国民淀粉n-creamer 46 制备微胶囊适合喷雾干燥吗

魔芋精粉可以做石油钻探业用的压裂剂

1,魔芋的用途及其市场前景

魔芋为天南星科，属多年生草本植物，具有喜湿、喜阴等特点，是山区的主要经济作物，对山区农民脱贫致富、发展地方经济具有十分重要的意义。魔芋的主要成分是葡甘聚糖，其水溶液具有高粘度、高膨胀、稳定性、乳化性、成膜性、胶凝性、悬浮性等特点，可广泛用于食品、医药、化工、造纸、石油等工业。魔芋中的葡甘聚糖对降低糖尿病人的血糖有较好的效果＊ 其分子量大、粘度高，能延缓葡萄糖的吸收，有效地降低餐后血糖。又因它吸水性强、含热量低，能增加饱腹感，又能降低体重，所以是糖尿病人和体胖减肥者的理想食品。魔芋中的纤维素有促进肠胃蠕动及润肠通便功能，能把肠道中的有毒物质迅速排除体外，从而有效地防止便秘；并对结肠癌、痔疮、静脉瘤有辅助治疗作用。此外，它还有减少体内胆固醇积累的作用，对于防治高血压、动脉硬化有重要意义，因此说魔芋是一种新型的、理想的营养保健品。魔芋在石油工业上可作钻井泥浆处理剂和压裂液注入剂；在纺织工业中可用作双面透印糊料及后处理柔软剂；在化工生产中可用作粘合剂以及化妆品、牙膏等产品的原辅料。魔芋制品的用途十分广泛，具有巨大的开发应用潜力，国际国内市场的需求正日益增大。

2、中国魔芋产业的兴起

中国历来就有种植魔芋的习惯，但在1985年以前的2加0多年的 时间里，我国魔芋资源一直处于以传统的魔芋豆腐供食和战乱充饥的利用伏况。1979年文革结束，全国蔬菜学者应中国农业出版社之约合编个中国蔬菜栽培学人“魔芋”章节的编写任务落实给西南农业大学的刘佩成教授。刘佩漠同时得到信息；日本在打听并收购“金河芋角”（魔芋干片）,双重的任务促使她亲自去四川宜宾市、屏山等县考察。随即向四人省领导汇报，作了发展魔芋的建议和呼吁，由于国际市场信息的趋动，引起了土产公司、外贸公司等的重视，相应的魔芋科研机构和学术活动也开展起来，并于1988年发起并召开了全国首届魔芋学术讨论会。1995年在西南农业大学召开了首届中日国际魔芋科技研讨会。这些科技活动对魔芋产业的兴起和发展起到了支撑和推动作用。特别是1985年国家科委农业处筛选并让四川省科委下题的“魔芋综合利用研究”项目，和航天工业部7317所研制出的MJJO-I型魔芋精粉机等在中国魔芋产业形成上起了突破性的作用，在随后的一、二年内以四川省为主就成立了魔芋精粉企业二十余家，魔芋烘烤技术和设备；逐渐形成土洋结合型，魔芋悬浮果肉饮料成为市场畅销产品，1986年魔芋种植面积仅四月l省就近 10万亩，全国约 20万亩，外销渠道基本打开，中国魔芋产业初步形成。

从80年代中期到90年代末十余年问，经过魔芋界企业、基地农一民和科技界一的努力，以市场为导向，中国魔芋产业坚持“立足国内，力争外销”的方针，除以芋片及精粉、微粉和纯化粉、魔芋食品外销 外，还在国内开发了医药、食品、饮料、印花糊料、钻探、石油开来等各方面的广泛应用。

3、国内外市场分析

从国内市场的需求来看，食品、医药、化工、石油、纺织等工业领域的开发潜力巨大。近十三亿人口的中国本身就是一个巨大的魔芋消费市场。1998年10月，魔芋协会在海南省把魔芋作为“无公害菜篮子新秀”推荐为全国菜篮子工程建设项目。一些魔芋食品厂家努力扩大深加工，生产出丰富多彩的魔芋系列食品，这些产品投放市场以来一直受广大消费者的青睐。

在凝胶食品业上，仅农贸市场的中国软式魔芋豆腐，每年在全国消费的魔芋精粉不下2千吨，且可用次级粉，日式的硬式凝胶食品，虽外观美好，但吸味力较差，且价贵，不合中国人口味，只要改进配方和工艺，降低售价，就可大规模在中国市场销售。

在凝冻食品方面，据统计我国2002年进口刺槐豆胶2000多吨，而每吨价格达3一亠万美元，卡拉胶每年则要进口 2万吨。我国食品卫生部门已考虑用魔芋胶来代替刺槐豆胶及卡拉胶，这样不仅能节约大量成不；而且可以改善凝冻食品的感观指针，提高其内在质量。

作为现代文明病的克星，魔芋将成为更多消费者的日常食品。而大部分的仿生食品的主要原料是魔芋精粉，仅四川省每年的仿生食品加工用料就达到1400多吨。而东部沿海及京津沪一些发达城市在午餐肉、果冻制品、饮料、果酱食品中添加魔芋精粉用来医疗保健的数量则高达数千吨以上。魔芋的这些医疗作用，已经引起了中国医学界的广泛重视，有望推广该食品作为提高国民素质的一项措施，其医疗领域商机无限。据专家估算，当前我国魔芋产业产值达10亿元左右，随着魔芋的不断开发利用，这一资料还将进一步扩大。

国际市场上；中日两国均为魔芋生产大国，而日本同时又是世界上魔芋消费量最大的国家，也是我国魔芋产品的主要出口国之一。据统计，当今日本每个家庭，每年消耗魔芋制品的开支约40O0多日元 门合八民币约300元）左右，日本厚生省对魔芋促进肠胃蠕动、帮助消化的保健功能非常重视，规定要在中小学生的配餐中加入适当的魔芋，以满足学生身体所需的膳食纤维。因日本人对魔芋食品有特别的嗜好；不仅每年从国外进口魔芋精粉用于制作魔芋食品，也直接进口魔芋食品。除日本外，港澳地区和东南亚国家也是主要的魔芋消费市场，其设费产品主要是日式魔芋食品和素食产品。欧美市场对魔芋精粉的需求日益增加，以葡甘聚糖作为纤维素来开发纤维食品已受到欧美食品加工企业的高度重视。美国 FMC公司成功地开发了用葡甘聚糖作为食品添加剂，这将促进魔芋产品在欧美市场的拓展。七 国内市场开发动向

