请教：如何完美地回收用聚乙二醇浓缩的透析袋中的蛋白

化学纯是指满足一般生产或分析试验的试剂纯度,分析纯的纯度要比化学纯要高,一般应用于要求比较苛刻的场所,如医院用的试剂.

化学纯、分析纯、色谱纯,是指试剂的纯度级别,化学纯是指一般化学试验用的,有较少的杂质,不妨您的实验要求.分析纯是指做分析测定用的试剂,杂质更少,不妨碍分析测定.色谱纯是指进行色谱分析时使用的标准试剂,在色谱条件下只出现指定化合物的峰,不出现杂质峰.

对于化学纯,分析纯,优级纯,不同的药品要求不一样.

蛋白质浓缩用的聚乙二醇20000可以是分析纯的

如果是非药用仅供科研使用的蛋白质，在进行分离纯化或者浓缩等操作时使用的试剂都可以是分析纯的化学试剂。

这些试剂不会影响到蛋白质在科研方面的使用

按照其贮存状态来分： 试剂有已配好的即用型试剂和需要配制的试剂。

前者，如：一些性质较稳定的、或单剂量包装的试剂。像Western中的DAB显色试剂就有现成的可直接用。后者，如：大多数的药物、试剂。当然，要配制的占大部分。

按其用途来分，可分为：

药物：通常就是我们要考察其药效或机制的化合物或中草药提取物。又可分为原料药和制剂。原料药一般可直接应用。制剂有的要进行提取，有的可直接用。

动物模型用试剂：如：造糖尿病的STZ、造肝损伤的氨基半乳糖胺、四氯化碳、造睾丸损伤的镉剂、造成肺损伤的博来霉素、造成肾损伤的腺嘌呤、造成炎症的角叉菜胶等等。

动物模型用饲料：这个一般是固体状态。也有半固体的。液体状态的较少。如：高脂饲料中要配以胆固醇、丙基硫氧嘧啶、胆酸盐、鸡蛋黄、猪油等。

动物基本操作用试剂：如：麻醉用试剂、动物除毛的试剂硫化钠、动物标记的试剂***、取血或插管用的试剂肝素、消毒用的75％乙醇、碘伏、新洁尔灭、动物手术后护理的抗生素等。

各类缓冲液或基础分散介质：如：PBS、生理盐水、柠檬酸缓冲液、克氏液、任氏液、配难溶性药物用的0。5％CMC－Na液、DMSO液、增溶剂泊洛沙姆（与药物混匀后再加入溶剂中）

保存标本的试剂：如：10％福尔马林、中性福尔马林、4％多聚甲醛、Bouin's液等。

清洗液：如：稀盐酸液、重铬酸钾洗液。

检测试剂：这个因实验而异。不同的实验有不同的方法。可以另开专题讨论。

按其使用时限来分：

即配即用型：如：STZ极易分解，配制后要迅速全部用完，不然完全失效。一些酶类的试剂，配制后也要尽快用完。已配好的显色剂，通常也是较短时间内用完。对水不稳定的药物，如：青霉素。尽快用完。

可在一周内使用短效型：主要是一些亚稳定状态的溶液。可随温度、氧气的作用而逐渐分解而达不到使用的要求。如：蛋白电泳中的过硫酸铵，是一种促进氧自由基产生的辅助试剂，促进凝胶的形成，时间久了就不能产生自由基，故而一般在一周内使用，最多两周。有些缓冲液，尤其是做离体实验的，一般低温保存下尽快地用完。不然可影响实验结果。

一个月以内的中效型：许多试剂在配好后，如果能低温保存，能用一个月以上。

三个月以上的长效型：不少性质稳定，且对浓度准确度要求不是太高的溶液，可长期保存使用。像福尔马林、生理盐水、CMC－Na溶液。

按其纯度可分为：

化学纯:一般化学实验用的,含少量杂质.纯度一般应在98%以上.

分析纯:做分析实验用的,含微量杂质,纯度一般应在99%以上.缩写: A.R

色谱纯:液相流动相的要求.据本人理解应是不出现杂峰.纯度可能在99.9%.

生化纯:好像在一些生化试剂里有这么写的.缩写:B.R

要注意的是,有些厂家有标明 优级纯(G.R)的, 实际上,可认为相当于分析纯的级别.

