓度根据蛋白质的不同而不同。如果蛋白质天然形态需要溶解的变性剂的浓度不能获得，则在溶解包涵体时需要首先确定离液剂的浓度。
盐酸胍由于比较贵，所以一般用来溶解一些附加值比较高的药物蛋白质分子，选择盐酸胍作为溶解试剂，是因为盐酸胍是一种比脲更为强烈的变性剂，甚至可以溶解脲所不能溶解的包涵体；尿素，由于可能被自发的形成的氰酸盐或者已有的氰酸盐的污染，特别是在碱性环境中，从而造成蛋白质的自由的氨基被不可逆的修饰。消除此种影响的方法是用阴离子的缓冲系统如Tris-HCl溶解脲或者脲在使用之前利用阴离子交换色谱纯化，并且配制的溶解和复性的缓冲液在当天使用。脲溶液中影响蛋白质变性的因素与盐酸胍的不同。溶在脲中的蛋白质受到pH和离子强度的影响，从而影响电荷的蛋白质残基之间的电荷作用，但是由于盐酸胍含有高浓度的离子强度，所以这两个因素的影响很少。
（3）混合溶剂
一般情况下去垢剂并不联合使用，Lilly等人发现去垢剂和尿素的混合液有效的摩尔浓度较低。尿素和去垢
剂型的盐混合可以使蛋白质变性，但是尿素和非去垢剂的盐如氯化钠反而降低包涵体蛋白质的溶解性，所以要避免使用。
去垢剂结合其他的试剂或者溶解增强剂也被使用，发现尿素和乙酸，尿素和二甲亚枫，尿素和高pH等是比较有效的溶解包涵体蛋白质的方法。
高压（1-2kbar）、超声也可以溶解包涵体蛋白质，此时使用的溶解试剂浓度可以比较低，便于后续的复性步骤。
3. 极端pH
酸碱度也是比较廉价的有效的溶解包涵体的方法。最经常使用酸的是有机酸，浓度在5-80%之间。Gavif和Better使用低的（pH≤2.6）和高温（85℃ ）溶解抗真菌的重组蛋白质的肤段，低温和高PH需要溶解时间要长。Reddy和合作者也使用20%乙酸溶解一种麦芽糖结合的蛋白质。但是，同样的一些不可逆的修饰作用或者酸降解会在极端pH下发生，所以此种方法并不是经常使用的溶解包涵体的方法。
高pH（≥12）也被用来溶解生长激素和原胰岛素。在高pH下一些蛋白质同样可能发生非可逆的变性，原因在于半胱氨酸在碱性条件下的脱硫过程。所以这种方法尽管比较简单、廉价，同样仅仅用于一些特定的蛋白质，特别对于药用蛋白质一般不采用这种方法。
再登陆http://www.biox.cn/content/20050415/10541.htm
摘要 基因重组蛋白在大肠杆菌中表达时，由于表达量高，往往形成无生物活性的包涵体。包涵体必须经过变性和复性的过程才能获得有活性的重组蛋白。如何提高基因重组蛋白质的复性率，是生物工程技术的一个研究热点。对近年来的重组蛋白质的复性方法做一评述，为研究蛋白质折叠以及复性技术的进一步应用提供依据。
关键词 重组蛋白 包涵体 复性 二硫键
到目前为止，人们表达的重组蛋白质已有4000多种，其中用E.coli表达的蛋白质要占90%以上，尽管基因重组技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，然而人们在分离纯化时却遇到了意想不到的困难，即这些蛋白质在E.coli中绝大多数是以包涵体形式存在，重组蛋白不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约0.1~3.0μm的固体颗粒[1]。自从应用大肠杆菌体系表达基因工程产品以来，人们就一直期望得到高活性、高产量的重组蛋白。不可溶、无生物活性的包涵体必须经过变性、复性才能获得天然结构以及生物活性，因此应该选择一个合适的复性过程来实现蛋白质的正确折叠，获得生物活性，近年来的研究可以使复杂的疏水蛋白、多结构域蛋白、寡聚蛋白、含二硫键蛋白在体外成功复性。
包涵体形成的原因
重组蛋白在宿主系统中高水平表达时，无论是原核表达体系或真核表达体系甚至高等真核表达体系，都会形成包涵体[2]。主要因为在重组蛋白的表达过程中，缺乏某些蛋白质折叠过程中需要的酶和辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的[3]。
1、 表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、 重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。
3、 重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
5、 有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。
减少包涵体形成的策略
1、 降低重组菌的生长温度，降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成[4]。
2、 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl[5]。
3、 供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。
包涵体的分离及溶解
对于生物制药工业来说，包涵体的形成也是有利的，不仅可获得高表达、高纯度的重组蛋白质，还可避免细胞水解酶对重组蛋白质的破坏。由于包涵体是蛋白质聚集而成的致密颗粒，分离的第一步是对培养收集的细胞进行破碎，比较有效的方法是高压匀浆结合溶菌酶处理，然后5000~20000g离心，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离，接着，包涵体沉淀需用去污剂（Triton X-100或脱氧胆酸钠）和低浓度变性剂（2mol/L尿素或盐酸胍等）洗涤除去脂类和膜蛋白，这一步很重要，否则会导致包涵体溶解和复性的过程中重组蛋白质的降解[6、7、8]。
包涵体的溶解必须用很强的变性剂，如8mol/L尿素、6~8mol/L盐酸胍，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，异氰盐酸胍最强；去污剂，如SDS[7]，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；酸，如70%甲酸[9]，可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加入还原剂（如DTT、GSH、β-ME）打开蛋白质中所有二硫键，对于目标蛋白没有二硫键的有时也应使用还原剂，为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解，同时还应加入金属螯合剂，如EDTA或EGTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子与还原状态的巯基发生氧化反应[10]。
蛋白质的折叠机理
包涵体蛋白在变性剂作用下，为可溶性伸展态，在变性剂去除或浓度降低时，就会自发的从变性的热不稳
状态向热力学稳定状态转变，形成具有生物活性的天然结构[11]。然而在去除变性剂的同时，重组蛋白质在体外折叠，分子间存在大量错误折叠和聚合，复性效率往往很低，包涵体蛋白折叠复性的效率实际上取决于正确折叠过程与聚集过程之间的竞争[1]。对于蛋白质的折叠机制，目前有多种不同的假设，但很多学者认为有一个“熔球态”的中间状态，在“熔球态”中，蛋白质的二级结构已经基本形成，其空间结构也初具规模，再做一些局部调整就可形成正确的立体结构，总之，蛋白质的具体步骤可用下式描述[12、13、14]：
伸展态→中间体→后期中间体→天然态体→聚集体
在折叠反应中，从伸展态到中间体的速度是非常快的，只需要几毫秒，但从中间体转变为天然态的过程比较缓慢，是一个限速过程。聚集过程与复性过程相互竞争，故而应尽量避免聚集体的产生。一般认为，蛋白质在复性过程中涉及两种疏水作用，一是分子内的疏水相互作用，可促进蛋白质正确折叠；一是部分折叠的肽链分子间的疏水相互作用，在复性过程中，部分折叠的中间体的疏水簇外露，分子间的疏水相互作用会导致蛋白质聚集。蛋白质的立体结构虽然由其氨基酸的顺序决定，然而伸展肽链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响，如温度、pH值、离子强度、复性时间等因素的影响。