基于魔芋葡甘聚糖的优秀理化性质，除了现在已开发利用于食品工业和添加剂辅料外，还可通过化学物理改性，使其用途拓宽。工业品上充分发挥魔芋产品是天然无污染原料这一优势，制成绿色产品，在化妆品、印花糊料、石油钻探业的压裂剂、卷烟粘合剂等方面，过去已经投产接纳，现在此基础上正进一步研究改进工艺、配方，从而降低成7工

我国魔芋制品在80年代开发的基础上，于21世纪初再一次兴起魔芋新产品的研究开发热，已运用高新科技进行研制，甚至提出使用“纳米技术”等。无污染魔芋涂料、魔芋地膜等现已研制成功，一些高科技含量的魔芋产品正在进一步的研究开发中。

20m年初，以“荆楚科学家首富”、武汉大学生命科学院教授张延堂为学科带头人的红杉EK生物产业研究院魔芋课题组，成功地以魔芋精粉为主要原料，运用现代生物技术研制出一种新型的减肥保健品，从而改写了中国减肥产品不及日本同类产品的历史。目前他们正筹备使这一成果产业化。湖北工学院魔芋课题组以魔芋精粉为原料，研制出魔芋葡甘低聚糖醛酸雨脂硫酸酯钠盐一类肝素，2002年6 ）j17 日通过了成果鉴定，专家认为达到国际领先水平。这种橙黄或淡黄色无定型粉末，通过药理学实验表明具有抗凝血、抗血栓的药效．功能。华中农业大学课题组则对魔芋进行改性后，研制出了一种新型的魔芋环保涂料，正与华升农资公司合作进行产业化开发。

2002年底武汉大学在魔芋深度开发上获得了重大突破，他们的魔芋研究课题组已成功地研制出一种速溶可食性包装膜，它透明易溶，可用于方便面、饼干等食品的包装，不仅可避免环境污染，还．可以食用；研制的全降解农用地膜，其强度与塑料地膜接近，且保温保温性比塑料更胜一筹，该成果属世界首创，处国内先进水平Z研制的魔芋甘露胶和纤维素等成果，也通过了成果鉴定。湖北化纤集团、武汉金丰公司日前与其签约，拟首期投入3＊多万元对这些成果进行转化利用；之后再进行产业化开发。

魔芋中的葡甘露聚精改性后，可生产一种新型的高分子絮凝剂， 它具有极强的絮凝力，可用于污水沉降和自来水净化，从而取代目前 常用的有副作用的氧化铝

不需要，我们的脸经过一夜的睡眠，会排出很多毒素，并且还有点油腻，这时候就要用洗面奶来清洁了。关于敏感肌需不需要使用洗面奶洗脸，其实也是要看季节以及自身情况的。如果你不仅是敏感肌还是油性皮肤，那么在炎热的夏季，早晨起来时脸部都是油油的，这样的情况下当然需要使用洗面奶了。夜晚也一样，脸部很爱出油，只用清水洗脸是无法彻底洗干净的。不过，敏感肌油皮的朋友在寒冷的季节，早晨就不需要洗脸了，否则可能会出现脱皮的情况。如果是敏感肌加上干性皮肤，平时脸上是不会有过多油脂的，前天晚上我们只要做好脸部清洁，第二天早上就不需要用洗面奶洗脸，只用温水进行清理就可以了。不过，如果你的皮肤状态没什么问题的话，敏感肌能减少用洗面奶的次数就尽量减少，毕竟肤质比较特殊，并且洗面奶是化学物质，使用过多还是有一定影响的。

洗面奶是护肤里的第一步，但是很多人由于肤质原因，并不能随意的使用洗面奶，毕竟一旦随便用之后过敏就很麻烦了，下面介绍敏感肌能用洗面奶吗？适合敏感肌用的洗面奶。

敏感肌能用洗面奶吗

敏感肌也可以用洗面奶，只是洁面多用打泡网。相信只有很少的仙女会用打泡网给洗面奶打泡。但其实基本上所有洗面奶都需要打泡使用的。

因为洗面奶里大多含有皂基，如果不充分打发，没有稀释的皂基会伤害到娇嫩的角质层，对于敏感肌的宝宝来说，可是会加剧敏感状态的。

适合敏感肌用的洗面奶

1、品名：迪蕾氨基酸洁面泡泡

规格：100ml

参考价格：￥66.00

性质极之温和，能彻底卸除妆容及清洁面部污垢，同时补充皮肤水份，润而不腻，适用皮肤于干性至成熟及敏感性皮肤，能够作为卸装用品及去除不洁杂质，是敏感性皮肤洁面的首选，保护皮肤面免受刺激，使皮肤更嫩滑。

2、品名：Cetaphil 丝塔芙温和洗面奶

规格：118ML

参考价格：￥100.00

今夏洗面奶类的热销品牌。价格适中量又足，使用方法极灵活，可用水洗或不用水洗，适合一般正常肤质,干性肌质,敏弱性肌肤,受损肌肤(雷射、果酸换肤...),异位性皮肤炎。 特殊湿润成分，即使严重干燥的皮肤，仍具有长效保湿作用。

3、品名：AVENE雅漾修护洁面乳

规格： 200ml

参考价格：￥165.00

可用于清洁和卸妆(脸、眼、颈部)，适合各类皮肤以及季节性敏感者，尤其对高度敏感、红血丝肌肤有非常温和的保护清洁效果。无泡沫，可轻松卸除彩妆及不洁物，适合敏感易刺激性肌肤卸妆。

敏感肌可以每天用洗面奶吗

不可以，敏感型肌肤一般角质层较薄，天天用洗面奶会使皮肤受到更多伤害。具体做法如下：

1、对一般敏感性皮肤的处理，首先是避免再刺激，尽量减少蒸脸、按摩、去角质等美容措施。

2、可选用针对敏感性皮肤设计的化妆品，其常含有维生素B5、羧甲基β-葡聚糖等。

3、由于皮肤比较干燥，可使用含有合适比例脂质的保湿产品。

4、对自觉症状严重、影响日常生活的患者，可口服抗组胺药物，外用非激素类抗炎药物以缓解症状。

敏感肌洗面奶如何选择

敏感肌BB在洗面奶选择中一定要首选温和的，尽量选择氨基酸类洗面奶和无泡洁面乳，不建议选择月桂醇硫酸钠月桂醇聚醚硫酸酯钠这些成分的洁面产品，不然皮肤就会越来越干燥，越来越容易泛红，最后越来越糟糕。

