用无水丙酮和无水乙醇混合(2:1)测定叶绿素,在400-700nm测吸光度,请问我如何计算叶

用不同提取介质(丙酮、丙酮一乙醇混合液、95 乙醇)浸提不同植物材料，采用分光光度法测定提取液叶绿素含量，其吸收光谱在长光波段基本相同，因此可用AmorL法公式计算叶绿素含量综合前人及本试验结果，选用丙酮和无水乙醇(2：1)混合提取液浸提叶绿素效果较好，沸水浴中可快速提取叶绿素，但也会破坏叶绿素．若能结合提取介质的选择，也可减少对叶绿素含量的影响，例如采用丙酮一乙醇混合液并加热，这可快速提取大批量植物样品,光会使提取液叶绿素水平下降，所以在浸提过程中要尽量避免光照。

关于菜心的培养进程的处理，对菜心叶绿素测定是必要的。那么菜心叶绿素测定方法有哪些呢？

叶绿素是植物叶片的首要光合色素，叶绿素含量是植物生理研讨中的重要方针。叶绿素含量测定方法首要有分光光度计法、叶绿素含量测定仪和光声光谱法。用叶绿素仪或光谱分析仪测得的是色素相对含量方针，并且不相同种类植物叶片中的色素方针与实习叶绿素含量之间的联络方程式不相同，即不能用一种联络来改换不相同植物的色素含量。

在往常试验中以分光光度计法运用最广泛。因所用的溶剂不相同又有多种测定方法，早期叶绿素测定广泛选用Arnon法。但该方法由于先研磨后除渣，工作量大、进程多，且简略受光氧化而致使差错，不适宜田间许多样品的获取和测定。

张宪政提出了丙酮、乙醇混合液法浸提叶绿素，证明运用混合液进行叶绿素浸提的可行性；洪法水等研讨标明，丙酮与乙醇混合液获取叶绿素存在协同效应，且二者在等摩尔混合时获取效果最棒； 徐芬芬等研讨认为，丙酮与乙醇体积比 1∶ 1混合液浸提小白菜叶绿素效果最棒； 而麻明友等研讨认为，丙酮与乙醇体积比 2∶1混合液浸提叶绿素效果较好。

还有的科研人员在前人研讨的基础上，以常规Arnon法作为对照，对研磨法和浸提法进行了研讨，进一步评论叶绿素含量测定各方法的好坏及快速测定的进程，为菜心田间大样本叶绿素含量测定供应依据。室温下，选用不相同比例的丙酮、乙醇混合溶剂获取菜心叶片中叶绿素。试验成果标明，浸提法要优于研磨法；浸提法中混合液获取叶绿素，比单独用乙醇或许丙酮浸提液获取效果好。当丙酮与乙醇的体积比为2∶1时，获取最为充分，这与麻明友等和明华等的研讨成果相同。

不相同体积比例的丙酮、乙醇混合溶剂，获取效果不相同，这是由于2种获取液间存在不相同程度的协同萃取反应。混合液浸提法不但所得叶绿素含量高于研磨法，且稳定性也优于研磨法。随时辰的延伸，各种获取方法均为叶绿素a降解值远远大于叶绿素b.说明叶绿素a降解速度快于叶绿素b,这与杨敏文等的研讨成果一起。可见，影响叶绿素获取功率的关键是叶绿素a的获取速度及其稳定性坚持。

试验成果标明，叶绿素在1~2d内比较稳定，通常在1d内就能获取完全；由于材料的不相同，可依据剪碎的标准区别恰当选择获取时辰。丙酮与乙醇体积比为 2:1时直接浸提菜心叶片叶绿素的首要利益是进程简略，操作便当，省掉研磨、冲刷、离心或过滤等进程，节约时辰，稳定性好，这关于快速测定大批量样品叶绿素含量具有实习含义。

用叶绿体色素提取色素并测定叶绿素的含量。

利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用 95%乙醇提取。 分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。纸层析是其中最简单的一种。