提高重组蛋白质折叠复性的方法
一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少[15]。
1、 透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染；稀释法处理量太大，不利于工业放大[16]。
2、 高蛋白浓度下的复性方法：一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍能得到较高的复性率。一个方法是把变性蛋白缓慢连续或不连续地加入到复性液中[17]。在两次蛋白加入之间，应有足够的时间间隔使蛋白质折叠通过了易聚集的中间体阶段。这是由于完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠的蛋白一起聚集。第二种方法是用温度跳跃策略[4]。变性蛋白在低温下复性折叠以减少聚集，直到易聚集的中间体大都转化为不易聚集的后期中间体后，温度快速升高来促进后期中间体快速折叠为蛋白的天然构象。第三种方法是复性在中等的变性剂浓度下进行[18]，变性剂浓度应高到足以有效防止聚集，同时又必须低到能够引发正确复性。
3、 添加促进剂的复性方法：包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性。通常使用的添加剂有：a、共溶剂：如PEG6000~20000，通过与中间体特异的形成非聚集的复合物，可以阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会，减少蛋白质的聚集；b、去污剂及表面活性剂：如Trition X-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用，但它们能与蛋白质结合，很难去除；c、氧化-还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加入氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等，氧化还原系统通过促进不正确形成的二硫键快速交换反应，提高了正确配对的二硫键的产率[19]；d、小分子的添加剂：如盐酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺类等，都可阻止蛋白聚集，它们的作用可能为：稳定蛋白的活性状态、降低非正确折叠的稳定性、增加折叠中间体的稳定性、增加解折叠状态的稳定性。e、0.4~0.6M L-Arg：L-Arg能使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率。f、添加分子伴侣和折叠酶：分子伴侣是指能够结合和稳定
RNA提取般步骤总结
^ 2 ^ G＃N1 EWRNA萃取原理：
/ |＃K0 K. @ 9 W |破碎细胞或组织RNA氯仿等机溶剂萃取并再经沉淀洗涤干燥溶解变性剂由于RNA酶处随能RNA降解所需要注意实验稍疏忽前功尽弃
0 T3 Z（F＆_D6 C％^Y A6 _RNA H6提取般步骤
- O：Y + X $ P＃S8 U4 M9所RNA提取程五关键点即：效破碎细胞或组织本效使核蛋白复合物变性内源性RNA酶效抑制效RNA提取DNA蛋白质混合??物参与效除糖杂质糖含量高品关键抑制RNA RNA提取阶段两种式使用：提取总RNA核酸沉淀氯化锂直接酸性条件酸性条件DNA蛋白质提取RNA留水相机相第提取导致量RNA损失种使用电流频率已经非低 （O（克^ + K）F + I＆]％P
实验步骤：
* L＆D6 S5 E（Q1 F（G2 | J ^ 0坏组织RNA→沉淀→离RNA→洗涤→保存RNA→解冻RNARNA6 D8} QYg * X
甲破碎组织RNA酶失同进行使用盐酸胍异硫氰酸胍NP-40SDS蛋白酶K等粉碎组织加入β-ME抑制RNA性
S（％）F`0 [1 D *米] 0 e2RNA离般用苯酚氯仿等机溶剂通加入少量异戊醇并步骤离离RNA般布层蛋白质层离
＆X. P）I）YU / L＃[3般用乙醇3M醋酸钠（pH值5.2）或异丙醇沉淀RNA 2 @ 0 D＆Z7 + IG1 @
4用70％乙醇洗涤洗涤RNA避免RNA洗掉步骤省略洗涤干燥或干燥乙醇能太干否则难溶解
3 @％VO9 V + I1 J2 O9 KZ5融化RNA通用于TE
L5 F N6}（S1吨％Z＆J6保存RNA应低温防止痕量RNase污染离RNA富RNase品（胰脏肝脏）需要要存储甲醛期存储高品质RNA存储特别鼠肝脏RNA水存储星期鼠脾脏提取基本降解RNA提取仍存储水3稳定外度比跟踪RNase降解于4KB誊转录呈现更敏增加RNA品存储稳定性RNA溶解离甲酰胺并存储-70℃保存RNA甲酰胺必须包含自胰腺RNA碎片RNA降解甲酰胺至少节省使用面准备使用RNA：加入醋酸钠0.3 M12000×g离5钟沉淀RNA
P3 [7米* ^ $ U $ _
：F徐* N（（I氯化锂提取总RNA：
U}'IR'^'^＆升尿素变性蛋白高浓度本发明并抑制RNA酶RNA选择性用氯化锂沉淀特别适合于少量组织RNA提取量品具快速简洁处少量污染DNARNA产量高损失RNA片段缺陷＃?* S：} 9`* R4 Z3 P
检测试剂：
D $ R6 Q_ I8 Q1氯化锂/尿素溶液氯化锂126克（3M）尿素360克（6M）加水至1L通滤灭菌]
7 _8 W1吨O9'QI4 Z2悬浮液[10mMTris-HCl（pH值7.6）1mMEDTA（pH8 0）0.5％SDS]
M8第4季R＆Y：B＃`7测试程：7 [ $`*}O7 _ Z'{
1进行量组织或细胞每克组织或细胞加入5-10ml氯化锂 - 尿素溶液匀浆器件速度匀浆2钟于数量细胞（107细胞/毫升）每克组织或细胞加入0.5毫升氯化锂 - 尿素溶液手匀浆并转移Eppendof管 ＆Y）B：EQL / ^ Q：\ $号
图2所示匀浆液放置0-4℃412000克离30钟 X-C6 D-N / N0 K表 T2 A
3颗粒加入1/2体积原始匀浆液体氯化锂 - 尿素溶液重复步骤2
）YX）S0 K9 Y6 Je4用1/2体积原匀浆液氯化锂 - 尿素溶液重构沉淀加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇室温15-30钟摇组合4000克离5钟
3 D2 VI1??（?* D5水清液添加1/10倍体积3M乙酸钠（pH5.2）2倍体积乙醇??-20℃进行15000克离
L4Q4 U L：* K％Z $ （E670％乙醇沉淀洗涤并真空干燥3}R0 [/ Q'G9 Q
RNARNA溶解液溶解沉淀物装保存于-70℃
0 F X％R（H％B7?
Y7 J5 U $ C'|）[％? J3e：Q蛋白酶 - 热酚|^ 0 B *）P3 S * C4 B4 H4升
本发明适合病毒RNA提取
* I（I + B＃RK测试试剂：
$ 4 [7 H9`）蛋白酶K（终浓度50ug/ml）J1J5 P L6 V / T7 [/ I
22×缓冲液：1％SDS20mM Tris-HCl（pH值7.6） 0.2MnaCL9 HP] Y + \ $ Z）O
测试程序：＃W3 [$] 5 Y V8 G1
1纯化病毒溶液加入等体积缓冲液蛋白酶K37℃40-50钟
- K0 - P / E'Q-Z7?G0 M＃{＃D2加入等体积65°?预热酚溶液轻徭薄赋光5钟65℃徭培养
W `W（E：酷睿i3 ^ 3离取清液氯仿萃取间（Z0 DJ2 7米+ D2 Q＆X?