可以提炼肝素纳 。肝素钠 （Heparin Sodium ）肝素钠是粘多糖硫酸酯类抗凝血药。肝素钠是由猪或牛的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属粘多糖类物质。近年来研究证明肝素钠还有降血脂作用。药物功能1.治疗各种疾病并发的播散性血管内凝血早期。 2.预防动、静脉血栓和肺栓塞。 3.治疗动、静脉血栓和肺栓塞，缺血性脑卒中，不稳定型心绞痛（减轻症状、预防心肌梗塞），急性心肌梗塞（防止早期再梗塞和梗塞区延展，降低病死率）。 4.人工心肺、腹膜透析或血液透析时作为抗凝血药物。 5.作为溶血栓疗法的维持治疗。6.用于输血时预防血液凝固及血库保存鲜血等体外抗凝剂。

这款护肤品含有水、甘油、1，2-戊二醇、牛油果树果脂、十三烷醇偏苯三酸酯、聚二甲基硅氧烷、甘油硬脂酸酯、青刺果油、透明质酸钠、马齿苋提取物、β-葡聚糖、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、黄原胶、丁二醇、氨甲基丙醇。

多糖的提取和纯化多糖的提取和纯化

摘 要 本文较详细地介绍了多糖的提取和纯化方法，为多糖的研究和生产提供参考依据。

关键词 多糖；提取；纯化；活性炭

多糖（polysacharides，PS），又称多聚糖，是由10个以上的单糖通过苷键连接而成的，具有广泛生物活性的天然大分子化合物。它广泛分布于自然界高等植物、藻类、微生物（细菌和真菌）与动物体内。20世纪60年代以来，人们逐渐发现多糖具有复杂的、多方面的生物活性和功能[1]：(1)多糖可作为广谱免疫促进剂，具有免疫调节功能，能治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病，甚至能抗AIDS病毒[2]。如甘草多糖具有明显的抗病毒和抗肿瘤作用[10]，黑木耳多糖、银杏外种皮多糖和芦荟多糖可抗肿瘤和增强人体免疫功能[3-5]。(2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗辐射，增强免疫功能等生物学作用[6]，麦冬多糖具有降血糖及免疫增强作用[7-8]，动物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能[9]。(3)多糖能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用[10]，银杏外种皮粗多糖具有抗衰老、抗过敏、降血脂、止咳祛痰、减肥等功能[11]。

另外，多糖作为药物，其毒性极小，因而多糖的研究已引起人们极大的兴趣。

由于多糖具有的生物活性与其结构紧密相关，而多糖的结构又是相当复杂的，所以在这一领域的研究相对缓慢。但人们在多糖的分离提取与纯化方面已做出了不少工作。

1. 多糖的提取[12]

1.1 热水浸提法：

1.1.1多糖提取条件的优选

根据文献报道[13]：影响热水浸提多糖的因素主要有提取时间、提取次数、溶剂体积、浸提温度、pH值、醇析浓度和植物颗粒大小等。在试验前对上述多种因素利用正交实验法做出优选，才能选出最佳提取方案。

1.1.2其步骤为：原料→粉碎→脱脂→粗提（2－3次）→吸滤或离心→沉淀→洗涤→干燥

首先除去表面脂肪。原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1－3小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。温度控制在90－100℃，搅拌4－6小时，反复提取2－3次。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性则需要中和）。然后浓缩，再加入2－5倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥（若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时，可直接冷冻干燥）。干燥后可得粉末状的粗多糖。

1.2 微波辅助提取法：

其原理为利用不同极性的介质对微波能的不同吸收程度，使基体物质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使萃取物质从基体或体系中分离出来，进入到介电常数小，微波吸收能力较差的萃取剂中[14]。

由于微波能极大加速细胞壁的破裂，因而应用于中草药中有效成分的提取能极大加快提取速度，增加提取产率。而且由于其选择性好，提取后基体能保持良好的性状，提取液也较一般的提取方法澄清[15]。

聂金源等在柴胡多糖和黄酮化合物的提取[18]中对微波辅助提取法、超声辅助法和索氏提取法进行比较，发现微波辅助提取法所需时间最短（10min），多糖的提取率最高（28.46％）。

1.3 超声辅助法：

其原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取[16]。

超声波辅助法与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、无需加热等优点[17]。

1.4 索氏提取法：

将植物粉末置于索氏提取器中，加入石油醚，60℃-90℃条件下提取至无色（一般为6小时）。过滤，滤渣挥发干燥完溶媒后加入80%乙醇，再提取6小时，过滤，滤渣乙醇挥发干燥后加蒸馏水。回流提取2次，趁热过滤，滤液减压浓缩，再除蛋白，醇沉，除色素。60℃干燥，称重。

1.5 醇提法：

先后将90%和50%乙醇加入植物粉末中，振荡充分再抽滤。滤液中加入足量无水乙醇，至于4℃冰箱中过夜。减压抽滤，再除去色素，得多糖粗品，在60℃通风干燥箱中干燥，再置干燥皿中恒重保存。

醇提法方法简单，易于操作，但提取率较低，乙醇使用量大，不宜大规模提取使用。

1.6 其它方法：

多糖的提取方法还有稀碱液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等。但由于稀酸、稀碱条件下，易使多糖发生糖苷键的断裂，部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少，因而很多试验中避免采用稀碱液浸提法和稀酸液浸提法。

2. 多糖的纯化

2.1 多糖中杂质除去方法 粗多糖中往往混杂着蛋白质、色素、低聚糖等杂质，必须分别除去。

2.1.1 除蛋白质

采用醇沉或其它溶剂沉淀所获得的多糖，常混有较多的蛋白质，脱去蛋白质的方法有多种：如选择能使蛋白质沉淀而不使多糖沉淀的酚、三氯甲烷、鞣质等试剂来处理，但用酸性试剂宜短，温度宜低，以免多糖降解。常用的方法有[19]：