还有就是级别最高的:标准品、对照品。其实这二者差别不大。我们通常混用这两个词。按药典规定，我们通常用的基准物质称为对照品。而抗生素类（注意，不是合成抗菌药）的基准物质则称为标准品。而事实上，我们似乎总是把“标准品”当作最高级别，而把‘对照品’当作一个比“标准品”低一点的级别。事实并非如此，这两个词应是一样的。只是标准品特指抗生素或其它生物制品。

特此将二者区分如下：

对照品、标准品系指用于鉴别、检查、含量测定的基准物质。

其中， 标准品特指用于生物检定、抗生素或生化试剂中含量或效价检定的基准物质，按效价单位计，与国际标准品标定。

如：青霉素的基准物质称为标准品，而氧氟沙星的基准物质则称为对照品。但在所发表的论文中，我们所看到的绝大部分情况是二者混用。称青霉素为对照品的、标准品的，都有。

那么这些基准物质要达到什么样的要求？我想，纯度至少要达到99.99%吧。生物制品或抗生素则不一定了，因为有的抗生素实际上就是混合物的。只能用效价来评定。

在配制标准品或对照品时，尤其注意要准确。通常，我们在称量10mg以下的物质时，是很难准的。因此，我们在配某些试剂时，可考虑先称10mg以上的物质配成较大的浓度，再逐步稀释，所得浓度要准确一些。

每一种试剂对不同级别的规定和要求是不同的.

我们可以看到论文中要标明试剂的纯度。通常有写到化学纯、分析纯、色谱纯、纯度达到多少？含标示物多少？等等。这需要在做实验之前了解我们所要用的试剂的纯度要求是怎样的。不然难以得到满意的结果。如：需要用色谱纯的试剂用了分析纯，可能会得到失败的实验结果。

动物实验中，用到分析纯及以上级别的比较多。做药动学实验，液相检测时要注意，要用色谱纯试剂，不然严重影响实验结果。

按其毒性，有无毒、低毒、中等毒性、剧毒几种。

要注意毒性试剂的保存，以及实验过程中自身的防护。

细胞色素C是一种细胞色素氧化酶，，是电子传递链中唯一的外周蛋白，位于线粒体内侧外膜。可以参照酶的提纯吧？

【实验操作】

1．细胞色素C的制备

⑴ 材料处理:

取新鲜或冰冻猪心，除去脂肪和韧带，用水洗去积血，将猪心切成小块，放入绞肉机绞碎。

⑵ 提取:

称取绞碎猪心肌肉500克，放人2000m1烧杯中，加蒸馏水1000ml，在电动搅拌器搅拌下以2M H2S04调pH至4.0(此时溶液呈暗紫色)，在室温下搅拌提取2小时，在提取过程，使抽提液的pH值保持在4.0左右。在即将提取完毕，停止搅拌之前，以1M NH40H调pH至6.0，停止搅拌。用八层普通纱布压挤过滤，收集滤液。滤渣加入750m1蒸馏水，再按上述条件提取1小时，两次提取液合并。

⑶ 中和:

用1M NH4OH调上述提取液至pH 7.2(此时，等电点接近7.2的一些杂蛋白溶解度小，从溶液中沉淀下来)，静置30～40分钟中后过滤，所得滤液准备通过人造沸石柱进行吸附。

⑷ 吸附与洗脱:

人造沸石容易吸附细胞色素C，吸附后能被25％的硫酸铵洗脱下来，利用此特性将细胞色素C与其它杂蛋白分开。具体操作如下：

①人造沸石的预处理：称取人造沸石11g，放入500m1烧杯中，加水搅拌，用倾泻法除去12秒钟内不下沉的过细颗粒。

② 装柱：选择一个底部带有滤膜的干净的玻璃柱(2.5×30cm)，柱下端连接一乳胶管，用夹子夹住，柱中加入蒸馏水至2/3体积，保持柱垂直，然后将己处理好的人造沸石带水装填人柱，注意一次装完，避免柱内出现气泡。

③ 上样：柱装好后，打开夹子放水(柱内沸石面上应保留一薄层水)将准备好的提取液装入下口瓶，使其通过人造沸石柱进行吸附。柱下端流出液的速度为1.0ml/分钟。随着细胞色素C的被吸附，柱内人造沸石逐渐由白色变为红色，流出液应为黄色或微红色。

④ 洗脱：吸附完毕，将红色人造沸石从柱内取出，放入500m1烧杯中，先用自来水，后用蒸馏水搅拌洗涤至水清，再用100m1 0.2％NaCl溶液分三次洗涤沸石，再用蒸馏水洗至水清，按第一次装柱方法将人造沸石重新装入柱内，用25％硫酸铵溶液洗脱，流速大约2ml/分钟，收集含有细胞色素C的红色洗脱液，当洗脱液红色开始消失时，即洗脱完毕。人造沸石可再生使用。

