经DEAE和凝胶柱之后得到的多糖，用苯酚硫酸法测糖含量好低啊，是纯化后的多糖不适用苯酚-硫酸法测纯度？
鉴定多糖（参考资料）： 1.苯酚-硫酸法 需要多糖的纯品和特定的酶 2.蒽酮-硫酸法 多糖在浓硫酸水合产生的高温下迅速水解，产生单糖，单糖在强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物。在波长490nm左右处和一定浓度范围内
离子交换纯化多糖使用什么方法检测收集
鉴定多糖（参考资料）：
1.苯酚-硫酸法 需要多糖的纯品和特定的酶
2.蒽酮-硫酸法 多糖在浓硫酸水合产生的高温下迅速水解，产生单糖，单糖在强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物。在波长490nm左右处和一定浓度范围内，该衍生物的吸收值与单糖浓度呈线性关系，从而可用比色法测定其含量，所用的单糖对照品尽量采用与其多糖组成一致或为含量较高的单糖，这样测得的值较准确。
3.3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法） 在碱性条件下显色，较准确测定还原糖与总糖的含量从而求出多糖的含量，可消除还原性杂质的干扰。
多糖的分离纯化
在多糖提取物中，常会有无机盐、蛋白质、色素及小分子物质等杂质，必须分别除去．一般是先脱除非多糖组分，再对多糖组分进行分级．
2．1 除蛋白：除蛋白质时一般选择能使蛋白质沉淀而不使多糖沉淀的试剂来处理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等。但必须处理时间短，温度低，避免多糖降解。Sevage法（氯仿：戊醇/丁醇=4：1）和三氟三氯乙烷法在避免降解上有较好效果但要达到除尽游离蛋白质的目的仍需反复处理。如能加入蛋白质水解酶，使蛋白质大分子进行一定程度的降解，再用Sevage法处理，一般效果更好。
为了避免使用有机溶剂也可采用反复冻融的方法除蛋白，将多糖液浓缩后，一20℃室温反复冻融7～8次，离心除去蛋白质。另外，蛋白质在等电点时溶解度最小，用氢氧化钙饱和液调pH10～pH11可除去偏碱性的蛋白质，然后再用硫酸调pH5～pH6，可除去偏酸性的蛋白质。冻融和等电点沉淀除蛋白质操作简单，但多糖液里往往有低浓度的蛋白质残留，应与其它方法结合使用。
2．2 脱色：植物多糖提取物中含有酚类化合物而使其颜色较深，可用吸附剂(纤维素、硅藻土、活性炭等)、离子交换柱(DEAE一纤维素)、氧化剂(H2O2)等脱除。活性炭比表面积大，吸附能力强，在进行当归多糖的提取时只向多糖液中加入了0．1％左右的活性炭，煮沸后滤过即完成了脱色操作。此法成本低廉，适合工业化生产。
2．3 除小分子杂质
小分子杂质如低聚寡糖的残留往往影响多糖的生物活性，需要进一步脱除，提高纯度。传统的方法是透析法，该法操作简单、技术成熟，但周期长，往往需要2一3天，常温下操作有可能造成多糖的霉变，必要时需加入少量防腐剂或需在低温条件下进行。随着膜分离技术的发展，纤维滤器透析法已经发展起来了，它利用不同孔径的膜使大小不同的分子分级，这种方式可缩短生产周期，而且条件温和，无疑是多糖脱除杂质的一条新途径。
2．4 多糖的分级纯化
采用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物，分级的方法可达到纯化的目的．可按溶解性不同进行分级、按分子大小和形状分级(如分级沉淀、超滤、分子筛、层析等)，也可按分子所带基团的性质分级．
2．4．1按溶解性不同分离
2.4.1.1分步沉淀法
分步沉淀法是根据不同多糖在不同浓度低级醇、酮中具有不同溶解度的性质，从小到大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮进行分步沉淀．
2.4.1.2 盐析法
盐析法是根据不同多糖在不同盐浓度中溶解度不同而将其分离的一种方法。常用的盐析剂有氯化钠、氯化钾、硫酸铵等，其中以硫酸铵最佳。
2.4.2 按电离性质不同分离
2.4.2.1季胺盐沉淀法