2.1.1.1 沙维积法（Sevag法）[20]：根据蛋白质在氯仿等有机溶剂变性而不溶与水的特点，将多糖水溶液、氯仿、戊醇（或正丁醇）之比调为25:5:1或25:4:1，混合物剧烈振摇20到30分钟，蛋白质与氯仿－戊醇（或正丁醇）生成凝胶物而分离，然后离心，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。此种方法较温和，在避免降解上有较好效果，但效率不高，如五味子多糖的提取实验中要重复处理达三十几次。并且每次除去蛋白质变性胶状物时，不可避免的溶有少量多糖，另外少量多糖与蛋白质结合的蛋白聚糖和糖蛋白，在处理时会沉淀下来，造成多糖的损失。如能配合加入一些蛋白质水解酶，再用Sevage法效果更佳。

2.1.1.2 三氟三氯乙烷法[21]：多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，低温下搅拌10min左右，离心得上面水层，水层继续用上述方法处理几次，即得无蛋白质的多糖溶液，此法效率高，但溶剂沸点较低，易挥发，不宜大量应用。

2.1.1.3 三氯醋酸法：在多糖水溶液中滴加5％－30％三氯醋酸，直至溶液不再继续混浊为止，在5－10℃放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖溶液。此法会引起某些多糖的降解。

Sevag法、三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法三种方法均不适合糖肽，因糖肽也会像蛋白质那样沉淀出来。对于对碱稳定的糖蛋白，在硼氢化钾存在下，用稀碱温和处理，可以把这种结合蛋白质分开[1]。

2.1.1.4 酶解法[22]：在样品溶液中加入蛋白质水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶等，使样品中的蛋白质降解。通常将其与Sevag法综合使用除蛋白质效果较好。

2.1.1.5 盐酸法[23]：取样品浓缩液，用2mol/L盐酸调节其PH至3，放置过夜，在3000r/min条件下离心，弃去沉淀，即脱去蛋白质。

另有李知敏[23]和叶将瑜[25]等人分别在植物多糖实验中证明：盐酸法、三氯乙酸法及Sevag法脱蛋白率分别为72.5％、46.1％和42.3％，多糖的损失率分别为15.1%、6.1％和14.3％。盐酸法脱蛋白率高，但多糖的损失率也较高三氯乙酸法较温和，但除蛋白效率不高；Sevag法的脱蛋白效果不及前两种。

2.1.1.6 其它方法：可以加入5%ZnSO4溶液和饱和Ba（OH）2溶液，振荡后离心去蛋白。此法除蛋白不够彻底，可结合Sevag法使用。还可在提取液中加入50%的TCA溶液至沉淀完全，在4000r/min的条件下离心10min，收集上清液，即为除蛋白液。还有人使用4:1的氯仿-乙醇溶液除蛋白，将混合液清摇，再静置，取上清液。此过程需重复多次方可除尽蛋白。

除去蛋白质的样品用紫外分光光度计检验，观察在280mm处是否有吸收，如果无吸收则表明蛋白质已经除尽[24]。

2.1.2 除色素

2.1.2.1活性炭（activated carbon）除色素[12]：活性炭属于非极性吸附剂，有着较强的吸附能力，特别适合于水溶性物质的分离。它的来源充足，价格便宜，上柱量大，适用于大量制备性分离。目前用于色谱分离的活性炭主要分为粉末状活性炭、颗粒状活性炭、锦纶活性炭三种。一般情况下，尽量避免用活性炭处理，因为活性炭会吸附多糖，造成多糖的损失。

2.1.2.2对于植物来源的多糖，可能含有酚型化合物而颜色较深，这类色素大多呈负性离子，不能用活性炭吸收剂脱色，可用弱碱性树脂DEAE纤维素或DuoliteA－7来吸附色素。

2.1.2.3若糖和色素时结合的，易被DEAE纤维素吸附，不能被水洗脱，这类色素可进行氧化脱色：以浓氨水或NaOH液调至PH8.0左右，50℃以下滴加H2O2至浅黄色，保温2小时。

2.1.2.4 依次用丙酮、无水乙醚和无水乙醇洗涤多糖，即可得到较为纯净的多糖。此法较为简单，便于操作，多糖损失也较小。

2.1.2.5 用4:1的氯仿-正丁醇除色素。操作简单，多糖有一定损失。

2.1.2.6发酵来源的多糖颜色一般较浅，色素含量较少，一般可不除色素。

2.1.2.7对于动物，微生物等提取得到的多糖也可根据不同情况按上述方法处理。

2.1.3 除低聚糖等小分子杂质

2.1.3.1采用逆向流水透析法。即准备好一桶蒸馏水，用一根导管将水通入透析袋的烧杯底部，另用一根导管将水引出，根据水量控制流速，使水缓慢流动48小时。这样得到的就是多糖的半精品。

2.1.3.2利用溶液浓度扩散效应，将分子量小的物质如无机盐、低聚糖等从透析袋渗透到袋外的蒸馏水中，不断换水即可保持浓度差，从而除尽小分子杂质。具体的做法是根据多糖溶液的体积截取相应长度的透析袋，用透析夹夹住一端，灌入多糖液，离液面2－3cm处夹紧透析袋，置于一大烧杯中，注入蒸馏水至完全浸没透析袋后，用磁力搅拌器慢速搅拌，每12小时换一次水，重复3－4次。

2.2 多糖的纯化方法 纯化是将多糖混合物分离为单一多糖的过程，纯化的方法主要有以下几种：

2.2.1 分部沉淀法 根据各种多糖在不同浓度的低级醇或丙酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同浓度下析出的沉淀，经反复溶解与沉淀后，直到测得的物理常数恒定（最常用的是比旋光度测定或电泳检查）。这种方法适合于分离各种溶解度相差较大的多糖。为了多糖的稳定，常在pH7进行，唯酸性多糖在pH7时－COOH是以－COO` 离子形式存在的，需在pH2－4进行分离，为了防止苷键水解，操作宜迅速。此外也可将多糖制成各种衍生物如甲醚化物、乙酰化物等，然后将多糖衍生物溶于醇中，最后加入乙醚等极性更小的溶剂进行分级沉淀分离。

2.2.2 盐析法 在天然产物的水提液中，加入无机盐，使其达到一定浓度或饱和，促使有效成分在水中溶解度降低沉淀析出，与其它水溶性较大的杂质分离。常做盐析的无机盐的有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。