⑤ 人造沸石再生：将使用过的沸石，先用自来水洗去硫酸铵，再用0.25M氢氧化钠和lM氯化钠混合液洗涤至沸石成白色，前后用蒸馏水反复洗至pH7～8，即可重新使用。

⑸盐析：

为了进一步提纯细胞色素C，在上面收集的洗脱液中，加入固体硫酸铵(按每l00m1洗脱液加入20克固体硫酸铵的比例，使溶液硫酸铵的饱和度为45％)边加边搅拌，放置30分针后，杂蛋白便从溶液中沉淀析出，而细胞色素C仍留在溶液中，用滤纸(或离心)除去杂蛋白，即得红色透亮细胞色素C溶液。

(6) 三氯醋酸沉淀：

在搅拌情况向所得透亮溶液加入20％三氯醋酸(2.5m1三氯醋酸/100m1细胞色素C溶液)，细胞色素C立即沉淀出来（沉淀出来的细胞色素C属可逆变性)，立即于3000转/分钟离心15分钟，收集沉淀。加入少许蒸馏水，用玻棒搅拌，使沉淀溶解。

⑺ 透析：

将沉淀的细胞色素C溶解于少量的蒸馏水后，装入透析袋，在500m1烧杯中对蒸馏水进行透析除盐(电磁搅拌器搅拌)，15分钟换水—次，换水3至4次后；检查透析外液SO4是否已被除净。检查方法是：取2m1 BaCl2溶液于试管中，滴加2至3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示SO4未除净，反之，说明透析完全，将透析液过滤，即得细胞色素C制品。

2.含量测定

所得制品是还原型细胞色素C水溶液，在波长520nm处有最大吸收值，根据这一特性，用721型分光光度计，先作出一条标准细胞色素C浓度和对应的光密度值的标准曲线(图1)，然后根据测得的待测样品溶液的光密度值就可以由标准曲线的斜率求出待测样品的含量。具体操作如下：

⑴ 标准曲线的绘制：

取1毫升标准品(81mg/ml)，稀释至25ml，从中分别取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，分别置于五支试管中，每管补加蒸馏水至4m1，并加少许联二亚硫酸钠作还原剂，然后在520nm处测得各管的光密度，分别为0.179，0.330，0.520，0.700，0.870。以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线图，从图中求得斜率为l/3.71。

⑵ 样品测定

取1ml样品，稀释适当倍数，再加少许联二亚硫酸钠，在波长520nm处测定光密度。最后根据标准曲线的斜率计算其细胞色素C的含量。

扩展青霉(P. expansum ) PF868 所产脂肪酶通过硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素柱层析以及Sephacryl200 柱层析等步骤被纯化了74 倍, 最终比活力为69.7 u/m g.纯化后的脂肪酶经过SDS-聚丙烯酰胺电泳和微内径高效液相色谱仪检测分别达到了SDS-PAGE纯和微内径高效液相色谱纯. 分子量经SDS-PAGE确定为28.44 kD. 脂肪酶N-端氨基酸序列测定的结果是: ATADAAAFPD——这与其他一些真菌产的脂肪酶的序列具有较大的同源性.脂肪酶［ＥＣ３，１，１，３］广泛分布于动物、植物各种组织及微生物［１］中．近几年来，由于实验证明其在食品加工、有机合成、皮革脱脂以及洗涤剂应用等方面具有较大的潜力和开发前景，各国科研人员纷纷把目光投向脂肪酶的研究领域．我国对脂肪酶的研究主要集中于产酶菌种