4取层水相加1/10倍体积3M乙酸钠（pH5.2）2倍体积乙醇??-20℃进行1离离5000克（万克10钟）
7 [/瓦特氢气D6 U $ k570％乙醇洗涤沉淀物真空干燥
％A5 Y{（W％3 * Y O E）P6 RNA溶解液溶解沉淀RNA装保存于-70℃策植物RNA提取程难
策植物RNA提取程难
）O5 B7 D / Q3 _酚类化合物干扰及策：
A9 D * Z3 K 7 W许植物组织特别水（苹樱桃李葡萄等）植物树木植物含丰富酚类化合物酚与植物增加含量更容易轻植物材料RNA提取外针叶树植物落叶植物叶织针酚含量要高氧化匀浆焦黄加深植物材料匀浆酚类物质释放氧化程度增加种现象称褐变影响（BROWNING效）酚类化合物（例醌类）与RNA稳定结合氧化影响RNA离纯化纽伯与酚类总量材料没发现RNA提取难易程度间相关性并非所酚类化合物影响RNA提取般认所谓缩合单宁聚合物羟基黄酮醇类物质（原花青素物质）影响RNA提取类化合物除酚类化合物般初始阶段提取防止氧化离RNA 9 B0 S} 0 U6 | 9 K / L VV G1?/ @
防止氧化酚化合物：
V yA4 K7 N /原Z1：般提取缓冲液加入（ - 巯基乙醇二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸防止酚类氧化提取溶液（ - 巯基乙醇浓度高2％（ - 巯基乙醇等断便苏由酚氧化酶失二硫化物即添加沉淀RNA夜（ - 巯基乙醇（终浓度1％）防止氧化程硼氢化钠（硼氢化钠）酚类化合物原醌原剂用提取缓冲液处理棕色消减醌化合物原酚化合物
＆H Z P +?＆T％T5 G＆G1 M-P / Q U2螯合剂：螯合剂聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）CO-N =基团包括酚化合物强结合能力结合能力与酚化合物芳香环数目增加羟基加强原花青素物质包含许芳香环羟基基团其形稳定复合物与PVP或溶性PVPP使原花青素物质能酚氧化酶酶底物氧化并且提取步骤除随着PVP除酚pH值重要影响素结合酚PVP pH值8.0更迅速降低[11]原花青素单独使用更质量PVPP除所化合物需要与其结合使用
p％N0瓦特/ t7r3Tris-硼酸盐：提取缓冲液含Tris-硼酸盐（pH7.5）其特征于所述硼酸根据带*氢与酚类化合物形复合物抑制酚类氧化与RNA结合种非效所提取缓冲液溶液加入Lбpez-Gбmez再其原剂Tris-硼酸浓度高（>0.2M）影响RNA收率
＃P8] 0 ^ 8 K3 a4牛血清白蛋白（BSA）（）：物质BSA原花色素产类似溶性或溶性复合物形间抗原 - 抗体相互作用降低材料RNA结合原花色素机提高产率RNA BSAPVPP合并提取液效更由于RNA酶往往含BSA要加入使用肝素抑制核糖核酸酶性 ?＃H / Y（P7 Q）J4）G * W1 G8升
5星丙酮：Schneiderbauer冻结云杉松树山毛榉等-70℃丙酮萃取植物材料与抛光效离高品质植物材料酚醛化合物丰富RNA @ + - X / V9 Z8 T8 H：B3?白c
除酚类化合物：
＆Z＃H）G0 H＆$ I1 N F L9 N李+Ca2 +沉淀RNA未氧化酚类化合物清除PVP溶性PVPP或BSA结合酚类物质直接通离离除或曼宁使用高浓度2 - 丁氧基乙醇（50％）沉淀RNA除苯酚氯仿萃取酚溶解2 - 丁氧基乙醇除含50％2 - 丁氧基乙醇缓冲液洗涤RNA沉淀认甚至酚氧化其氧化产物仍溶解高浓度2 - 丁氧基乙醇溶液除残留酚删除外没必要再使用硼氢化钠处理 C6 Y8 A1 SV：2
糖干扰及策：6 I-B3 R4?$ T＆O
糖污染提取植物RNA经遇另棘手问题植物组织往往富含糖许物理化性质RNA糖非相似难除糖RNA裹着移植性路程导致RNA产量减少RNA沉淀产糖凝胶状沉淀物例含糖类RNA沉淀溶于水或溶解粘稠溶液由于糖抑制许酶性污染糖RNA品能用于进步物研究传统通SDS-盐酸胍处理部除些糖氯仿萃取移除些糖由苯酚存高浓度Na +或K +离条件?? LiCl沉淀RNA糖部留清液即使通些步骤仍发现相数量糖RNA混合起所需要使用更效式解决污染问题植物RNA离纯化糖
7 ['X / Ed8×（沸点（| 9 C＆n与低浓度乙醇沉淀除糖糖种更提取RNA或溶液缓慢加入水乙醇至终浓度10％至30％并且使沉淀糖RNA保持溶液乙醇溶液加入通植物材料匀浆Lewinsohn RNA萃取裸植物木质茎统乙醇浆料清液加入终浓度10％情况沉淀糖Tesniere葡萄浆组织提取RNA通CsCl超离乙醇沉淀RNA溶液加入终浓度30％乙醇沉淀糖进步纯化RNA品
I5 B5米* Z9八集团M4? - N / D另用醋酸钾沉淀糖加入1/3量5 M醋酸钾（pH4.8）解决案巴赫卢勒云杉组织匀浆提取RNA沉淀糖安斯沃思鲁梅克斯植物花卉组织RNA提取加入1/5体积5 M钾乙酸乙酯（pH4.8）溶液 Hughes等棉叶花粉RNA提取添加1/3体积8.5M醋酸钾（pH值6.5）溶液匀浆除糖等杂质植物材料RNA提取物述两种组合使用种Lбpez-GбmezRNA提取芒皮匀浆液加入0.25体积水乙醇0.11倍体积5M醋酸钾溶液除糖杂质 Su等除糖藻酸盐单独使用乙醇或醋酸钾效并使用结组合
6 C9 | 5 Q1 B9 ??[5 L1 S + N缓冲液含高浓度NaCl助于除糖 Chang等提取松树核糖核酸NaCl浓度2.0M1.0M缓冲溶液氯仿萃取乙醇沉淀RNA与糖离RNA曼宁萝卜种其材料苯酚提取清液稀释Na +离浓度调节至80毫米加入0.4体积2 - 丁氧基乙醇沉淀除糖 3 B1 H＃M'{+ {0 U％UK2 @V
蛋白质杂质影响策：$ _at_ - G5 O（F1 S9 _2 V * G2 N / ^
蛋白RNA品污染重要素核糖核酸酶酚氧化酶蛋白质获完整高质量RNA必须效除蛋白杂质传统抑制冷冻条件性RNase等磨碎植物材料提取缓冲液含蛋白质变性剂苯酚胍十二烷基硫酸钠十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）使匀浆蛋白质变性聚集些蛋白酶K降解蛋白质杂质五月进步除蛋白质用苯酚氯仿萃取 T7五（F1 J9 @ + E
Wilcockson同溶解度使用高氯酸钠溶液蛋白质RNA离 70％高氯酸钠溶液于该蛋白质溶解度RNA溶解度数蛋白质沉淀随通离离清液加入两倍体积水乙醇RNA安顿并溶解70％高氯酸钠溶液残余蛋白保持清液除部蛋白质
3 QE / \ * IA＆@代谢产物影响及策:: N3）N F K＃NP F6 H0 J2 A0 {
另困难植物组织许高等植物组织尤其熟组织产些水溶性级代谢产物提取RNA质量些级代谢产物容易与RNA结合RNA提取满阻碍离物性RNA些级产品能确定具体物质没特别式解决问题贝克休斯等选择性沉淀Chirgwin氯化铯梯度离离纯化松树种熟松树针叶植物组织RNA艾弗森RNA恢复 （M S5 O％FH-Q * \（`（}
难易其物材料植物组织特别高等植物细胞内外复杂性组合物使植物组织RNA提取阶段通实践发现即使同种植物同组织RNA提取同同植物材料包含某种干扰素同RNA提取能适用即使同种植物相同组织材料同基型植物RNA提取能相同于工厂或组织其相应RNA提取必须经探索实践建立 ＃S0＃G7 L3 S＆A
随着植物物研究领域扩我肯定说现新困难RNA提取植物材料程作其研究基础断探索经验积累科家快解决些困难并植物物发展铺平道路些特殊植物RNA提取
些特殊植物RNA提取
$ E * [U（E％H'酚植物RNA提取：JD2 V（R! B＆?