季胺氢氧化物是一类乳化剂，能与酸性多糖形成不溶性化合物季铵络合物，此络合物在低离子强度的水溶液中不溶解而产生沉淀。若提高多糖液pH值或加入硼砂缓冲液，也可使中性多糖沉淀分离。常用季铵盐有十六烷基三甲基季铵盐的溴化物及其氢氧化物和十六烷基吡啶。
2．4．3 柱层析法
2.4.3.1凝胶柱层析法
凝胶柱层析法常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼脂糖凝胶(Sepharose)，以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂，从而使不同大小的多糖分子得到分离纯化，但不适宜粘多糖的分离。
2.4.3.2纤维素阴离子交换剂柱层析法
纤维素阴离子交换剂柱层析法常用的交换剂为DEAE一纤维素和ECTEOLA一纤维素，分类硼砂型和碱型两种，洗脱剂可用不同浓度碱溶液、硼砂溶液、盐溶液，其优点可吸附杂质、纯化多糖，并适用于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。如百合多糖、北沙参多糖、太子参多糖等。
2.4.3.3 活性炭柱层析法
活性炭吸附量大、效率高，是分离水溶性物质的常用吸附剂。柱层析时活性炭中常拌入等量的硅藻土作稀释剂，以增加溶液的流速。糖溶液上柱后先用水洗脱无机盐、单糖等再依次增加乙醇浓度进行洗脱。
2.4.3.4 离子交换柱层析和普通凝胶柱层析联用法
有些植物的多糖成分复杂， 除中性多糖外，还含有糖醛酸等，因此往往两种不同性质的色谱柱联用才能得到单一多糖组分。
2.4.3.5 三种层析柱联用
采用离子交换葡聚糖凝胶柱、丙烯葡聚糖凝胶柱和葡聚糖凝胶柱三者联用，即先进行DEAE—SephadexA柱层析，用蒸馏水洗脱。水洗组分进一步用SephacrylS柱层析，得到主要组分再用SephadexG一100柱层析，有时会有较高的得率。
三、多糖的纯度鉴定
经过分级纯化的多糖在测定结构前须进行纯度鉴定．而且多糖的纯度不能用通常化合物的纯度标准来衡量，因为即便是多糖纯品，其微观也并不均一，仅代表相似链长的多糖分子的平均分布，通常所谓的多糖纯品也只是一定相对分子质量范围的多糖的均一组分．目前常用于多糖纯度的鉴定方法有：高效液相、 凝胶层析法、电泳法、色谱法、旋光度法等．
多糖的单糖组分的鉴定称取多糖粗品8 mg，用2 mL浓度为1 mol／L硫酸100*C水解6 h。饱和Ba(OH)2中和至中性，抽滤，取滤液，浓缩，毛细管点样，薄层层析法分析。采用硅胶G板105"(2活化2 h后使用。标准糖分别为D一半乳糖，D一葡萄糖，D一甘露糖，L一山梨糖、L一阿拉伯糖。展开剂为正丁醇一冰醋酸一水(4：1：5)(体积比)。用AgNO3一NaOH 溶液显色。
检查纯度最常用的判断方法：
（1）用gc、hpLc测定组成多糖的单糖的摩尔比是否恒定。
用不同的柱型测定结果更为可靠。
（2）电泳只出现一条带。
如可用聚丙烯酰胺凝胶电泳、乙酸纤维素薄膜电泳及玻璃纤维纸电泳。对于中性多糖可采用高压电泳，以硼酸盐为缓冲液，可增大其迁移速度。
（3）凝胶柱层析图呈现对称的单峰。若有“拖尾”现象，说明其均一性不够好。阴离子交换层析纯化
用DeAe一纤维素52(2.6x100cm)柱层析,0.lmol/Lnacl洗脱,流速6ml/h,按2ml一管分部收集,苯酚一硫酸法逐管检测,绘制收集体积与糖含量之间的关系曲线。看是否有单一对称峰。
按照Ye等报道,采用DeAe一52一纤维素交换柱层析法(2.6x30cm)对鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖进行初步分离。DeAe一纤维素凝胶预处理:称取DeAe一52一纤维素凝胶干粉,加入约10倍体积质量比(ml/g)的0.5mol/Lna0h溶液浸泡30分钟,倒出上清液,用大量去离子水反复浸洗至ph值近中性再用相同体积的0.5mol/LhcI溶液浸泡30分钟,倒出上清液,用大量去离子水反复浸洗至ph值近中性最后用相同体积的0.5mol/lnaoh溶液再浸泡30分钟,用大量去离子水反复浸洗至ph值中性。处理完毕后,进行湿法装柱,用去离子水0.5mol/Lnacl溶液,去离子水依次分别平衡(流速1.0ml/min)2一3个柱体积备用.