1．1 试剂与仪器

试剂：环氧丙烷、氢氧化钠、异丙醇、丙酮、无水乙

醇、盐酸、硫酸铵、氯化钙等均为分析纯，壳聚糖(CTS，

D．D=92．7％1(南通兴成生化公司)．

仪器：pH DZ一2型笔型酸度计，721A型分光光度

计，170SX型傅立叶变换红外光谱仪(美国Nicolet公司1．

1．2 羟丙基壳聚糖(HPCTS)的合成

将定量的壳聚糖与异丙醇混和搅拌30 min，加入

50％的NaOH水溶液，碱化搅拌60 min，密封过夜．次

日，加入催化剂搅拌均匀，量取一定量环氧丙烷加入

搅拌中的反应器内，室温下反应60 min，然后在一定温

度下再反应一定时间．随后调pH至中性并分散于乙

醇／水溶液中，经不断搅拌和抽滤，用丙酮反复浸泡、洗

涤后得干燥产物，备用．

1_3 测试

分子质量【。21；取代度[13,141；红外表征：羟丙基壳聚糖

精制后将CTS及HPCTS分别与KBr混合压片，用傅

立叶变换红外光谱仪测定；溶解性：将0．5 g HPCTS溶

于20 mL蒸馏水中，搅拌一定时间，观察其在水中的

溶解情 ；吸湿保湿性能．【。61

2 结果与讨论

2．1 反司1．

1．2 羟丙基壳聚糖(HPCTS)的合成

将定量的壳聚糖与异丙醇混和搅拌30 min，加入

50％的NaOH水溶液，碱化搅拌60 min，密封过夜．次

日，加入催化剂搅拌均匀，量取一定量环氧丙烷加入

搅拌中的反应器内，室温下反应60 min，然后在一定温

度下再反应一定时间．随后调pH至中性并分散于乙

醇／水溶液中，经不断搅拌和抽滤，用丙酮反复浸泡、洗

涤后得干燥产物，备用．

1_3 测试

分子质量【。21；取代度[13,141；红外表征：羟丙基壳聚糖

精制后将CTS及HPCTS分别与KBr混合压片，用傅

立叶变换红外光谱仪测定；溶解性：将0．5 g HPCTS溶

于20 mL蒸馏水中，搅拌一定时间，观察其在水中的

溶解情 ；吸湿保湿性能．【。61

2 结果与讨论

2．1 反应条件对取代度的影响

2．1．1 温度

由表1看出，随着反应温度的提高，取代度Ds先

增大后减小．原因是反应温度越高，反应物之间的渗

透以及环氧丙烷与反应物活性基团间的碰撞越充分，

加快了反应速度，副反应也会发生，而且环氧丙烷的

沸点较低易挥发，温度过高对主反应不利，导致取代

度下降．所以反应温度取60℃为宜．

表1 反应温度对产物的影响

注：反应8 h，壳聚糖2 g，环氧丙烷20 mL，催化剂1 mL．

2．1，2 环氧丙烷用量

从表2可见，环氧丙烷用量增大，产物的取代度也

随之增大．原因是反应物量加大可以增大反应试剂向

壳聚糖内部扩散的速度，并且有足量的原料与壳聚糖

的活性基团发生反应，增加了反应试剂与壳聚糖分子

上活性基团的碰撞概率，使取代度提高．虽然可以通

过增加环氧丙烷的用量来提高产物的取代度，但在生

产时也应该考虑到成本问题，所以应根据最终的要求

与目的选择合适的用量，本实验选择环氧丙烷的用量

为20 mL．

表2 环氧丙烷用量对产物的影响

注：60℃反应8 h，壳聚糖2 g，催化剂1mL．

2．1．3 时间

由表3可知，反应时间越长，产物取代度越高，溶

解性能也越好．壳聚糖与环氧丙烷的反应是固液非均

相反应，反应初期是环氧丙烷的扩散、渗透以及碱壳

聚糖混合均匀的阶段，紧接着是环氧丙烷与壳聚糖的

反应基团进行反应，生成的产物从溶胀变为溶解拐外，

时间的延长使反应进行得更充分，碱壳聚糖将通过水

的作用扩散到各反应活性基团间与其发生反应．最

后，延长反应时间可使“扩散一反应一溶胀一溶解”的过

程反复进行，使反应更完全，取代度提高，产物的溶解

性能改善．因此，反应8 h已能得到水溶性的产物．

表3 反应时间对产物的影响

注：反应温度60℃，壳聚糖2 g，环氧丙烷2O mL，催化剂1 mL．

2．1．4 其他条件

异丙醇为溶剂进行碱化可确保碱水溶液均匀分

散，它是一种良好的分散剂．碱化过程中放出的热量

分散均匀，易于传递出来，减少了碱壳聚糖的水解逆

反应，得到更加均一的碱壳聚糖．另外，碱在醇中的溶

解度低于在水中的溶解度，可使较多的碱被壳聚糖吸

附．异丙醇还可提高反应活性，改善反应的均匀性．

壳聚糖与环氧丙烷的反应是非均相反应，但加入

相转移催化剂可增加环氧丙烷与壳聚糖的接触机会，

提高环氧丙烷的转化率，有利于反应的进行．

3 结论

利用环氧丙烷与壳聚糖反应，制备了有较好溶解

性能的壳聚糖衍生物．反应原料的增加及反应时问的

延长都有利于产物取代度的提高，而反应温度升高则

使得产物的取代度先增大后减小．产物与原料的fvrIR

红外光谱证明，改性后壳聚糖分子链上(主要在c _

OH上发生取代 1人了羟丙基基团．与原料CTS相比，

改性产物HPCTS有较好的溶解性和吸湿保湿性，且

随着取代度的增大而提高．水溶性壳聚糖及其衍生物

在纺织、食品、医药、日用化妆品等众多领域有着广

阔的应用前景．

1.每一项总活力除以总蛋白就是比活力。

2.按照总活力计算回收率。比如硫酸铵盐的就是10050/42000

3.盐析法利用的是盐溶效应，也就是蛋白在某种浓度的某种盐溶液下溶解度会达到该温度下的最低值。纤维素色谱法就是利用离子交换。