苹棉花酚植物RNA提取采用TRIZOL般没验证效所提取RNA纯度没特别高作北足够 6 J＆D2 U（\ 6 W8 _＆O4 E1 X1吨
试剂：
＃S7 S8? R＃W1 Y＃克提取缓冲区200毫升：氯化钠1.1688克100毫米Tris2.4228克10毫米（Tris-HCl4.0）EDTA5.8450克10mMSDS2.0000克1％NaOH溶液调节至8.0并设置200毫升再加200ulDEPC解冻 * J）T2 @）T4 W'F
测试步骤：
?A0 I * C（W5 S * A'W11.5毫升管冷冻液态N2吼加入0.1克品加入500UL苯酚 - 氯仿加入500UL提取缓冲液剧烈振摇1钟放置冰5钟 F3 S0 V5 @ 0 S7 I1?
24 12000rpm进离15min清液转移新试管添加氯仿异戊醇提取间 ）H'L7 D＃DY8 @
3取600ul异丙醇-20℃沉淀20钟
＆W：M2 R：I4 \ L＃J412000转离10min
IY \ 8 b7A5沉淀物用乙醇（70度）
K T. D1 [0 w +）_0 D5 68000RPM 5钟
AY＃}'F（`5} 6我+ NX7沉淀干燥溶解30ulDEPC水^ 0 QR +`5 J（N'['M9号
＃M / R3 O2? T6 Z $`1 M＆E ^
银杏等木本裸植物RNA提取：A I＆V H0` ?
银杏香其木本裸植物代谢物糖离纯化RNA干扰RNA提取质量产量严重影响酚含量物实验展带阻碍目前RNA提取许传统Trizol试剂盒SDS其提取银杏RNA蜀郡张等（1993）CTAB提取RNA质量较差退化非严重改善其提取步骤获更高质量银杏RNA品 / S4我* V K8 S）x
检测试剂：M（Q＃E7 N3吨`＃I M（[
11M三：12.11克?斯溶解60米L水用浓盐酸PH8 0.0体积LOO毫升菌DEPC水溶解使用
`4 C9 {）P2 \ 4 T2 M EDTA500米：18.61克?DTAH 2O80米升水搅拌至溶解用NaOH pH值调至8.0定容至100mlV＃X G4 M＃Q3 C5 P * JH4 Y
310摩尔/ LLiCL：42.4 gLiCL 100毫升水溶解即 9 I）@'\＆W + C P * G
图4所示提取缓冲液（DEPC处理）：2％CTAB（蛋白质变性剂）0.2％PVPK 30（除酚）100米摩尔Tris-HCL（pH8.0）25米M EDTA（金属螯合剂混合物）2.0M氯化钠（除糖CTAB）与：10 mL1 mol / L三PVP2克2克CTAB5ML 500毫米EDTA11.7gNaCL音量设置100毫升 ）O + \ 5 E XO＃A（M + P8 H * K9 N0 q
5亚精胺（提取液加少量）（RNA酶抑制剂）
＃J9 G6 O / H（U'D64％稀疏乙醇（添加）提取（除酚）'D ED（J. K $ ZO9 f
7氯仿异戊醇（24：1）（萃蛋白质））U）A +] 4 \＃Q
810 MLiCL（沉淀物RNA）
7 M +）G4 J4 m5C0f-\ 9SSTE（溶解RNA）1.0M氯化钠01m10米MTrisHCL（pH8）：氯化钠2.9克0.25毫摩尔EDTA（pH8.0）5％SDS克SDS0.5毫升1三L 500毫米100 U EDTApH值8.0定容至50 mL M5 Z + J3 X0 V＆\ 6 E7?＃R
测试准备：_5 Z9}F％Q6吨
灰浆玻璃器皿包裹铝箔烘焙温度200℃或至少2或180 * C高温烘烤4信息 X7 N3 WW2} 9 M
2塑料制品（提示管）新裹报纸121'C高压灭菌器消毒40钟或两121'C高压釜每灭菌20钟烤箱烤千
X * F +?V7} A3所溶液制备加DEPC水DEPC UJ浓度0.1％37℃培养夜1211C高压蒸汽灭菌40钟液（Tris没用DEPC所Tris DEPC-处理水溶液制备灭菌处理）
）X＆B {％E ^＆F：S0 q检验程序：Y6 U +`C * \ X2＃R
[据文献（蜀郡张1993）CTAB改进 】
F ^ + E9 I＃H / Q7 M * A *] 14毫升提取物加入lOmL离离机加热管C卜650C水域 $ D + 4 W7 \ 3 J：WM
2研钵用液氮冷却研钵抗氧化剂PVP加入少量采取1克低温冰箱银杏迅速放置研钵加入液氮研磨程防止叶片熔体充研磨紧接添加预热提取缓冲液并混合与手功能 C4我+ L / Z * C5?）V
365℃1钟冷却至室温水
（N2 _at_）U：S{9 ME8 F4通添加量（4毫升）氯仿：异戊X17（2 = L：1）混合10,000 rpm40C10钟
（H6 P O1 Y8 P＃5星仔细清液加入等体积（4毫升）仿：异戊醇（24：1）并混合10,000 rpm40C离10钟{＃K / Z5? ：X：V1 x
6取清液加入1/4体积IOMLiCL混合4℃沉淀夜10000RPM离20钟
7×P4 O6 Z1 D [8} 7干燥溶解沉淀500U?SSTE 1.5M号离管放炮等体积氯仿：异戊醇混合1万转40C离10钟
H2 b7C1e* [6 R4c8离拉伸清液加两倍体积水乙醇-70℃沉淀至少30钟或20℃沉淀物2 W * C'Y1 P-T5 K表）^`
912000rpm进40C离20钟用70％乙醇洗涤两干燥沉淀 1×S * X0 VY6 F /升
1040 U LDEPC处理水溶解沉淀物RNA品 8 F2 C-S4 R3 O9 R4 T E＆{
11除电泳紫外检测RNA-70℃冰箱备用
Q0 O7 V.] 9 x{1我：__
U * X1 M5 G9（W％U改进克拉普提取：
1 R）R＃S3? Q1诉W测试试剂：
C7 Z1 ^）J5 A＆F＆W（K D1RNA提取掖：母液：4mol异硫氰酸胍20毫摩尔EDTA 20毫摩尔MES pH值7.0工作液：取400毫升母液加入1.7毫升2-ME贮存4 ℃储备/ I $ E. RS％Z
2RNA重新悬浮液：氯化锂10毫摩尔乙酸钠2mol调整终体积250mlpH5.2灭菌存储4℃条件使用 2 U J1 S9 V8 ?