2.2.3 季铵盐沉淀法 季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂，可与酸性糖形成不溶性沉淀，常用于酸性多糖的分离。通常季胺盐及其氢氧化物并不与中性多糖产生沉淀，但当溶液的PH增高或加入硼砂缓冲液使糖的酸度增高时，也会与中性多糖形成沉淀。常用的季铵盐有十六烷基三甲胺的溴化物（CTAB）及其氢氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide，CTA－OH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride，CP－OH）。CTAB或CP－OH的浓度一般为1％－10％（W/V）的多糖溶液中，酸性多糖可从中性多糖中沉淀出来，所以控制季铵盐的浓度也能分离各种不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小于9，而且不能有硼砂存在，否则中性多糖将会被沉淀出来。

2.2.4 柱层析：包括纤维素柱层析、纤维素阴离子交换柱层析、凝胶柱层析、亲和层析、高压液相层析和其它柱层析。如用活性炭及硅胶做载体的柱层来分离多糖；或用硼砂型的离子交换树脂分离中性多糖。

纤维素柱层析 纤维素柱层析对多糖的分离既有吸附色谱的性质，又具有分配色谱的性质，所用的洗脱剂是水和不同浓度乙醇的水溶液，流出柱的先后顺序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的最后出柱，与分级沉淀法正好相反。

纤维素阴离子交换柱层析 最常见的交换剂为DEAE－纤维素（硼酸型或碱型），洗脱剂可用不同浓度的碱溶液、硼砂溶液、盐溶液等。此方法目前最为常用。它一方面可纯化多糖，另一方面还适于分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖。

凝胶柱层析 凝胶柱层析可将多糖按分子大小和形状不同分离开来，常用的凝胶有葡聚糖凝胶（sephadex G）、琼脂糖凝胶（sepharose bio－gel A）、聚丙烯酰胺凝胶（bio－gel P）等，常用的洗脱剂是各种浓度的盐溶液及缓冲液，但它们的离子强度最好不低于0.02。出柱的顺序是大分子的先出柱，小分子的后出柱。由于糖分子与凝胶间的相互作用，洗脱液的体积与蛋白质的分离有很大的差别。在多糖分离时，通常是用孔隙小的凝胶如sephadex G－25、G－50等先脱去多糖中的无机盐及小分子化合物，然后再用孔隙大的凝胶sephadex G－200等进行分离。凝胶柱层析法不适合于粘多糖的分离。

亲和层析 用凝聚素（一般是蛋白质和糖蛋白）做亲和色谱来分离多糖。

高压液相层析

2.2.5 制备性区域电泳 分子大小、形状及所负电荷不同的多糖其在电场的作用下迁移速率是不同的，故可用电泳的方法将不同的多糖分开，电泳常用的载体是玻璃粉。具体操作是用水将玻璃粉拌成胶状、柱状，用电泳缓冲液（如0.05mol/L硼砂水溶液，PH9.3）平衡3天，将多糖加于柱上端，接通电源，上端为正极（多糖的电泳方向是向负极的），下端为负极，其单位厘米的电压为1.2－2V，电流30－35MA，电泳时间为5－12小时。电泳完毕后将玻璃粉载体推出柱外，分割后分别洗脱、检测。该方法分离效果较好，但只适合于实验室小规模使用，且电泳柱中必须有冷却夹层。

2.2.6 金属络合物法 常用的络合剂有费林溶液、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。

2.2.7 其它方法：纯化除采用上述方法外，还有超过滤法（多糖溶液通过各种已知的超过滤膜就能达到分离）、活性炭柱色谱。另据报道，国外多采用的LKB柱色谱系统，用比旋度、示差折射及紫外检测多糖，各组分的峰位自动记录，分离效果好且方便。

2.3 多糖纯度的鉴定

2.3.1超离心法 由于微粒在离心力场中移动的速度与微粒的密度、大小和形状有关，故当将多糖溶液进行密度梯度超离心时，如果是组分均一的多糖，则应呈现单峰。具体的做法是将多糖样品用0.1molNaCl或0.1molTris盐缓冲溶液配制成1％－5％的溶液，然后进行密度超离心，待转速达到恒定后（通常是60000r/min），采用间隔照明的方法检测其是否为单峰。

2.3.2高压电泳法 由于中性多糖导电性差、分子量大、在电场中的移动速度慢，故常将其制成硼酸络合物进行高压电泳。多糖的组成不同、分子量不同，其与硼酸形成的络合物就不同，在电场作用下的相对迁移率也会不同，故可用高压电泳的方法测定多糖的纯度。通常高压电泳所用的支持体是玻璃纤维纸、纯丝绸布、聚丙酰铵凝胶、纤维素醋酸酯薄膜等。缓冲液是PH9.3－12的0.03－0.1mol的硼砂溶液，电压强度约为30－50V/cm，时间是30－120min。由于电泳时会产生大量的热，所以要有冷却系统，将温度维持在0℃左右，否则会烧掉支持体。一般单糖、低聚糖因醛基而发生的颜色反应在多糖上不明显，电泳后常用的显色剂是p－茴香胺硫酸溶液（p－anisidine）和过碘酸希夫试剂等。

2.3.3凝胶柱层析 常用的凝胶是Sephadex、Sepharose、Sephacryl，展开剂为0.02－0.2molNaCl溶液或0.04mol吡啶与0.02醋酸1：1的缓冲溶液，柱高和柱直径之比大于40。

2.3.4旋光测定法 在多糖水溶液中加入乙醇使其浓度为10％左右，离心得沉淀。上清液再加入乙醇使其浓度为20％－25％，离心所得二次沉淀，比较二次沉淀的比旋度。如果比旋度相同则为纯品，否则为混合物。

2.3.5其它方法：官能团摩尔比恒定法，即如为纯品两次分离所得产物的官能团如－COOH、－NH2、－SO3H、－CHO等摩尔比应该恒定。类似的方法还有示查折射法、HPLC法等。此外德国常用高压液相法来检测多糖纯度，结果可靠。