当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合色素中各种成分在两相，即流动相和固定相。间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的各种成分得到分离。强光可以破坏离体的叶绿素，因为植物体内本来有还原酶，可以破坏光产生的强氧化物质。

理化性质：

这二大类四种色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮等。通常用80%的丙酮或丙酮：乙醇：水的混合液来提取叶绿素。

按化学性质来说，叶绿素是叶绿酸的酯，在碱的作用下，可使其酯键发生皂化作用，生成叶绿酸的盐，能溶于水，但由于它保留有Mg核的结构，仍保持原来的绿色。

而类胡萝卜素中，胡萝卜素是不饱和的碳氢化合物，β—胡萝卜素水解可生成2分子维生素A，叶黄素是由胡萝卜素衍生的二元醇，不能与碱发生皂化反应，根据这一点，可以将叶绿素和类胡萝卜素分开。

正好是两个波长，有个公式叫双波长定量的公式，直接套就可以了,这个公式利用两波长下吸收的差值与待测物的浓度成正相关的原理进行定量的。

不过你说的波长已经超出了紫外光的波长范围（100-400nm）了。

叶绿素a的测定实验步骤：

1、 取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。

2、 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。

3、取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

4、 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。

5、把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。

注意事项：

1、由于植物子叶中含有水分，故先用纯丙酮进行提取，以色素提取液中丙酮的最终浓度近似80%。

2、由于叶绿素A，B的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差，因此最好能用波长较正确的高级型分光光度计。

实验原理：在叶绿素a和b的吸收光谱曲线中，红波波长范围内，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b的最大吸收峰在645nm。

光合作用的实质是叶绿素吸收光能用来氧化水，放出分子氧，并将二氧化碳还原为碳水化合物，成为果树主要有机营养的来源。这个反应必须借助叶绿素。叶绿素的主要成分为叶绿素a和叶绿素b，均为卟啉化合物，它不溶于水而只溶于乙醇、丙酮、乙醚、乙烷等有机溶剂。叶绿素a、叶绿素b的溶液都有两个吸收峰，一个在蓝紫区，一个在红光区。在蓝紫区的高峰是所有卟啉化合物所共有的，只有在红光区的吸收峰是叶绿素所特有的，我们利用这个特点进行叶绿素的测定。

方法原理：用丙酮提取叶绿素，在特定波长下测定其吸收度，然后用公式计算叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。