测试步骤：
）O / O型L＃q构-D8 V）U1取新鲜植物材料0.5?1g冻干必要添加至0.2g砂磨起拌匀加入10ml RNA提取掖 7 N Q：BS N9 BJ $ü
24℃8000RPM离10min条件层水相转移干净离管并加入等体积苯酚/氯仿萃取除皱离10钟4℃条件8000RPM
1N：K +] 3 R A7`3清液转移干净离管清液1（添加调匀10毫升氯仿洗涤10ml氯仿4℃条件8000RPM离10min ）
$ P + YP / ^ - W / EGK0 Y：[4清液转移另干净试管加入1/10体积3摩尔乙酸钠2倍体积冷乙醇-80℃降水两条件：T＆M8 C-W5O1 O
54℃8500rpm离30钟条件弃清液沉淀再悬浮RNA再悬浮并4℃放置1条件 9 B7 Z＃K4 V（同期L8 Q0 A8?）I％|
64℃条件8500rpm离10min丢弃清液DEOC沉淀物溶解适体积处理水测试包装保存-70℃条件
不要多想 这样的提问没有意义
很多烦恼都是我们自己找的
TRIzol试剂可用于小量样品（50-100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于Western Blotting。
预防RNase污染注意事项：
1． 经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。
2． 使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交*污染。
3． RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。
4． 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01℅v/v,放置过夜,高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。）
RNA的提取
准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
9. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。
10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。
注意事项：
1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。
2．匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3．分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。
预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：
肝和脾6-10μg ,肾3-4μg ,骨骼肌和脑组织1-1.5μg ,胎盘1-4μg ,上皮细胞8-15μg ,成纤维细胞5-7μg 。
常见问题分析：
得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B．RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65 ：A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高
B．样品匀浆时加的试剂量太少
C．匀浆样品时未在室温放置5分钟
D．吸取水相时混入了有机相
E．RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.细胞在用胰酶处理时过度
D.溶液或离心管未经RNase去除处理
E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5
DNA污染: A. 样品匀浆时加的试剂量太少
B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液
蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。
DNA的分离
准备试剂：乙醇 0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇) 75%乙醇 8mM NaOH
操作步骤:
1. 样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1ml TRIzol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3分钟，2-8℃不超过2000×g离心5分钟。
2. 移去上清，（如需分离蛋白质，可保留，进一步操作见后）用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1ml TRIzol加入1ml柠檬酸钠，室温放置30分钟，2-8℃2000×g离心5分钟，弃上清，重复一次。
3. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1ml TRIzol加入1.5-2 ml 75%乙醇,室温放置10-20分钟(不时颠倒混合)2-8℃2000×g离心5分钟, 弃上清。
4. 室温放置晾干DNA 5-15分钟，用8mM NaOH溶解DNA。从50-70mg组织或107细胞中分离的DNA溶于300-600μl 8mM NaOH，DNA的浓度通常为0.2-0.3μg/μl 。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中，建议用弱碱溶解，8mMNaOH的pH值为9，溶解DNA后可用TE，HEPES调节pH。从某些样品（尤其是组织）中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物可>12000×g离心10分钟除去。
DNA的定量：取一份溶于8mM NaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA。根据DNA产量可估计细胞数，人，大鼠，小鼠1×106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1μg , 6.5μg , 5.8μg 。
预期产量：1mg组织或1×106细胞提取DNA分别为肝和肾3-4μg 骨骼肌，脑组织，胎盘2-3μg 人，大鼠，小鼠培养细胞（1×106）5-7μg 成纤维细胞5-7μg
应用：1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES调pH至8.4,取0.1-1μg DNA用作模板。
2.酶切反应 用HEPES或1mM EDTA调节pH至适当值。每μg DNA使用3-5单位的酶，80-90%的DNA是可消化的。
1ml 8mM NaOH溶解的DNA样品pH值调节
Final pH 0.1M HEPES(μl) Final pH 1M HEPES(μl)
8.4 86 7.2 23
8.2 93 7.0 32
8.0 101
7.8 117
7.5 159
注意事项：
1. DNA在中间层和有机相中时可在2-8℃保存过夜。
2．DNA沉淀在75%乙醇中2-8℃可保存几个月。
3．DNA在8mM NaOH溶液中4℃可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至7-8并且加EDTA至1mM，可置于4℃或-20℃长期保存。
（2005年6月30日前75折促销）
His.Bind 纯化试剂盒
通过金属螯合层析纯化 His.Tag 融合蛋白
His.Bind 家族产品提供了用于通过固定化金属亲和层析（ IMAC ）快速一步纯化 His.Tag 序列蛋白的广泛填料选择。 His.Tag 序列（ 6 、 8 或 10 个连续的组氨酸残基）与固定在基于 NTA- 和 IDA- 的 His.Bind 树脂上的二价阳离子 Ni 2+ 结合，洗去未结合蛋白后，用咪唑或 pH 稍低的缓冲液洗脱并回收目标蛋白。该通用系统使得可在温和、非变性条件，或存在 6M 胍或尿素条件下纯化蛋白。
下表所列的不同 His.Bind 填料满足了许多融合蛋白纯化的应用：方便处理多个小量样品的纤维素柱和筒，用于成批制备和重力流柱子的大包装的操作简易的琼脂糖，处理时间短、快速纯化多个样品的 His.Bind 磁性琼脂糖珠，以及适合生产级纯化的高流速 Superflow TM 和 Fractogel 树脂。还有多种带 Ni 2+ （ NTA 或 IDA 化学基团）的填料可供选择。
His.Bind 基质选择指南
产品
类型
载量
特点
应用
Ni-NTA His.Bind Resin
带 Ni 的 NTA 琼脂糖
5-10 mg/ml
最小的 Ni 2+ 浸出
与 20mM b -ME 相容
小到中量
重力流柱
推荐用于真核抽提物
Ni-NTA His.Bind Superflow
带 Ni 的 NTA 超流速琼脂糖
5-10 mg/ml
最小的 Ni 2+ 浸出
与 20mM b -ME 相容
高流速和压力
小量到生产级
FPLC 或重力流柱
推荐用于真核抽提物
His.Bind Resin
无 Ni 的 IDA 琼脂糖
8 mg/ml
可重复使用多次
与 His.Bind 缓冲试剂盒兼容
小到中量
重力流柱或批量模式
His.Bind Cloumn
带 Ni 的 IDA 琼脂糖
1.25 预装柱
10 mg/ 次
预装柱
与 His.Bind Quick 缓冲试剂盒兼容
方便的纯化
重力流柱
His.Bind Fractogel (S)
无 Ni
IDA 触须
甲酰化
>10 mg/ml
20 -40 m M 颗粒大小
高流速和压力
小量到生产级
FPLC 或重力流柱
高分辨率分离
His.Bind Fractogel (M)
无 Ni
IDA 触须
甲酰化
>10 mg/ml
40 -90 m M 颗粒大小
高流速和压力
小量到生产级
FPLC 或重力流柱
His.Bind Quick 300 Cartridge
带 Ni 的 IDA 纤维素
预装筒
0.5 mg/ 次
每端锁紧接口
与 His.Bind Quick 缓冲试剂盒兼容
注射器操作
真空多支管操作
快速纯化
His.Bind Quick 900 Cartridge
带 Ni 的 IDA 纤维素
预装筒
2 mg/ 次
每端锁紧接口
与 His.Bind Quick 缓冲试剂盒兼容
注射器操作
真空多支管操作
快速纯化
His.Bind Quick Cloumn
带 Ni 的 IDA 纤维素
预装柱
5 mg/ 次
每端锁紧接口
与 His.Bind Quick 缓冲试剂盒兼容
真空多支管操作
快速纯化多个样品
His.Bind Magnetic Agarose Beads
带 Ni 的 IDA 磁性琼脂糖
5 mg/ml
3 m 磁性琼脂糖珠
快速小量纯化
磁性分离
高通量操作