糖样100mg溶于5ml的去离子水中,离心除去不溶物,上样于DeAe一52一纤维素阴离子
-1层析柱(2.6x30cm,cl型),分别采用去离子水0.1和0.3mol/LnacI溶液进行分段梯度洗脱,
流速1.0ml/min,自动收集器分部收集(10ml/管),每梯度20管。用硫酸一苯酚法跟踪检测各管多糖含量(490nm处吸收值),以收集的管数为横坐标。吸光值(490nm)为纵坐标绘制DeAe一52一纤维素色谱柱洗脱曲线。依据洗脱峰型,合并相同组分,50℃旋转蒸发浓缩,对去离子水透析48h以去除nacI及小分子杂质,最后将透析内液冷冻干燥,得初步纯化产品。
初步纯化多糖得率计算公式:
多糖得率(%)=纯化多糖质量/粗多糖质量x100%
葡聚糖凝胶层析纯化
采用sephadexg-100凝胶层析法对DeAe-52一纤维素初步纯化的不同组分的多糖样品进一步纯化。葡聚糖凝胶(sephadexg一100)的预处理:称取sephadexg一100凝胶干粉,加入30倍体积质量比(ml/g)的去离子水,沸水浴5小时使其溶胀。冷却后用去离子水反复浸洗,减压脱气后进行湿法装柱,用0.1mna2so4溶液平衡(流速0.25ml/min)2一3个柱体积备用。
分别称取经DeAe一纤维素一52初步纯化的各多糖组分样品20mg,溶于2ml0.1mna2so4溶液中,上样于sephadexg一100层析柱(2.6x60cm)用0.1mna2so4溶液溶液洗脱,流速0.25ml/min,分步收集(5ml/管)。
用硫酸一苯酚法跟踪检测各管多糖含量(490nm处吸收值),以收集的管数为横坐标。吸光值(490nm)为纵坐标绘制sephadexg一100色谱柱洗脱曲线。依据洗脱峰型,合并相同组分,50℃旋转蒸发浓缩,对去离子水透析48h以去除na2so4及小分子杂质,最后将透析内液冷冻干燥,得不同纯化产品。
纯化多糖得率计算公式:
纯化多糖得率(%)=纯化多糖质量/粗多糖质量x100%
（鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖）
（4）纸层析法呈单一集中斑点。
取0.5%的多糖样品溶液50ul,点样于新华中速滤纸(3cmx20cm)距端点1cm处的中部,以正丁醇:浓氨水:水(4o:50:5)为展开剂,饱和2小时以上,在室温下展开6h,取出吹干,用0.5%甲苯胺蓝液染色,立即用95%乙醇漂洗至背景褪色,看是否只有一个清晰的斑点。
（5）琼脂糖(Agarose)凝胶电泳法
在琼脂糖板(厚度为0.2cm)上点样3一5ul采用浓度为0.075mol/L,ph8.6的巴比妥缓冲液,电泳1-1.5h,电压为64一80V,甲苯胺蓝(浓度为1%)染色,醋酸乙醇混合溶液(醋酸:乙醇:水=0.1:5:5)脱色。多糖纯品经电泳展开后,看是否呈现单一斑点,斑点是否清晰。
（6）紫外分光光度法
将多糖pwZ加0.9%nacI溶液溶解,配成浓度为1mg/ml的溶液,采用uV一16oA紫外可见光谱仪扫描(200nm一30onm)观察260nm、280nm处是否有吸收峰。
多糖的分子量测定：
过去用超速离心沉降法、光散射法、渗透压法、粘度法(:多糖质谱鉴定)等，这些方法操作复杂且误差较大，现已少用。现在较常用的方法有凝胶过滤法和高效凝胶液相色谱法，这两种方法须先用已知分子量的标准多糖对照测定样品的分子量。
一般来说，多糖结构分析包括以下几点：
（1）单糖组成分析：研究确定单糖的种类及摩尔比；
完全酸水解后用高效液相色谱方法(hpLc)或气相色谱方法测定。