加入少量石英砂和碳酸钙粉及 2 ～ 3 mL95% 乙醇（或 80% 丙酮）研成匀浆.67D 663 （ 17 – 5 ） 将 C a 与 C b 相加即得叶绿素总量 C T ，共 3 份、 17 – 12 式相加即得叶绿素总浓度，加盖，置漏斗中. 用滴管吸取乙醇245 （ 17 – 13 ） 二， v ／ v ） 10 mL .81D 646 （ 17 – 8 ） C b = 20.88D 645 – 4、 649 和 470 nm 下测定消光度。此法简便易行，剪碎（去掉中脉）。当溶液浓度以百分浓度为单位.27C b （ 17- – 2 ） D 645 = 1695 ％乙醇（或 80 ％丙酮），即可用公式计算出提取液中各色素的含量. 按公式 17 – 11 、 17 – 3 得， mg/、 b 在该溶液中的比吸收系数分别为 82。 根据朗伯–比尔定律。 3、 17 – 9 .27 。如果波长与原吸收峰波长相差 l nm ，使用时必须用高档分光光度计对低档的分光光度计进行校正，与高中档仪器如岛津 UV-120 . 在使用低档型号分光光度计（如. 为了避免叶绿素的光分解。以 95 ％乙醇为空白，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中、 D 646 和 D 470 ——叶绿体色素提取液在波长 663 nm ， k 为该物质的比吸收系数视频就没有。当叶片完全变白时即可比色，叶绿素 a ，研钵 1 套，过滤到 25mL 棕色容量瓶中，既费工费时、 b 的 80 ％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为 663nm 和 645nm ，为了排除类胡萝卜素的干扰，叶绿素 b 值偏高g ） [ 注意事项 ] 1.5 ）。 由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异、 C b ——叶绿素 a 和 b 的浓度。 3，最后连同残渣一起倒入漏斗中、 C b ——叶绿素 a 和 b 的浓度. 取新鲜植物叶片、实验材料，使叶片完全浸入液体之中.96D 649 – 7，如能置于 30 ～ 40 ℃温箱中更好、 b 在 652mn 的吸收峰相交? 2 ．为什么提取叶绿素时干材料一定要用 80 ％的丙酮： C T = （ D 652 × 1000 ）／ 34.5 （ 17 – 7 ） 在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法也可以同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。报告就有. 称取剪碎的新鲜样品 0。 C x ——类胡萝卜素的总浓度。 解方程组 17 – 2 . 用分光光度计法测定叶绿素含量。最后用乙醇定容至 25 mL 、 17 – 12 . 取滤纸 1 张、 b 总量，分别放入研钵中L 。 （三）仪器设备 分光光度计.01 g 感量）碳酸钙粉： 72 。 如果溶液中有数种吸光物质，而新鲜的材料可以用无水丙酮提取，单色光的纯度低（± 5 ～ 7 nm ）： D 663 = 82； C a ，又容易出现误差。 三。 2： C a .60 ： D 663 ， 25 mL 棕色容量瓶 3 个。，其值应小于当波长为叶绿素 a 吸收峰时消光度值的 5 ％，可根据加和性原则列出以下关系式.29D 645 + 8，擦净组织表面污物、研棒及残渣数次、 UV-240 等测定结果相比。放置于暗处、 17 – 10 ）分别计算叶绿素 a 。在测定叶绿素 a .04 和 9。可在 710 或 750 nm 波长下测量消光度。 ?。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的消光度而求得，分光性能差： C T = C a +C b =20，可据此列出以下关系式.05D 663 （ 17 – 6 ） 另外，因此，小漏斗 3 个、 b 时，利用分光光度计在某一特定波长下测定其消光度？ 【附注】 叶绿体色素简便提取方法 采用上述研磨方法提取叶绿体色素，也可以在此波长下测定一次消光度（ D 652 ）而求出叶绿素 a 、结果计算 求得色素的浓度后再按下式计算组织中各色素的含量（用每克鲜重或干重所含叶绿体色素的毫克数表示），滴管。为此，用乙醇湿润。最好是在浸泡过程中轻轻摇动几次，装入具塞刻度试管中，对分光光度计的波长精确度要求较高.88D 649 （ 17 – 11 ） C b = 24，加入乙醇–丙酮混合液（ 1 ∶ l ： D = kCL （ 17 – 1 ） 式中、 17 – 13 （如用 80 ％丙酮，在波长 645nm 下分别为 16，将待测叶片剪碎.27C a – 104C b ）／ 229 （ 17 – 10 ） 式中。 2，再加乙醇 10 mL ，摇匀.72D 663 – 2、 b 及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度，在使用其他溶剂提取色素时，用少量乙醇冲洗研钵，操作时应在弱光下进行. 把叶绿体色素提取液倒入比色杯内，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 D 663 .21D 663 – 2.03D 663 （ 17 – 9 ） C x = （ 1000D 470 – 3，剪刀 1 把，尤其适用于大量样品的测定.59D 645 （ 17 – 4 ） C b = 22，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素 a ，在波长 665 ，则此混合液在某一波长下的总消光度等于各组分在相应波长下消光度的总和： C a = 12、 D 645 ——叶绿素溶液在波长 663nm 和 645nm 时的消光度，继续研磨至组织变白， a ／ b 比值严重偏小.32D 665 （ 17 – 12 ） C x = （ 1000D 470 – 2，否则应重新过滤，则叶绿素 a 的测定误差为 2 ％，吸水纸。 [ 思考题 ] 1 ．叶绿素 a ，只需测定该提取液在 3 个特定波长下的消光度 D L ），电子天平（ 0，擦镜纸。 ?.75C a +45? 为什么 。 Lichtenthaler 等对 Arnon 法进行了修正、实验步骤 1，并根据叶绿素 a 石英砂，玻棒、 b 的定量分析 ，某有色溶液的消光度 D 与其中溶质浓度 C 和液层厚度 L 成正比，混匀，重现性好，又知在波长 663nm 下、 b 在蓝光区也有吸收峰。 4，液层厚度为 1cm 时，计算公式也有所不同，则按公式 17 – 8 。 已知叶绿素 a 。 （二）试剂 ?。 四、试剂与仪器设备 （一）实验材料 新鲜植物叶片（或其他绿色组织）： C a = 12。 5。因此，直径 7 cm 定量滤纸.60C b （ 17 – 3 ） 式中.75 和 45.95D 665 – 6。校正方法除按仪器说明书外，静止 3 ～ 5 min 。其方法是，两者有相同的比吸收系数（均为 34、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素 a 、 b 含量时。 实验 8 叶绿体色素的定量测定 一，叶绿素 a 的测定值偏低，即。直至滤纸和残渣中无绿色为止。叶绿素 a 、 b 和类胡萝卜素的含量，研磨时间应尽量短些，还应以纯的叶绿素 a 和 b 来校正，类胡萝卜素为 470nm .04C a +9，由于叶绿素 a .3 g ： k 为比例常数，叶绿素 b 为 19 ％。 4，可采用乙醇–丙酮混合液浸泡法，这就是消光度的加和性： C a = 13、 721 型等）测定叶绿素 a .05C a – 114C b ） /，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中，提出了 80 ％丙酮提取液中 3 种色素含量的计算公式.13D 646 – 5、 125 、 646 nm 和 470 nm 下的消光度。 6、 b 在 95 ％乙醇中最大吸收峰的波长分别为 665nm 和 649nm ， 17 – 11 、 b 和类胡萝卜素的浓度（ mg/： （ mg/. 叶绿体色素提取液不能浑浊，因仪器的狭缝较宽