注：与任何纯化填料一样， His.Bind 树脂在接近结合载量时使用，可获得最好的分离效果
His.Bind 纯化试剂盒
NTA 和 IDA 化学基团
His.Tag /His.Bind 技术是根据与 His.Tag 序列相邻组氨酸和固定化金属离子（通常为 Ni 2+ ）的亲和力来进行纯化。金属离子被螯合到固相支持物共价结合的反应性基团上。最常用的螯合物包括氮川乙酸（ NTA ）和亚氨二乙酸（ IDA ），它们分别具有四个和三个与金属离子相互作用的位点。在天然和变性条件下，这两种化学基团为亲和填料和目标蛋白的结合、洗涤和洗脱条件提供了不同特性。实际应用中， NTA 的额外螯合位点使纯化过程中金属浸出最小，并与还原二硫键的 20mM b - 巯基乙醇相容。而存在其它螯合或还原成分时， IDA 树脂的高金属浸出率可导致纯化结果不甚理想；然而 IDA 填料具有可循环使用多次并不损失性能的优点。对于每种填料系统，可改变条件以优化特定系统表达的目标蛋白的纯化。通常做法是调整天然条件下洗涤和洗脱缓冲液的咪唑浓度，尽量减少非特异结合蛋白的共纯化。
His.Bind 柱
为了方便使用， His.Bind 柱预装了 1.25ml 柱床体积的 Ni 2+ 结合 His.Bind 树脂。柱子顶部和底部的特殊设计 (frit) 可以确保上样和走柱时缓冲液均匀流动，干扰最小。配合使用 BugBuster 和 Benzonase 核酸酶制备的细菌裂解物可获得较好效果。
His.Bind 和 His.Bind 快速缓冲液试剂盒
His.Bind 缓冲液试剂盒是一套经过预测试的缓冲液，用于 IDA 的 His.Bind 树脂金属螯合层析方便快速地一步纯化蛋白。试剂盒提供的溶液可用于 10 根 2.5ml 柱的 Ni 2+ 螯合、蛋白结合、洗涤和洗脱。除了不包括 8X Ni 2+ 结合缓冲液， His.Bind 快速缓冲液试剂盒与 His.Bind 缓冲液试剂盒的组分完全相同。（填料树脂以 Ni 2+ 结合形式提供）
Ni-NTA 缓冲液试剂盒
Ni-NTA 缓冲液试剂盒提供了一套方便的缓冲液，优化用于在Ni-NTA His.Bind 树脂上纯化 His.Tag 融合蛋白。这些磷酸缓冲液与His.Bind 缓冲液试剂盒中的基于 Tris 的溶液不同。试剂盒中提供了经过精细制备的 4X 浓缩液，用于特定的结合、洗涤和洗脱程序。
BugBuster Ni-NTA His.Bind 和 His.Bind 纯化试剂盒
BugBuster 蛋白抽提试剂是从大肠杆菌有效抽提可溶性蛋白的即用型溶液，避免了机械破碎操作。 BugBuster Ni-NTA His.Bind 和 His.Bind 纯化试剂盒整合了 BugBuster 试剂和用于方便制备可溶性细胞抽提物以及 His.Tag 融合蛋白亲和纯化的相应树脂。两个试剂盒都包括 Benzonase 核酸酶，用于降低粘度和 / 或从蛋白制备物中去除核酸。 BugBuster His.Bind 纯化试剂盒还包括层析缓冲液。
参考资料：www.pufei.com
RNA提取一般步骤总结
. ^2 ^. g# N1 eWRNA提取原理：
/ |# K0 K. @9 W. | 通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。
0 T3 z( F&_, D6 c% ^" h6 Y A6 _RNA提取的一般步骤
- O: Y+ x$ p# s8 U4 M9 S 所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。( O( g^+ K) f+ i&]% P
实验步骤：
* l&d6 s5 e( q1 F( g2 | j, ^0 s 破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。6 D8 }. QY, g* X
1、 破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。
" s% f, `0 [1 d* m! ]0 e2、 分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。
&X. P) i) YL# u/ [3、 沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。2 @0 d&z7 ?+ i, g1 @
4、 洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。
3 @% V" o9 v+ I1 J2 o9 k" z5、 融解RNA一般使用TE。
L5 f. n6 }( S1 t% Z&J6、 保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g离心5分钟。
&P3 [7 m* ^$ U$ _" ?
: F" x u* N( ?( I氯化锂法提取总RNA：
" u}' I! r' ^' ^&l 本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片断丢失的缺陷。# ~* S: }9 `* r4 Z3 P
试验试剂：
" d$ r6 Q+ _. I8 Q1、 氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，过滤灭菌】
7 _8 w1 t" o9 a' q! i4 Z2、 悬浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】
! m8 Q4 R, ]&y: b# `7 d试验步骤：7 [6 ?$ `* }o7 _ Z' {
1、 对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5－10ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中。&Y) b: E, Q" l/ ^ Q: \$ s
2、 匀桨液在0－4℃放置4小时后，12000g离心30分钟。 x- C6 D- N/ N0 K! t2 a
3、 取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液，重复步骤2。
) y- x) S0 K9 y6 j, e4、 沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15－30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟。
3 d2 v' i1 ~( ~* D5、 取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心。
L4 a' Q4 u" l: a* K% Z$ ?( e6、 70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。3 }r0 [/ Q' G9 q
7、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。
0 f. X% R( H% B7 g
! y7 j5 u$ C' |) [% ~! J3 D: Q蛋白酶－热酚法6 |" ^0 b* [) P3 S* c4 b4 H4 l
本方法适合于病毒RNA的提取
* I( i+ b# r! K试验试剂：
$ ?4 [7 H9 `) J1、 蛋白酶K（终浓度50ug/ml）, J5 p l6 V/ t7 [/ I
2、 2×缓冲液：1%SDS? 20mMTris-HCL (pH 7.6)? 0.2MnaCL9 h, p ] y+ \$ Z) O
试验步骤：# W3 v8 G1 [$ ]5 y
1、 提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,37℃40-50分钟。
- K0 p/ E' G0 M# Q- z7 n, {# d2、 加入等体积65℃预热的酚溶液，轻徭,在65℃保温5分钟后再轻徭。
w! `W( ~, E: i3 ^3、 离心，取上清，氯仿抽提一次。, |( Z0 dj2 @7 m+ d2 Q&x H
4、 取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心(10000g,10min)。
7 [/ w, h2 d6 U$ k5、 70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。
% A5 Y{( w% ]3 a* y, O e) P6、 RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。植物RNA提取过程中难点的相应对策
植物RNA提取过程中难点的相应对策
) o5 B7 d/ Q3 _酚类化合物的干扰及对策：
a9 D* Z3 K ?7 W 许多植物组织特别是植物的果实（如苹果、樱桃、李子、葡萄等）和树木类植物中富含酚类化合物。酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。因而从幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，针叶类植物的针叶中多酚的含量比在落叶植物的叶子中要高得多。在植物材料匀浆时，酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应（browning effect）。被氧化的酚类化合物（如醌类）能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化。但Newbury等发现RNA提取的难易程度与材料中酚类物质的总量之间并无相关性，因此认为不是所有的酚类化合物都影响RNA的提取。但一般认为所谓的“缩合鞣质”即聚合多羟基黄酮醇类物质（如原花色素类物质）是影响RNA提取的一类化合物。目前去除酚类化合物的一般途径是在提取的初始阶段防止其被氧化，然后再将其与RNA分开。9 b0 S! }0 U6 |9 k/ l! v" v g1 ~/ @
防止酚类化合物被氧化的方法：
" vy, a4 k7 n/ Z1、 还原剂法：一般在提取缓冲液中加入(-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸来防止酚类物质被氧化，有时提取液中(-巯基乙醇的浓度可高达2％。(-巯基乙醇等还可以打断多酚氧化酶的二硫键而使之失活。Su等认为在过夜沉淀RNA时加入(-巯基乙醇（终浓度1％）可以防止在此过程中酚类化合物的氧化。硼氢化钠（NaBH4）是一种可还原醌的还原剂，用它处理后提取缓冲液的褐色可被消减，醌类化合物可被还原成多酚化合物。