必须注意的是：纯度检查一般要求有上述两种方法以上的结果才能肯定。

要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁。在本世纪前期是采用分离机械法。即将叶肉细胞，愈伤组织和液体悬浮培养细胞置于高渗的糖溶液中，使之质壁分离，原生质体收缩成球形。然后用剪刀剪碎组织，就可切开细胞壁获得少量完整的原生质体。不过这种方法分离的原生质体太少，而且只能适于部分组织，Cocking发明的酶解法，开创了大量分离原生质体的新技术，所以目前普遍采用酶分离法来获得原生质体。一、植物材料一般来说，植物各个器官，如：根、茎卅、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。1．细胞悬浮培养物在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织。即取用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在26℃黑暗条件下，在含2，4－ D 2～4mg/L的 MS固体培养基上，诱导愈伤组织，每隔2～4d转接一次。从中选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到液体培养基的100ml三角瓶中进行悬浮培养。具体方法是用旋转式振荡器，速度控制在80～? 120r/min，在 25±1℃下暗培养。悬浮培养初期应每隔3d继代一次，一个半月后，吸取4～5ml悬浮细胞转到250ml三角瓶的40rnl新鲜培养中，以后每隔7d继代一次。通常经悬浮培养3～4月后，悬浮培养细胞的大小变得较为一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生质体。2．叶肉细胞叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料，用叶片的薄壁组织作为材料来源，既要考虑植株的生长环境，又要考虑叶片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。取生理状态适宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。要获得良好的培养? 材料，下列外界因素是考虑的重要因子：（1）光强为3000～6000lx。（2）温度为20～25℃培养。（3）相对湿度在60％～80％左右。植物的其他器官也可用于分离原生质体，如用花粉四分体和花粉壁细胞。? 3．植物材料的预处理对原生质体材料进行预处理能提高原生质体的分裂频率；也可以逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。这些处理包括：暗处理。预培养、低温处理等。把豌豆的枝条取下后，在分离原生质体前，先让材料在黑暗中的一定湿度条件下放1～2d，这样得到的原生质体存活率高，并能继续分裂；在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中，先去掉叶片的下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，然后再去壁。经预培养的叶片分离的原生质体高度液泡化，叶绿体也解体；龙胆试管苗的叶片只有用4CC低温处理后分离得到的原生质体才能分裂。在很多情况下材料不必经过专门的预处理。二、酶1．酶的种类构成植物细胞壁的三个主要成分是：①纤维素，占细胞壁干重的25 ％至50％不等；②半纤维素，平均约占细胞壁干重的53％左右；③果胶质，一般占细胞壁的5％。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，主要含有纤维素酶C；，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用，还含纤维素酶CX，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素，另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，总体作用是降解纤维素，得到裸露的原生质体。果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果胶质降解，把细胞从组织内分离出来。半纤维素酶制剂可以降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。此外，还有蜗牛酶，主要用于花粉母细胞和四分体细胞。ZA3～867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的复合物，含有纤维素酶（包括C1、CX、B一葡萄糖苷酶等），果胶质，半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较好。这种复合酶使用时不需加半纤维素酶和果胶酶等，就可以分离出植物原生质体。日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用，可先用果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶处理降解细胞壁。即二步法降解。2．渗透稳定剂植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。渗透压大些有利于原生质体的稳定，但也有可能阻碍原生质体的分裂。因此，在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。常用的两种系统为：①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0．40～0．80mol／L。本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；②盐溶液系统：包括 KCL、MgSO4和 KH2PO4等。其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，它可提高原生质体的稳定性。这种物质可使RNA酶不活化，并使离子稳定。3．酶溶液的pH值酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影响很大。用菜豆叶片作培养材料时，发现原始pH值为5．0时，原生质体产生一得很快，但损坏较严重，并且培养后大量破裂。当PH值提高到6．0时，最初原生质体却产生少，但与pH值为5．0时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。原始pH值提高到7．0时生活的原生质体数量进一步增加，损伤的原生质体也少得多。三、原生质体的分离分离原生质体时，首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁的纤维素上去，因此，一般先将材料分离成单细胞，然后分解细胞壁。采用将酶液减压渗入组织，或将组织切成薄片等方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。酶处理目前常用的多是“一步法”，即把一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体。植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。每克材料用酶液10～30ml不等。由于不同材料的生理特点不同，在研究游离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞，找出适宜的渗透浓度。例如，游离小麦是浮细胞的原生质体的酶液中须加入0．55mol/L甘露醇，游离水稻悬浮细胞的原生质体的酶液中只加 0．4～0．45mol／L的甘露醇，两者差别较大。酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。但是，时间过长对原生质体有害，所以一般不应超过24h。酶解温度要从原生质体和酶的活性两方面考虑。对于这几种酶来说，最佳处理温度在40～50℃，但这个温度对植物细胞来说太高，所以一般都在25℃ 左右进行酶解。若用叶片作为材料，取已展开的生活叶片，用0.53％次氨酸钠和70％酒精进行表面灭菌，然后切成2cm见方。把 4g叶组织置于含有 200ml不加蔗糖和琼脂的培养基 500ml三角瓶中。在 4℃黑暗条件下培养16～24h，以后叶片转入含有纤维素酶、果胶酶、无机盐和缓冲液的混合液中，pH值为5．6，通常在酶液中使用的等渗剂为0．55～0．6mol甘露醇。然后，酶液真空渗入叶片组织。在28℃条件下，每分钟40转的旋转式转床上培养4h后，叶片组织可完全分离。若用悬浮培养细胞，可不经过果胶酶处理，因为悬浮细胞液主要由单细胞和小细胞团组成。取悬浮细胞放入10ml的酶液中（3％纤维素酶，14％蔗糖，pH值5．0～6．0），在25～33℃条件下酶解24h。原生质体一酶混合液用30um的尼龙网过滤，通过低速离心收集原生质体。四、影响原生质体分离的因素1．酶制剂活力和纯度粗制的商品酶含有核酸酶和蛋白酶等杂质，它们对原生质体的活力是有害的。因此，在使用之前须将这些酶纯化，一般利用凝胶柱使酶制剂脱盐纯化。酶的活性还与pH值有关。Onoznka纤维素酶R－10和离析酶R一10的最适宜pH值分别为5～6和4～5。不过实际上酶溶液的pH值经常调节4．7～6．0之间。2．渗透稳定剂的作用在分离原生质体时，渗透稳定剂有保护原生质体结构及其活力的作用。糖溶液系统可使分离的原生质体能再生细胞壁，并使之能继续分裂，其缺点是有抑制某些多糖降解酶的作用。盐溶液系作渗透稳定剂时对材料要求较严格，且使原生质体稳定，使某些酶有较大活性。但是易使原生质体形成假壁，同时使分裂后细胞是分散的。五、原生质体的净化和活力测定在分离的原生质体中，常常混杂有亚细胞碎片，维管束成分，未解离细胞，破碎的原生质体以及微生物等。这些混杂物的存在会对原生质体产生不良影响。此外，还需去掉酶溶液。以净化原生质体。原生质体纯化常用过滤和离心相结合的方法，步骤大致如下：1．将原生质体混合液经筛孔大小为40－100um的滤网过滤，以除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集滤液。2．将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等仍悬浮在上清液中为准，一般以500r／min离心15min。用吸管谨慎地吸会上清液。3．将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中（除不含酶外，其他成分和酶液相同），再次离心，去上清液，如此重复三次。4．用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密度进行培养。一般原生质体的培养密度为104～106／ml。在原生质体培养前，常常先对原生质体的活性进行检测。测定原生质体活性有多种方法，如观察胞质环流、活性染料染色、荧光素双醋酸酯（FDA）染色等。这些方法各有特点，但现在一般用的是FDA染色法。FDA本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质体膜。一旦进入原生质体后，由于受到脂酶分解而产生有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出太原生质体膜，因此有活力的细胞便产生荣光，而无活力的原生质体不能分解FDA，因此无荧光产生。FDA染色测活性的方法如下：取洗涤过的原生质体悬浮液 0．5ml，置于10×100mm的小试管中，加入 FDA溶液使其最终浓度为 0．01％，混匀、置于室温5min后用荧光显微镜观察。激发光滤光片用QB24，压制滤光片用JB8。发绿色荧光的原生质体为有活力的，不产生荣光的为无活力的。由于叶绿素的关系，叶肉原生质发黄绿色荧光的为有活力的，发红色荧光的为无活力的。