（2）糖苷键类型：研究确定糖苷键及支链点连接位置；
甲基化分析方法
高碘酸氧化法与smith降解法
（3）糖环大小：研究确定糖苷键为呋喃糖或吡喃糖；
红外光谱
（4）异头碳构型：研究确定糖苷残基的a-或p-构型；
2DnmR.(TwodimensionalnuclearmagneticResonance)光谱分析方法测
（5）确定单糖残基和重复单元的序列
甲基化分析方法与磁共振光谱分析方法结合分析，一般会参考多糖的单糖组成及摩尔比信息以利于解析多糖结构。
高碘酸氧化法
薄层层析(TLc)——定性，
气相色谱法
（6）取代基团位点：研究0h-修饰基团的种类和取代位点，如0-磷酸化，乙丑基取代，0-
硫酷化等；
比色分析方法
（7）多糖分子量分布的研究。
紫外光谱
定性与定量方法
薄层层析：残基定性
气相色谱：残基定量
气质联用：残基定量
高效阴离子色谱法：残基定量
鉴定结构常用物理化学方法：
高效液相色谱:确定单糖组分和相对分子量
红外光谱分析:测定多糖的官能团，不仅可以检测酮糖、酵糖的耻喃糖环或呋喃糖环的构象和糖苷键的构型
核磁共振:α-构型与β-构型残基的比例；判断异头碳构型；推断主链和支链连接键型鉴定结构复合方法：
甲基化分析:推断出多糖样品中糖基的连接方式及各种连接键型的比例
高碘酸氧化法与smith降解法:判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度及支链多糖的分支数目
糖睛乙酸酷衍生物的气相色谱法:单糖组成和摩尔比
各种多糖化学结构鉴定方法的具体实施方案
1、酸水解
（1）完全酸水解
-1称取20mg样品,加入2mL2mol·L的h2so4于安培管中沸水浴水解8h,水解液用
baco3中和至ph=7,离心,取上清夜置冰箱冷藏备测。（阿魏侧耳子实体多糖分离纯化及其化学结构的初步研究）
（2）部分酸水解
称取糖样70mg，80℃条件下，0.05m三氟乙酸水解2h。降至室温后，离心（4000r/min，10min），将沉淀干燥，留做gc分析。上清用无水乙醇除酸至中性(ph为6～7)，蒸馏水透析48h：将袋外透析液浓缩，真空干燥，留做gc分析；袋内液浓缩至5ml左右，加10倍体积无水乙醇，醇沉过夜，离心(4000r/min，10min)，沉淀常规干燥，作gc分析；上清浓缩，真空干燥，留做gc分析。
2、高效液相色谱
确定样品的单糖组成
色谱条件为:
色谱柱为shodexKs804sugar(300mm×7.8mm)
柱温40度
流动相为水
-1流速0.8mL·min
检测用410RⅠ示差检测器，数据处理用810gpc软件进行。
同时用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖、岩藻糖8种单糖进
行对照,根据峰值确定样品的单糖组成。
分子量的测定以标准分子量的葡聚糖pulluan作分子量测定标准。让其通过高压液相色谱柱,条件同上,先以分子量对数与对应的保留时间作标准曲线,从标准葡聚糖pulluan的工作曲线上可以求得该成分分子量。
例如：（阿魏侧耳子实体多糖分离纯化及其化学结构的初步研究）
将水解后的多糖样品pw2进行hpLc分析,结果如表所示:阿魏侧耳子实体多糖pw2经过酸水解后,得到2种单糖:葡萄糖和半乳糖,摩尔比例1.77∶1。
例如：
4经hpLc测定后对照标准曲线得多糖pw2的分子量为3.18×10。（阿魏侧耳子实体多糖
分离纯化及其化学结构的初步研究）
4、甲基化分析
(1)基本原理