&H. z. p+ ~&t% t5 G&G1 M- P/ q! u2、 螯合剂法：螯合剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO－N＝基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强。原花色素类物质中含有许多芳环上的羟基，因而可以与PVP或不溶性的PVPP形成稳定的复合物，使原花色素类物质不能成为多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步骤中被除去。用PVP去除多酚时pH值是一个重要的影响因素，在pH8.0以上时PVP结合多酚的能力会迅速降低〔11〕。当原花色素类物质量较大时，单独使用PVPP无法去除所有的这类化合物，因而需要与其它方法结合使用。
p% N0 w/ t7 r3、 Tris-硼酸法：如果提取缓冲液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以与酚类化合物依*氢键形成复合物，从而抑制了酚类物质的氧化及其与RNA的结合。这一方法十分有效，所以Lбpez-Gбmez等在提取缓冲液中不再加入其它还原剂。但如果Tris-硼酸浓度过高（＞0.2M）则会影响RNA的回收率。
# p8 ]0 ^8 K3 a4、 牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原－抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与RNA结合的机会，因此提高了RNA的产量。BSA与PVPP结合使用提取效果会更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用时要加入肝素以抑制RNase的活性。) ~# H/ y( P7 Q) j4 G* w1 G8 l
5、 丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料，可以有效地从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA。 @+ ?- X/ V9 z8 T8 H: B3 C! W' C
酚类化合物的去除 ：
&z# h) G0 H&]$ I1 N" f. l9 N 通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。与PVP、不溶性PVPP或BSA结合的多酚，可以直接通过离心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提时除去。Manning利用高浓度的2-丁氧乙醇（50％）来沉淀RNA，而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50％ 2-丁氧乙醇的缓冲液洗涤RNA沉淀以去除残留的多酚。他认为即使多酚被氧化，其氧化产物仍可以溶解在高浓度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，无需再用NaBH4来处理。5 C6 Y8 a1 S V: `2 ~
多糖的干扰及对策：6 I- b3 R4 ~$ T&O
多糖的污染是提取植物RNA时常遇到的另一个棘手的问题。植物组织中往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与RNA很相似，因此很难将它们分开。在去除多糖的同时RNA也被裹携走了，造成RNA产量的减少；而在沉淀RNA时，也产生多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液。由于多糖可以抑制许多酶的活性，因此污染了多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。在常规的方法中，通过SDS-盐酸胍处理可以部分去除一些多糖；在高浓度Na+或K+离子存在条件下，通过苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通过LiCl沉淀RNA也可以将部分多糖留在上清液中。但即使通过这些步骤仍会发现有相当多的多糖与RNA混杂在一起，所以还需要用更有效的方法来解决植物RNA分离纯化时多糖污染的问题。
7 [' X/ e, d8 x( B- p( |9 C&n 用低浓度乙醇沉淀多糖是一个去除多糖效果较好的方法。在RNA提取液或溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度10％～30％，可以使多糖沉淀下来，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的匀浆液中加入乙醇，如Lewinsohn等在从裸子植物的木质茎中提取RNA时，在匀浆上清液中加入乙醇至终浓度10％以沉淀多糖。但Tesniere等在从葡萄浆果组织中提取RNA时，是在用CsCl超离心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入终浓度30％乙醇来沉淀多糖的，进一步纯化了RNA样品。
! i5 b5 m* z9 G8 M4 ~- N/ D 另一个常用的方法是醋酸钾沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉组织的RNA时在匀浆上清液中加入1/3体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液以沉淀多糖；Ainsworth在提取酸模植物花组织的RNA时加入的是1/5体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液。Hughes等在提取棉花叶和花粉的RNA时是加1/3体积的8.5M醋酸钾（pH6.5）溶液到匀浆液中以除去多糖等杂质。在提取某些植物材料的RNA时，是将上述两种方法结合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA时，是在匀浆液中加入0.25体积的无水乙醇和0.11体积的5M醋酸钾溶液以去除多糖杂质。Su等在去除褐藻的多糖时，单独使用乙醇或醋酸钾都无效，只有两者结合使用效果最佳。
6 c9 |5 q1 b9 [5 l1 s+ n Fang等认为缓冲液中含有高浓度的NaCl有助于去除多糖。Chang等在提取松树RNA时，缓冲液中NaCl的浓度为2.0M和1.0M，通过氯仿抽提和乙醇沉淀RNA将RNA与多糖分离。Manning是将胡萝卜种子等材料苯酚提取后的上清液稀释，调节Na+离子浓度至80mM，然后加入0.4体积的2-丁氧乙醇来沉淀去除多糖。3 B1 h# M' {+ {0 U% U, K2 @, v
蛋白杂质的影响及对策：$ @- G5 o( f1 s9 _2 V* G2 n/ ^
蛋白质是污染RNA样品的又一个重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦属于蛋白质，因而要获得完整的、高质量的RNA就必须有效地去除蛋白杂质。常规的方法是在冷冻的条件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取缓冲液中含有蛋白质变性剂，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等，这样在匀浆时可以使蛋白质变性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K来降解蛋白杂质。进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质。' T7 v( F1 J9 @+ E
Wilcockson利用蛋白质与RNA在高氯酸钠溶液中的溶解度不同将它们分离。在70％高氯酸钠溶液中，RNA的溶解度大于蛋白质的溶解度，因而将大部分蛋白质沉淀下来。接着在离心上清液中加入两倍体积的无水乙醇，这时RNA能沉淀下来而能溶于70％高氯酸钠溶液中的残留蛋白质仍然留在上清液中。这样可以除去绝大部分的蛋白质。
3 q e/ \* I" A&@次级代谢产物的影响及对策：: N3 |) N f K# np' f6 h0 J2 A0 {
从植物组织中提取高质量RNA的另一个难点是许多高等植物组织尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物，这些次级代谢产物很容易与RNA结合并与RNA共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的RNA的分离。因不能确定这些次级产物具体是什么物质，所以，目前还没有什么特殊的方法来解决这个问题。Baker等综合Hughes等的选择性沉淀法、Chirgwin的氯化铯梯度离心法和Iversen等的RNA回收方法纯化了松树种子、成熟松树针叶等植物组织的RNA。( M s5 O% f! H- Q* \( m" `( }
由于植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性，使得植物组织RNA的提取相对于其它生物材料来说要困难的多。实践中经常会发现，即使同一种植物的不同组织其RNA提取方法会有很大的不同；含有某种干扰因素的不同植物材料，其适用的RNA提取方法可能不同；即使是同一种植物同一种组织材料，但来源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一样。所以，对于某一植物或其组织来说，其相应的RNA提取方法必需经过摸索和实践才能确立。# S0 a# G7 L3 S&A
随着植物分子生物学研究领域的拓宽，可以肯定地说，在作为其研究基础的植物材料RNA提取过程中还会出现新的难点，但随着不断地探索和经验的积累，科学工作者们一定会迅速地解决这些难点，为植物分子生物学的发展铺平道路。植物RNA提取中的一些特殊方法
植物RNA提取中的一些特殊方法
$ e* [2 U( E% h' [多酚类植物的RNA提取：! j! d, ]2 V( R! B&o
苹果棉花等多酚类植物提取RNA用TRIZOL一般提不出来。这个方法是验证过有效的,提取的RNA纯度不是特别高,但是用作northern足够。6 j&d2 u( \6 W8 _&o4 E1 X1 t
实验试剂：
# s7 s8 H! R# W1 y# g提取buffer 200ml：NaCl 1.1688g 100mM Tris 2.4228g 10mM (tris-HCl 8.0) EDTA 5.8450g 10mM SDS 2.0000g 1% NaOH调至8.0,定至200ml,加200ulDEPC融解.* j) st2 @) t4 W' F
试验步骤：
! T a0 I* C( w5 S" E* A' W1、 1.5ml离心管用液N2冷冻吼加入0.1g样品,立即加入500ul酚氯仿,再加入500ul提取buffer,剧烈振荡1-2min,冰上放置5min。" F3 S0 V5 @0 s7 i1 T
2、 4度12000rpm离心15min, 上清转入新管,加氯仿异戊醇抽提一次。) H' L7 d# d" y8 @
3、 取600ul异丙醇,-20度沉淀20min.