参考资料： 百度

今天我们都知道植物体是由细胞构成的，但这一结论的得出并非那么容易。340多年前，英国皇家科学学会的Robert Hooke 用荷兰人Leeuwenhoek发明制作的显微镜观察了一小片软木，看到软木是由许多蜂窝状的小格子组成，Hooke将每一个格子称作“细胞”。1838年德国植物学家Matthias Schleiden才提出，所有植物体都是由细胞构成的。组成植物体的细胞的形状和大小是各不相同的，其不同部位的细胞，形状和大小与它们行使的功能密切相关。大多数高等植物细胞的直径通常约在10-200微米之间。性状有多面体、棱柱体、圆筒形、纺锤形、砖形、圆球形、甚至星形等。植物细胞的形状大小尽管多种多样，但基本结构是一样的。例如一切活细胞都含有原生质和其外面的细胞壁。坚硬的细胞壁保护着原生质体，并且维持着细胞的一定形状，其主要成分是纤维素。细胞壁是植物细胞独有的，动物细胞没有细胞壁。植物细胞还含有质体，是植物细胞生产和储存营养物质的场所。最常见的质体是叶绿体，它是专门进行光合作用的细胞器。动物细胞中不含有质体。大多数植物细胞都含有一个或几个液泡，液泡中充满了液体。液泡的主要作用是转运和储藏养分、水分和代谢副产物或代谢废物，即具有仓库和中转站的作用。除此外，植物细胞中还有线粒体、内质网、高尔基体、核糖体、圆球体、溶酶体、微管、微丝等细胞器。植物细胞中最重要的部分要数细胞核了，在光学显微镜下，细胞核可明显地分为核膜、核仁和核质三部分。核是遗传物质主要分布中心，同时也是遗传与代谢的控制中心。

2------------------------------------------------------------------------------------------------------

细胞壁分为3个部分：

1.胞间层。

2.初生壁。

3.次生壁。

3 -------------------------------------------------------------------------------------------------------

液泡(vacuole)

幼小的植物细胞(分生组织细胞)，具有许多小而分散的液泡，在电子显微镜下才能看到。以后随着细胞的生长，液泡也长大，互相并合，最后在细胞中央形成一个大的中央液泡，它可占据细胞体积的90％以上。

4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

关于去掉植物细胞壁的纤维素酶和果胶酶的试剂.

要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁。在本世纪前期是采用分离机械法。即将叶肉细胞，愈伤组织和液体悬浮培养细胞置于高渗的糖溶液中，使之质壁分离，原生质体收缩成球形。然后用剪刀剪碎组织，就可切开细胞壁获得少量完整的原生质体。不过这种方法分离的原生质体太少，而且只能适于部分组织，Cocking发明的酶解法，开创了大量分离原生质体的新技术，所以目前普遍采用酶分离法来获得原生质体。

一、植物材料

一般来说，植物各个器官，如：根、茎卅、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。

1．细胞悬浮培养物

在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织。即取用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在26℃黑暗条件下，在含2，4－ D 2～4mg/L的 MS固体培养基上，诱导愈伤组织，每隔2～4d转接一次。从中选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到液体培养基的100ml三角瓶中进行悬浮培养。具体方法是用旋转式振荡器，速度控制在80～? 120r/min，在 25±1℃下暗培养。悬浮培养初期应每隔3d继代一次，一个半月后，吸取4～5ml悬浮细胞转到250ml三角瓶的40rnl新鲜培养中，以后每隔7d继代一次。通常经悬浮培养3～4月后，悬浮培养细胞的大小变得较为一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生质体。

2．叶肉细胞

叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料，用叶片的薄壁组织作为材料来源，既要考虑植株的生长环境，又要考虑叶片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。取生理状态适宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。要获得良好的培养? 材料，下列外界因素是考虑的重要因子：

（1）光强为3000～6000lx。

（2）温度为20～25℃培养。

（3）相对湿度在60％～80％左右。

植物的其他器官也可用于分离原生质体，如用花粉四分体和花粉壁细胞。?