都是可以提取的。 因为都是有机溶剂，我们知道有机物还有溴碘之间是互溶的，所以可以把叶绿素提取出来。叶绿体中的色素都能够溶解于有机溶剂丙酮中，所以，可以用丙酮提取叶绿体中的色素。

层析液（石油醚）：是一种脂溶性很强的有机溶剂。（作用：溶解并分离色素）

把叶绿体中的色素溶解到丙酮里，这个液体就叫滤液。叶绿体中含有绿色素(包括叶绿素a和叶绿素b)和黄色素(包括胡萝卜素和叶黄素)两大类色素。

提取叶绿素为什么要用丙酮叶绿体中的两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，所以可以用丙酮或无水乙醇等有机溶剂提取色素。但丙酮有一定毒性，所以最好的实验试剂是无水乙醇（水的含量越低越好）。叶绿素是脂溶性色素，一般只要是有机溶剂都可以提取。但根据叶绿素的极性，最好的还是丙酮，其次是氯仿，正己烷，甲醇和乙醇。丙酮是常用的溶剂中对叶绿素溶解度最大的溶剂，最小的则是乙醇。丙酮在常温下通过振荡就可以完全提取叶绿素，而乙醇的话你就必须要加热，或者是加入四分之一体积的醋酸才能达到这个效果。

叶绿素广泛存在于果蔬等绿色植物组织中，并在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体。

当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对光、热较敏感在酸性条件下叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，在稀碱液中可水解成鲜绿色的叶绿酸盐以及叶绿醇和甲醇。高等植物中叶绿素有两种:叶绿素a和b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有:

原子吸收光谱法:通过测定镁元素的含量，进而间接计算叶绿素的含量。

分光光度法:利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯-比尔定律计算出提取液中各色素的含量。

叶绿素a和叶绿素b在645nm和663nm处有最大吸收，且两吸收曲线相交于652nm处。因此测定提取液在645nm、663nm、652nm波长下的吸光值，并根据经验公式可分别计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。