&w: m2 r: I4 \4 l# J4、 12000rpm离心10min。
! I. Y. \8 b7 A5、 沉淀用70度乙醇洗。
k! T. D1 [0 w+ ?) _0 D5 ?6、 8000rpm 5min。
" Ay# }' F( `5 }6 I+ N! x7、 沉淀晾干,溶于30ulDEPC水。^0 Q- R+ `5 j( n' [' m9 M
# m/ r3 o2 O! T6 z$ `1 m&e. ^
银杏等木本裸子植物的RNA提取方法：&A i&V! H0 ` ?6 R
银杏、香机等木本裸子植物，酚类和多糖等次生物质含量较多，对RNA的分离和纯化有很大干扰，严重影响了提取RNA的质量和产量，给相关的分子生物学实验的进行带来阻碍。目前，RNA的提取方法很多，采取常规的Trizol试剂盒、SDS等方法不能提取银杏RNA，而Shujun Chang等(1993)的CTAB法，提取RNA质量也较差，降解也十分严重。对其提取步骤进行改进，得到质量较高的银杏RNA样品。/ s4 i* V k8 S) x
试验试剂：! ]! M( q# E7 N3 t`# i. m( [
1、 1M tris:1 2.11g T ris，溶于60m L水中，用浓盐酸调至Ph8 .0，定容至lOO mL.用灭菌的DEPC水溶解。
`4 c9 {) p2 \4 t2、 500m M EDTA:1 8.61g E DTA "H 2O加入80m L水中，搅拌溶解，用NaOH调pH至8.0，定容至100mL。V# x* j! H4 y! G4 M# q3 c5 P
3、 10 mol/LLiCL: 42.4 gLiCL, 100mL水溶解即可。9 i) @ a' \&w+ c p* g
4、 提取缓冲液(DEPC水处理):2% CTAB（蛋白质变性剂）.2% PVPK 30（去除多酚类物质）10 0m M Tris-HCL (Ph8.0)25 m M EDTA（金属鳌合剂）2.0 M NaCL（去除多糖和CTAB）配法:2 g CTAB, 2 g PVP, 10 mL 1 mol/L tris, 5mL 500 mM EDTA, 11.7gNaCL,定容到100mL。) o+ \5 E! XO# A( M+ P8 H* K9 n0 q
5、 亚精胺(提取时加少量)（RNA酶抑制剂）
# J9 g6 O/ h( u' d6、 4%0一疏基乙醇(提取时加)（去除多酚类物质）' D e, d( J. K$ z! O9 f
7、 氯仿异戊醇(24: 1)（抽提蛋白质）) U) A+ ]4 \# Q
8、 10 MLiCL（沉淀大分子RNA）
7 M+ b) g4 J4 m5 C0 f- \9、 SSTE（溶解RNA）1.0 M NaCL 0. 5%SDS 1m MEDTA(PH8.0) 10 m MTrisHCL(pH8 ）配法:2.9 g NaCL, 0.25 g SDS, 0.5 mL 1 M tris, 100 u L 500 mM EDTA, pH8.0,定容至50 mL。. m5 z+ J3 X0 V&\6 e7 Y# R
试验准备：_5 z9 }" f% q6 t
1、 研钵和玻璃器皿用锡纸包好，200℃以上向温烘烤2小时以上，或180*C 高温烘烤4小时。X7 n3 w, W2 }9 M
2、 塑料制品(枪头和离心管)最好用新的，并且用报纸包好，121'C高压灭菌，灭菌40 min，或连续两次121'C高压灭菌，每次灭菌20 min，然后用烘箱烘千。
X* f+ ~, v7 }. a3、 所有溶液配制好后，加DEPC水使DEPC uJ浓度为0.1%, 37℃过夜，1211C高压灭菌40 min.(其中Tris因为不能用DEPC处理，所以Tris用DEPC处理的水溶液灭菌后配制。)
) x&B, {% e" ^&F: s0 q试验步骤：" Y6 U+ `2 C* \4 X2 a# r
【根据文献(Shujun Chang, 1993) CTAB法，稍作改进。】
F ^+ e9 I# h/ Q7 m* A* ]1、 将4mL提取液加入到lOmL离心管c卜650C水域加热。$ D+ ?4 w7 \3 J: w, M
2、 用液氮冷却研钵，在研钵中加入少量的抗氧化剂PVP，取1g低温冷冻的银杏叶片，迅速置于研钵中，不时加入液氮以防止研磨过程中叶片融化，充分研磨后，立即加入到预热好的提取缓冲液中，用手摇功混匀。6 C4 i+ L/ Z* C5 G) v
3、 65℃，水域1 min后冷却至室温。
( N2 @) U: S, {9 M" e8 f4、 加入等体积(4mL)的氯仿:异戊X17 (2=L: 1)，混匀，10000rpm, 40C，离心10 min。
( H6 P o1 y8 p# ?5、 小心吸取上清液，加入等体积(4mL)的仿:异戊醇(24: 1),混匀，10000rpm, 40C,离心10 min。. {# k/ z5 r: x: v1 x
6、 吸取上清液，加1/4体积的IOMLiCL,混合，4℃沉淀过夜，然后10000rpm离心20 min。
7 x P4 o6 z1 D! [8 }7、 用枪吸干，用500u L SSTE溶解沉淀，转到1.5m L离心管.加等体积氯仿:异戊醇混匀，10000rpm, 40C，离心10 min。
, H2 b7 C1 d* [6 r4 c8、 离心吸取取上清液，加两倍体积的无水乙醉，-70℃沉淀至少30 min，或一200C下沉淀2 h。" W* c' Y1 P- t5 K) ^, `
9、 12000rpm, 40C,离心20 min，去上请用70%的乙醇洗两次，吹干沉淀。1 x, S* X0 V" y6 F/ l
10、 用40 u LDEPC处理的水溶解沉淀，得到RNA样品。8 f2 C- S4 R3 O9 R4 T e&{
11、 除用于电泳和紫外检测外，其余RNA-70℃冰箱保存备用。
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! U* X1 m5 G9 A( W% U改良Krapp提取法：
1 r) r# s3 ~ |. q1 v. w试验试剂：
' C7 Z1 ^) J5 A&f&W( K d1、 RNA抽提掖：母液：4mol 异硫氰酸胍 20mmol EDTA 20mmol MES pH 7.0。工作液：取400ml母液加入1.7ml 2-ME贮存在4℃条件下备用。/ a. I$ E. R S% z
2、 RNA重悬液：2mol LiCl 10mmol NaAc调整终体积为250ml，pH 5.2，灭菌后贮存在4℃条件下备用。2 uJ1 S9 V8 a. j
试验步骤：
) O/ o, L# q- D8 v) U1、 取新鲜植物材料0.5~1g，冷冻干燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨，然后加入 10ml RNA抽提掖充分混匀。7 n Q: B" S N9 B! J$ u
2、 4℃条件下8000rpm离心10min，将上层水相转移至一干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿抽提掖，在4℃条件下8000rpm离心10min。
1 N: K+ ]3 R" a7 `3、 上清液转移至一干净离心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次（加入10ml氯仿充分混匀后，在4℃条件下8000rpm离心10min.）。
$ p+ y, P/ ^- w/ E' g" k0 y: [4、 小心将上清液转移至另一干净离心管中，加入1/10 vol 3mol NaAc和2 vol冷无水乙醇，在-80℃条件下沉淀2小时。: t&M8 O1 O! C- w5 a
5、 在4℃条件下8500rpm离心30min.，小心弃去上清液，沉淀重悬于RNA重悬液中，置于4℃条件下1小时。9 b7 Z# K4 v( y% l8 Q0 a8 N) I% |
6、 4℃条件下8500rpm离心10min.，弃去上清液，沉淀溶于适当体积的DEOC处理水中。检测后分装，置于-70℃条件下保存。