3．植物材料的预处理

对原生质体材料进行预处理能提高原生质体的分裂频率；也可以逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。这些处理包括：暗处理。预培养、低温处理等。把豌豆的枝条取下后，在分离原生质体前，先让材料在黑暗中的一定湿度条件下放1～2d，这样得到的原生质体存活率高，并能继续分裂；在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中，先去掉叶片的下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，然后再去壁。经预培养的叶片分离的原生质体高度液泡化，叶绿体也解体；龙胆试管苗的叶片只有用4CC低温处理后分离得到的原生质体才能分裂。在很多情况下材料不必经过专门的预处理。

二、酶

1．酶的种类

构成植物细胞壁的三个主要成分是：①纤维素，占细胞壁干重的25 ％至50％不等；②半纤维素，平均约占细胞壁干重的53％左右；③果胶质，一般占细胞壁的5％。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。

纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，主要含有纤维素酶C；，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用，还含纤维素酶CX，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素，另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，总体作用是降解纤维素，得到裸露的原生质体。

果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果胶质降解，把细胞从组织内分离出来。半纤维素酶制剂可以降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。此外，还有蜗牛酶，主要用于花粉母细胞和四分体细胞。

ZA3～867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的复合物，含有纤维素酶（包括C1、CX、B一葡萄糖苷酶等），果胶质，半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较好。这种复合酶使用时不需加半纤维素酶和果胶酶等，就可以分离出植物原生质体。

日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用，可先用果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶处理降解细胞壁。即二步法降解。

2．渗透稳定剂

植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。渗透压大些有利于原生质体的稳定，但也有可能阻碍原生质体的分裂。

因此，在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。常用的两种系统为：①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0．40～0．80mol／L。本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；②盐溶液系统：包括 KCL、MgSO4和 KH2PO4等。其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。

此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，它可提高原生质体的稳定性。这种物质可使RNA酶不活化，并使离子稳定。

3．酶溶液的pH值

酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影响很大。用菜豆叶片作培养材料时，发现原始pH值为5．0时，原生质体产生一得很快，但损坏较严重，并且培养后大量破裂。当PH值提高到6．0时，最初原生质体却产生少，但与pH值为5．0时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。原始pH值提高到7．0时生活的原生质体数量进一步增加，损伤的原生质体也少得多。

三、原生质体的分离

分离原生质体时，首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁的纤维素上去，因此，一般先将材料分离成单细胞，然后分解细胞壁。采用将酶液减压渗入组织，或将组织切成薄片等方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。

酶处理目前常用的多是“一步法”，即把一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体。

植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。每克材料用酶液10～30ml不等。

由于不同材料的生理特点不同，在研究游离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞，找出适宜的渗透浓度。例如，游离小麦是浮细胞的原生质体的酶液中须加入0．55mol/L甘露醇，游离水稻悬浮细胞的原生质体的酶液中只加 0．4～0．45mol／L的甘露醇，两者差别较大。

酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。

对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。

酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。但是，时间过长对原生质体有害，所以一般不应超过24h。酶解温度要从原生质体和酶的活性两方面考虑。对于这几种酶来说，最佳处理温度在40～50℃，但这个温度对植物细胞来说太高，所以一般都在25℃ 左右进行酶解。

若用叶片作为材料，取已展开的生活叶片，用0.53％次氨酸钠和70％酒精进行表面灭菌，然后切成2cm见方。把 4g叶组织置于含有 200ml不加蔗糖和琼脂的培养基 500ml三角瓶中。在 4℃黑暗条件下培养16～24h，以后叶片转入含有纤维素酶、果胶酶、无机盐和缓冲液的混合液中，pH值为5．6，通常在酶液中使用的等渗剂为0．55～0．6mol甘露醇。然后，酶液真空渗入叶片组织。在28℃条件下，每分钟40转的旋转式转床上培养4h后，叶片组织可完全分离。

若用悬浮培养细胞，可不经过果胶酶处理，因为悬浮细胞液主要由单细胞和小细胞团组成。取悬浮细胞放入10ml的酶液中（3％纤维素酶，14％蔗糖，pH值5．0～6．0），在25～33℃条件下酶解24h。原生质体一酶混合液用30um的尼龙网过滤，通过低速离心收集原生质体。

四、影响原生质体分离的因素

1．酶制剂活力和纯度

粗制的商品酶含有核酸酶和蛋白酶等杂质，它们对原生质体的活力是有害的。因此，在使用之前须将这些酶纯化，一般利用凝胶柱使酶制剂脱盐纯化。酶的活性还与pH值有关。Onoznka纤维素酶R－10和离析酶R一10的最适宜pH值分别为5～6和4～5。不过实际上酶溶液的pH值经常调节4．7～6．0之间。

2．渗透稳定剂的作用

在分离原生质体时，渗透稳定剂有保护原生质体结构及其活力的作用。糖溶液系统可使分离的原生质体能再生细胞壁，并使之能继续分裂，其缺点是有抑制某些多糖降解酶的作用。盐溶液系作渗透稳定剂时对材料要求较严格，且使原生质体稳定，使某些酶有较大活性。但是易使原生质体形成假壁，同时使分裂后细胞是分散的。

五、原生质体的净化和活力测定

在分离的原生质体中，常常混杂有亚细胞碎片，维管束成分，未解离细胞，破碎的原生质体以及微生物等。这些混杂物的存在会对原生质体产生不良影响。此外，还需去掉酶溶液。以净化原生质体。

原生质体纯化常用过滤和离心相结合的方法，步骤大致如下：

1．将原生质体混合液经筛孔大小为40－100um的滤网过滤，以除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集滤液。

2．将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等仍悬浮在上清液中为准，一般以500r／min离心15min。用吸管谨慎地吸会上清液。

3．将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中（除不含酶外，其他成分和酶液相同），再次离心，去上清液，如此重复三次。

4．用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密度进行培养。一般原生质体的培养密度为104～106／ml。

在原生质体培养前，常常先对原生质体的活性进行检测。测定原生质体活性有多种方法，如观察胞质环流、活性染料染色、荧光素双醋酸酯（FDA）染色等。这些方法各有特点，但现在一般用的是FDA染色法。FDA本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质体膜。一旦进入原生质体后，由于受到脂酶分解而产生有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出太原生质体膜，因此有活力的细胞便产生荣光，而无活力的原生质体不能分解FDA，因此无荧光产生。FDA染色测活性的方法如下：

取洗涤过的原生质体悬浮液 0．5ml，置于10×100mm的小试管中，加入 FDA溶液使其最终浓度为 0．01％，混匀、置于室温5min后用荧光显微镜观察。激发光滤光片用QB24，压制滤光片用JB8。发绿色荧光的原生质体为有活力的，不产生荣光的为无活力的。由于叶绿素的关系，叶肉原生质发黄绿色荧光的为有活力的，发红色荧光的为无活力的。