先将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化，然后将多糖中的糖苷键进行完全酸水解，水解后得到的化合物，其羟基所在的位置，即为原来单糖残基的连接点。同时根据不同甲基化单糖的比例，可以推测出此种连接键型在多糖重复结构中所占的比例。
用此种方法得到的羟基及nabh4还原醛基后产生的羟基，经乙酰化可得到甲基化的糖醇乙酸酯(此产物易挥发，可进行gc分析)，再经gc与gc-ms分析，通过气相色谱的出峰顺序和对质谱谱图的主要离子碎片的分析便可以较准确地确定糖的连接键型。
反应通式如下
:
（2)甲基化反应
取充分干燥的多糖样品10mg，溶解在2.0ml的二甲基亚矾（Dmso)中。在n2保护下快速加入干燥的naoh粉50mg，用n2排出空气，加盖密封，室温反应1.0h并间歇振荡。在n2保护下缓慢滴加碘甲烷1.0ml，用n2排出空气，加盖密封，室温继续反应1.0h并间歇振荡，反应完成后加0.5ml水终止反应。反应液先用自来水流水透析48h，再用蒸馏水透析24h，透析液冷冻干燥得第一次甲基化样品。第一次甲基化样品继续甲基化，反应步骤同上，得第二次甲基化样品。如此重复甲基化三次。甲基化后的样品用红外光谱检测，3700
cm-1—3100cm-1，附近无羟基的特征吸收峰，表明甲基化反应完全。
（3)甲基化样品的衍生化
上述完全甲基化多糖样品加入2mol/1的三氟乙酸(TFA)3.0ml,120℃密闭水解2.0h。冷却后50℃减压蒸发干，加2.0ml甲醇再蒸发干，重复三次，最后蒸发干得完全甲基化多糖的水解产物。加蒸馏水2.0ml使其溶解，再加硼氢化钠25mg，振荡后室温还原反应2.0h。反应完后滴加0.1mol/1醋酸分解过量的硼氢化钠并调ph值至5.5~7.0弱酸性。反应液50℃减压蒸发蒸干，加2.0ml甲醇再蒸干，重复三次，最后蒸发干。
上述蒸发干样品加入1.0ml醋酸酐和1.0ml吡啶，封管后在沸水浴中反应1.0h。反应液50℃减压蒸发干，加2.0ml甲醇再蒸发干，重复三次，最后蒸发干。加入丙酮1.0ml，用0.45ul尼龙微孔滤膜过滤，取样进行gc/ms分析。
(4)衍生化样品的gc/ms分析
多糖样品经甲基化、水解、还原、乙酰化后得到甲基化糖醇乙酸酯，进行gc/ms联机分析，根据文献的相对保留时间和不同单糖的主要离子碎片(m/e），推断出多糖样品中糖基的连接方式及各种连接键型的比例。
本实验采用的条件为:gc(Variancp3800型)和ms（Variansatum2200型)气相一质谱联用仪，Db-5ms石英毛细管柱(30mx0.25mmx0.25um)程序升温，初温80℃，保持1min，以8℃/min升至210℃，保持1min，再以20℃/min升至260℃,保持1min氦气作载气，进样口温度250℃，分流比1:50，柱流速1.0ml/min电子电离源(eI源)70eV，倍增器电压350V，灯丝电流250uA，接口温度260℃,离子源温度180℃，质荷比(m/z)扫描范围30~450，扫描速率2.5scan/sec。（胞式层孔菌菌丝体多糖分离纯化、结构鉴定及其生物活性研究）
流程图如下：（mAep-2a-2b是安络小皮伞菌丝体多糖的某个过程中第某个样品）
篇二：1多糖含量检测
亿信检测推出单糖组成方案
简介：gc-ms（气相质谱联用技术测定单糖组成）
1多糖含量检测
方法：苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生
